مقالة منهجية

نموذج في المختبر لدراسة الاستجابات المناعية لخلايا الدم المحيطي البشرية أحادية النواة لعدوى الفيروس المخلوي التنفسي البشري

7.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50766

⸱

ديسمبر 10, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Radboud university medical center

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن يسبب الفيروس المخلوي التنفسي البشري (HRSV) التهاب القصيبات الحاد عند الرضع الصغار. يحدث جزء من التسبب في مرض HRSV الحاد بسبب الاستجابة المناعية للمضيف. يوفر تحفيز الخلايا المناعية البشرية الأولية باستخدام HRSV نظاما نموذجيا سريعا وقابلا للتكرار لدراسة تنشيط المسارات الالتهابية والعدوى.

الملخص

تمثل عدوى الفيروس المخلوي التنفسي البشري (HRSV) مجموعة واسعة من شدة المرض ، بدءا من الالتهابات الخفيفة إلى التهاب القصيبات الذي يهدد الحياة. جزء مهم من التسبب في المرض الشديد هو الاستجابة المناعية المعززة التي تؤدي إلى علم الأمراض المناعية.

هنا ، نصف بروتوكولا يستخدم للتحقيق في الاستجابة المناعية للخلايا المناعية البشرية لعدوى HRSV. أولا ، نصف الطرق المستخدمة لزراعة وتنقية وقياس HRSV. بعد ذلك ، نصف نموذجا بشريا في المختبر يتم فيه تحفيز خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) باستخدام HRSV الحي. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لدراسة العديد من المعلمات التي قد تساهم في شدة المرض ، بما في ذلك الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية. يمكن قياس هذه الاستجابات على مستوى النسخ والترجمة. علاوة على ذلك ، يمكن بسهولة قياس العدوى الفيروسية للخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. مجتمعة ، يوفر تحفيز PBMC باستخدام HRSV الحي نظاما نموذجيا سريعا وقابلا للتكرار لفحص الآليات المشاركة في المرض الناجم عن HRSV.

المقدمة

الفيروس المخلوي التنفسي البشري (HRSV) هو السبب الأكثر شيوعا لالتهابات الجهاز التنفسي السفلي عند الأطفال. في كل عام ، يصاب أكثر من 33 مليون طفل دون سن الخامسة بفيروس HRSV ، مما يؤدي إلى أكثر من ثلاثة ملايين حالة دخول إلى المستشفى وما يقرب من 200,000 حالة وفاة1. تشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن HRSV يشكل أيضا تهديدا كبيرا لكبار السن والبالغين الذين يعانون من أمراض مزمنةكامنة 2.

تظهر غالبية عدوى HRSV لدى الأطفال الصغار بأعراض خفيفة ، يمكن مقارنتها بنزلات البرد ، ولا تتطلب تدخلا سريريا. ومع ذلك ، فإن نسبة صغيرة من المرضى يحتاجون إلى دخول المستشفى والتهوية الميكانيكية بسبب التهاب القصيبات الحاد.

< p class = "jove_content"> جزء من التسبب في مرض HRSV هو الاستجابة المناعية المفرطة وغير الكافية للمضيف للعدوى3،4. يتضح ذلك من خلال العديد من الملاحظات. غالبا ما تسبق فترة المرض الشديد ذروة العدوى الفيروسية وتتزامن بشكل أفضل مع التسلل الخلوي للأنسجة المصابة وإطلاق السيتوكينات الالتهابية3. يأتي خط آخر من الأدلة من تجارب HRSV (FI-RSV) المعطلة بالفورمالين في الستينيات. بدلا من إحداث الحماية لدى الرضع الصغار ، أدى اللقاح إلى استجابة مناعية مبالغ فيها أدت إلى أمراض الجهاز التنفسي المعززة وزيادة معدلات المراضة والوفيات.

< p class = "jove_content">تم تطوير العديد من النماذج لدراسة التسبب في عدوى HRSV. تم استخدام خطوط الخلايا المستمرة ، مثل HEp-2 و A549 ، على نطاق واسع لدراسة عدوى HRSV في المختبر. الخلايا الظهارية هي الأهداف الأساسية لعدوى HRSV5 ، لذلك كان التركيز كثيرا على هذه الأنواع من الخلايا. ومع ذلك ، فإن الوضع في الجسم الحي أكثر تعقيدا ولا يقتصر على نوع خلية واحد. من أجل فحص هذه التفاعلات المعقدة ، تم تطوير العديد من نماذج العدوى الحيوانية لدراسة التسبب في HRSV. حتى الآن ، تم استخدام استراتيجيتين مختلفتين ، مع التركيز إما على النماذج غير المتجانسة (غير البشرية) بالإضافة إلى نماذج الفيروس الرئوي المضيف المماثلة. تشمل أمثلة النماذج غير المتجانسة ل HRSV الشمبانزي والأغنام والجرذان القطنية والفئران. تمت دراسة عدوى الفيروس المخلوي التنفسي في مضيفه الطبيعي في الماشية والفئران ، باستخدام الفيروس البقري RSV والفيروس الرئوي ، على التوالي.

في حين أن كل نموذج من هذه النماذج قد قدم رؤى مهمة حول التسبب في المرض ، فإن HRSV يتكيف بشكل كبير مع البشر. لذلك ، كإضافة إلى خطوط الخلايا والنماذج الحيوانية المستخدمة حاليا ، نقترح استخدام PBMCs الأولية البشرية كنموذج للتحفيز باستخدام HRSV. يمكن الحصول على PBMCs البشرية من مجموعة من الأفراد لمعالجة أسئلة بحثية محددة ، بما في ذلك الأطفال الصغار6 ، والأفراد الذين يعانون من نقص المناعة وكذلك البالغين الأصحاء7 أو كبار السن8. يمكن استخدام PBMCs لدراسة الجوانب الفطرية للعدوى بالإضافة إلى الاستجابة التكيفية للفيروس. يمكن دراسة المسارات الالتهابية المنشطة المهمة للتسبب في مرض HRSV على مستوى mRNA والبروتين. علاوة على ذلك ، يمكن تحديد العدوى الفيروسية ل (مجموعات فرعية) من الخلايا المناعية عن طريق قياس التدفق الخلوي. لقد استخدمنا هذا النموذج سابقا لتحديد التأثيرات التآزرية لعدوى HRSV جنبا إلى جنب مع ثنائي الببتيد البكتيري الموراميل (MDP) على تحريض السيتوكينات المسببةللالتهابات 7. نقترح استخدام تحفيز HRSV ل PBMCs الأولية البشرية كنموذج قوي وسهل وسريع في المختبر لدراسة المسارات الالتهابية المشاركة في التسبب في مرض HRSV.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة:

يجب إجراء التجارب التي تستخدم HRSV داخل خزانة سلامة بيولوجية في مختبر من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية. اجمع كافة النفايات الفيروسية والمواد التي لامست الفيروس للتخلص منها بشكل صحيح نظراً للمخاطر البيولوجية.

يجب اتخاذ احتياطات خاصة عند استخدام دم بشري قد يكون مصاباً بالعدوى.

من الضروري استخدام كواشف خالية من السموم الداخلية طوال جميع البروتوكولات.

1. استزراع فيروس HRSV A2

  1. يتم استزراع خلايا HeLa أو HEp-2 في وسط DMEM + 10% مصل عجل جنيني (FCS) + 1% بنسيلين/ستربتوميسين (P/S) في دورق استزراع بمساحة 175 cm2 حتى تصل درجة التلاقي إلى 50% تقريباً.
  2. تُغسل الخلايا ثلاث مرات بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) في درجة حرارة الغرفة.
  3. يتم إذابة أنبوبة تحتوي على المخزون البذري لفيروس HRSV عند 37 °C في حمام مائي. يُخفف المخزون الفيروسي بحيث تبقى تعددية العدوى (MOI) عند 0.1 أو أقل، وذلك لمنع تولد الجسيمات المتداخلة المعيبة (DIPs). يُخفف المخزون الفيروسي في 4 ml/flask من وسط العدوى (DMEM + 1% P/S) ويُضاف إلى خلايا HeLa أو HEp-2. يجب الحفاظ على هذا الحجم في أدنى حد ممكن دون التسبب في جفاف الخلايا، إذ كلما انخفض الحجم زاد معدل العدوى.
  4. تُحضن الخلايا لمدة 2-4 hr عند 37 °C، و5% CO2، مع تحريك الدورق بشكل دائري كل 15 min لإعادة توزيع الوسط.
  5. يُزال اللقاح وتُغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
  6. يُضاف 15 ml من وسط الاستزراع (DMEM + 10%FCS + 1% P/S) وتُحضن الخلايا لمدة 3-5 days عند 37 °C، و5% CO2. تُفحص الخلايا باستخدام المجهر الضوئي العادي لمراقبة التغيرات المرضية الخلوية الناجمة عن الفيروس، مثل تكوين المدمج الخلوي (syncytia) وموت الخلايا وطفوها.
  7. عند ظهور التغيرات المرضية الخلوية، يتم حصاد HRSV عن طريق كشط الخلايا وجمع المعلق الفيروسي في أنبوبة معقمة سعة 50 ml. يُرج المعلق الخلوي بجهاز Vortex، حيث يعمل الكشط والرج على تحرير المزيد من الجسيمات الفيروسية.
  8. يُطرد المعلق الفيروسي مركزياً لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة عند 1,800 x g لترسيب حطام الخلايا. لا يترسب HRSV الموجود في الطافي عند هذه السرعة، لذا يمكن استخدام الطافي مباشرة لعدوى عدة دورق بمساحة 175 cm2 أو تخزينه عند -80 °C كمخزون بذري في حصص سعة 1 ml للاستخدام المستقبلي. يجب دائماً تجميد HRSV بسرعة (snap-freeze) في النيتروجين السائل لمنع فقدان الجسيمات الفيروسية المعدية.
  9. كما ذكر أعلاه، يُستخدم المخزون البذري المُحضّر بالبروتوكول السابق لعدوى عدة دورق استزراع بمساحة 175 cm2. يُكرر البروتوكول بدقة لإنتاج المزيد من الفيروس لغرض التنقية. يمكن تنقية ما يصل إلى 180 ml من المعلق الفيروسي في دورة طرد مركزي فائق واحدة.
  10. عند ظهور التغيرات المرضية الخلوية، يتم حصاد HRSV عن طريق كشط الخلايا وجمع الطافي. يُرج المعلق الفيروسي بجهاز Vortex، ثم يُطرد مركزياً لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة عند 1,800 x g لترسيب حطام الخلايا. لا يترسب HRSV الموجود في الطافي عند هذه السرعة، ويتم تقسيم الطافي إلى حصص سعة 15 ml في كل أنبوبة 50 ml. يُجمد بسرعة ويُخزن عند -80 °C حتى عملية التنقية.

2. تنقية فيروس HRSV

ملاحظة: قبل استخدام جهاز الطرد المركزي الفائق، يجب إدراك أنه قطعة من المعدات التي قد تكون خطيرة. اقرأ الكتيبات الإرشادية وقم بإجراء عملية الطرد المركزي الفائق الأولى تحت إشراف شخص ذي خبرة.

  1. نظف سلالات جهاز الطرد المركزي الفائق باستخدام ethanol بتركيز 70% واتركها لتجف داخل كابينة السلامة البيولوجية.
  2. ضع أنبوب طرد مركزي معقماً في كل سلالة.
  3. حضّر محلول sucrose بتركيز 30% (w/v) في PBS، وقم بتعقيمه عن طريق الترشيح (مرشح 0.2 μm)، ثم أضف 5 ml إلى قاع كل أنبوب طرد مركزي. ولتطبيق بروتوكول أسرع، يمكن تجميد الأنابيب التي تحتوي على محلول sucrose، مع التأكد من الحفاظ على تعقيمها.
  4. إذا لم يتم تجميد محلول sucrose، أضف بحذر شديد 30 ml من محلول HRSV فوق محلول sucrose هذا. استخدم الماصة ببطء لتجنب تعكير محلول sucrose، مع الحفاظ على خط فصل واضح. أما إذا كانت الأنابيب مجمدة، فاصب المعلق الفيروسي فوق محلول sucrose المجمد ثم اتركه ليذوب.
  5. وازن بدقة شديدة السلالات الست لجهاز الطرد المركزي الفائق باستخدام PBS معقم. ضع الميزان داخل كابينة التدفق للحفاظ على تعقيم كل شيء. املأ الأنابيب حتى مستوى 3-5 mm تحت الحافة، وإلا فقد تنهار أنابيب الطرد المركزي. وازن السلالات بدقة تصل إلى 0.1 g، مع تضمين الغطاء اللولبي، تحسباً لعدم تطابق الأغطية تماماً.
  6. قم بإجراء الطرد المركزي في جهاز الطرد المركزي الفائق لمدة 1.5 hr، عند درجة حرارة 4 °C وبقوة 20,000 rcf.
  7. أخرج أنبوب الطرد المركزي بعناية من السلالة باستخدام ملقط معقم. ستكون الجسيمات الفيروسية قد نفذت عبر طبقة sucrose وشكلت راسباً (pellet). وفي المقابل، ستظل العوامل الذائبة المفرزة من الخلايا (مثل السيتوكينات) في المحلول. أمل أنبوب الطرد المركزي لتصريف كل السوائل، ثم اتركه مقلوباً على سطح معقم، مثل طبق زراعة، ليجف، ولكن لا تترك الراسب يجف تماماً.
  8. أضف بعناية 1 ml من محلول ملح هانك المتوازن (HBSS) إلى الراسب، ثم أمل أنبوب الطرد المركزي لتصريف HBSS. مرة أخرى، اترك الأنبوب يجف مقلوباً على سطح معقم، مع تجنب جفاف الراسب تماماً.
  9. أعد تعليق الراسب في 1 ml من HBSS عن طريق السحب والطرد بالماصة 40 مرة. حاول منع تكون فقاعات الهواء لأن ذلك قد يؤدي إلى تدمير الفيروس.
  10. قسم الفيروس إلى حصص (aliquots)، وقم بتجميده سريعاً في النيتروجين السائل، وخزنه عند درجة حرارة -80 °C حتى استخدامه لاحقاً. استخدم حصة جديدة من الفيروس لكل تجربة، لأن تكرار التجميد والإذابة سيقلل من العيار المعدي (infectious titer). عند الإذابة، قم دائماً بإذابة الفيروس عند 37 °C لأن HRSV يكون أقل استقراراً في درجات الحرارة ما بين -20 و 15 °C.

3. تقدير كمية HRSV

ملاحظة: لضمان إمكانية تكرار البيانات، كرر عملية القياس الكمي 3 مرات على الأقل في عينات مكررة.

3.1. عدوى خلايا A549

  1. ازرع خلايا A549 في طبق مكون من 24 بئراً حتى تصل إلى مرحلة الالتحام.
  2. اغسل خلايا A549 مرتين باستخدام 1 ml من PBS في درجة حرارة الغرفة.
  3. حضّر تخفيفات تسلسلية بمعدل 5 أضعاف لفيروس HRSV في وسط Reduced Serum Medium. أضف 100 μl من الفيروس المخفف إلى كلا البئرين. قم بإجراء 4 تخفيفات كحد أدنى (مثلاً 4 و20 و100 و500 ضعفاً). أضف بئرين إضافيين مصابين بأعلى جرعة من الفيروس (سيتم استخدامهما كضابط للنمط الإشاري isotype control)، وأضف بئرين كمجموعة ضابطة غير مصابة (mock-infected).
  4. حضّن الخلايا لمدة 2 hr عند 5% CO2 ودرجة حرارة 37 °C. قم بهز أطباق الـ 24 بئراً كل 15 min لمنع الجفاف.
  5. أزل معلق الفيروس واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 ml من PBS في درجة حرارة الغرفة.
  6. حضّر محلول ألبومين المصل البقري (BSA) بتركيز 4% (w/v) في وسط Reduced Serum Medium. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح (مرشح 0.2 μm) وأضف 500 μl إلى كل بئر.
  7. حضّن الخلايا عند 5% CO2 ودرجة حرارة 37 °C لمدة 22 hr.

3.2. التحضير لتقنية FACS

  1. أزل الوسط واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 ml من PBS في درجة حرارة الغرفة.
  2. أضف 200 μl من التربسين المسخن مسبقاً (37 °C) إلى كل بئر واحضنها لمدة 10 min عند 37 °C و 5% CO2.
  3. افحص انفصال الخلايا تحت المجهر. في حال انفصال الخلايا، أضف 800 μl من DMEM + 10% FCS + 1% P/S لمعادلة التربسين، ثم أعد تعليق الخلايا.
  4. انقل الخلايا إلى طبق 96 بئراً مخروطي غير معالج لزراعة الأنسجة. قم بالطرد المركزي لمدة 5 min عند 400 x g في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليق الرواسب في 200 μl من PBS البارد.
  5. قم بالطرد المركزي لمدة 5 min عند 400 x g في درجة حرارة 4 °C، ثم صب السائل الطافي وأعد التعليق في 200 μl من PBS البارد.
  6. قم بالطرد المركزي لمدة 5 min عند 400 x g في درجة حرارة 4 °C، ثم صب السائل الطافي وأعد التعليق في 150 μl من أسيتون بتركيز 80% مبرد بالثلج.
  7. ثبّت الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 min.
  8. قم بالطرد المركزي لمدة 5 min عند 400 x g في درجة حرارة 4 °C، ثم صب السائل الطافي وأعد التعليق في 200 μl من PBS البارد + 0.1 % BSA.
  9. قم بالطرد المركزي لمدة 5 min عند 400 x g في درجة حرارة 4 °C، ثم صب السائل الطافي وأعد التعليق في 50 μl من anti-NP-RSV-FITC (مخفف بنسبة 1:50 في PBS + 1% BSA) أو 50 μl من IgG2 anti mouse-FITC (هذا تحكم من النوع المتماثل "isotype control"؛ لذا استخدم نفس تركيز الأجسام المضادة).
  10. خلال ما تبقى من البروتوكول، احتفظ بالأنابيب في الظلام. احضنها لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 4 °C، ويمكن تمديد هذه الفترة حتى الليلة التالية.
  11. أضف 150 μl من PBS البارد + 0.1% BSA.
  12. قم بالطرد المركزي لمدة 5 min عند 400 x g في درجة حرارة 4 °C، ثم صب السائل الطافي وأعد التعليق في 200 μl من PBS البارد + 0.1% BSA.
  13. قم بالطرد المركزي لمدة 5 min عند 400 x g في درجة حرارة 4 °C، ثم صب السائل الطافي وأعد التعليق في 200 μl من PBS البارد + 0.1% BSA. احتفظ بالطبق على الثلج وفي الظلام حتى إجراء قياس FACS.
  14. قم بقياس الخلايا المصابة باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي.

3.3. حساب FITC-50

  1. استخدم برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي لتحديد نقطة القطع باستخدام الضابط السلبي (الضابط النمطي Isotype control). استخدم نوع الرسم البياني بالألوان الزائفة (Pseudocolor). ارسم بوابة ربعية، بحيث تقع الخلايا الإيجابية في الحقل Q3. يجب أن تكون نسبة الإيجابيات الكاذبة أقل من 0.2% في كلا الضابطين النمطيين.
  2. صَدِّر البيانات إلى برنامج جداول بيانات وأعدّ جدولاً يحتوي على نسبة الخلايا الموجبة لـ FITC+ لكل تخفيف. اطرح القيمة المتوسطة للإيجابيات الكاذبة (كما تم تحديدها بواسطة الضابط النمطي) من كل قيمة لكل تجربة.
  3. افتح ملفاً جديداً (مخطط تشتت XY، عمود X واحد وعدة أعمدة Y) في برنامج إحصائي. انسخ البيانات إلى هذا البرنامج: X = التخفيف، Y = % الخلايا المصابة، n = 3، استخدم متوسط قياسين لكل تخفيف. أجْرِ تحليلاً إحصائياً للانحدار غير الخطي، اضمحلال أسي أحادي الطور (one-phase exponential decay). تحقق مما إذا كان المنحنى يطابق نقاط البيانات، وإذا لم يكن كذلك، اختر تحليلاً إحصائياً مختلفاً.
  4. انسخ معادلة المنحنى وقيم المعادلة إلى برنامج جداول بيانات. احسب قيمة X عندما تكون Y = 50%. وبناءً على ذلك، حدد قيمة FITC-50 عن طريق حساب الجسيمات المعدية المكتشفة بـ FITC لكل مل (FIP/ml) عند التخفيف الذي تحدث عنده إصابة بنسبة 50%، باستخدام المعادلة التالية:
    صيغة حساب FITC50؛ مخطط يوضح معادلة قياس كثافة الفلورة.
    A = متوسط عدد خلايا A549 لكل بئر
    B = μl من الفيروس لكل بئر مستخدم للإصابة
    C = التخفيف الذي تحدث عنده إصابة بنسبة 50%

4. عزل الخلايا الوحيدة النواة من الدم المحيطي (PBMC) من دم متطوع أصحاء

  1. اسحب دماً وريدياً في أنابيب EDTA سعة 10 ml من متطوعين أصحاء بعد الحصول على موافقة مستنيرة. سينتج عن حجم 10 ml من الدم ما يقرب من 107 من خلايا PBMCs.
  2. اعمل من الآن فصاعداً في ظروف معقمة داخل كبينة تدفق الهواء (flow-cabinet).
  3. خفف الدم بنسبة 2x باستخدام محلول PBS بدرجة حرارة الغرفة في أنبوب سعة 50 ml. يمكن استخدام حجم إجمالي أقصى قدره 35 ml من الدم المخفف لكل أنبوب سعة 50 ml.
  4. استخدم محقنة معقمة سعة 50 ml وأضف إليها إبرة Luer lock معقمة. اسحب وسط تدرج الكثافة (density gradient media) في المحقنة. ضع الإبرة في قاع أنبوب يحتوي على الدم المخفف وقم بنقل 15 ml من وسط تدرج الكثافة بحذر تحت الدم المخفف. حافظ على وجود فاصل واضح بين وسط تدرج الكثافة والدم.
  5. قم بالطرد المركزي عند 800 x g في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 min مع ضبط التسارع عند 9 (الحد الأقصى) وإيقاف المكبح (brake off). اضبط درجة حرارة جهاز الطرد المركزي على 4 °C بعد الاستخدام.
  6. سيؤدي الطرد المركزي بتدرج الكثافة إلى تكوين طبقات متعددة. ستظهر في القاع رسابة (pellet) من كريات الدم الحمراء مع طبقة فضية فوقها تحتوي على الخلايا المتعادلة (neutrophils). وتحتوي الطبقة الشفافة فوق هذه الرسابة على وسط تدرج الكثافة. أما الطبقة الرقيقة الموجودة بين وسط تدرج الكثافة وطبقة بلازما الدم في الأعلى فهي تحتوي على خلايا PBMCs.
  7. اجمع خلايا PBMCs بحذر باستخدام ماصة باستور وانقل الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 50 ml. حافظ من الآن فصاعداً على خلايا PBMCs فوق الثلج واستخدم محلول PBS بارد جداً. أضف محلول PBS بارد جداً حتى يصل الحجم إلى 50 ml وقم بالطرد المركزي عند 400 x g لمدة 10 min عند 4 °C (مع ضبط المكبح عند 9).
  8. تخلص من الطافي (supernatant) عن طريق الشفط، ثم أعد تعليق الرسابة في 50 ml من محلول PBS بارد جداً وقم بالطرد المركزي عند 400 x g لمدة 10 min عند 4 °C، وكرر هذه العملية مرتين.
  9. بعد التخلص من الطافي، أضف 1 ml من الوسط البارد جداً (RPMI + 1% P/S) وقم بعد الخلايا باستخدام غرفة عد.
  10. اضبط تركيز الخلايا ليكون 5 x 106 PBMCs/ml.

5. تحفيز الخلايا 단مفية الدم المحيطية (PBMCs) باستخدام فيروس HRSV الحي

  1. قم بإعداد التجهيزات الخاصة بالتجربة؛ مع تضمين مكررات تجريبية لكل حالة.
  2. قم بتخفيف جميع المحفزات اللازمة في الوسط الغذائي (RPMI + 1% P/S). ضع في اعتبارك أن الحجم النهائي لكل بئر سيكون 200 μl. سيتم إضافة حجم 50 μl من المحفزات، لذا قم بتحضير مخزونات تحفيز مركزة بمقدار 4x.
  3. أضف 100 μl من معلق الخلايا المذكور أعلاه إلى كل بئر في طبق 96-well ذو قاع مستدير (5 x 105 PBMC/well).
  4. أضف 50 μl من المحفزات المخففة إلى كل بئر. يمكن إضافة محفزين مختلفين، مما يعطي حجماً إجمالياً قدره 200 μl. إذا كان المطلوب محفز واحد فقط، فقم بتعديل الحجم ليصل إلى 200 μl باستخدام الوسط الغذائي.
  5. قم بتحضين طبق 96-well لفترة التحضين المطلوبة عند 37 °C في حاضنة تحتوي على 5% CO2. بالنسبة لمعظم السيتوكينات، ستكون فترة تحضين لمدة 24 hr كافية.

6. قراءة نتائج التحفيز

  1. بعد فترة الحضن، يتم طرد طبق الـ 96 بئراً مركزياً لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة عند 450 x g لتجميع الخلايا في القاع.
  2. يتم جمع السائل الطافي (بأقصى حجم 180 μl) وتخزينه لتحليل السيتوكينات لاحقاً (-20 °C) أو لإنتاج الفيروس (-80 °C).
  3. يمكن تحليل خلايا PBMCs المحفزة الموجودة في الراسب إما عن طريق qPCR/Western blot بإضافة محلول التحلل (lysis buffer)، أو بدلاً من ذلك، يمكن صبغ خلايا PBMCs لتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometry).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ستعطي طريقة استزراع وتنقية HRSV A2 الموصوفة هنا حصيلة تتراوح بين 2 x 107 و 2 x 108 من الجسيمات الفيروسية المعدية المكممة بواسطة FITC-50 لكل مل. تمت مقارنة نتائج التحليل المجهري، حيث تم عد الخلايا المصابة المصبوغة بـ FITC (النتائج غير موضحة)، مع نتائج التكميم باستخدام FACS (الشكل 1). وقد أدت كلتا الطريقتين إلى الحصول على عيارات مماثلة، على الرغم من أن طريقة FACS سجلت انحرافاً معياريًا أقل بكثير بين التجارب المختلفة وكانت أقل جهدًا.

عند إجراء تجربة تحفيز خل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، نوضح أن إصابة PBMC ب HRSV هي نظام نموذجي سريع وموثوق يمكن من خلاله دراسة المسارات الالتهابية. من أجل تحفيز PBMCs ، يجب إعداد مخزون HRSV وتحديده كميا.

خطوط الخلايا المتعددة عرضة للإصابة بعدوى HRSV. خطوط الخلايا الأكثر استخداما لزراعة HRSV هي خلايا HEp-2 و HeLa و Vero. ومع ذلك ، لا نوصي باستخدام خلايا Vero لزراعة HRSV لأنه ثبت أن زراعة HRSV في خلايا Vero تؤدي إلى بروتين G مقطوع من HRSV10. أيضا ، استخدم دائما كميات قليلة من الفيروس لإصابة الخلايا للزراعة بسبب خطر توليد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا ما نكشف عنه.

شكر وتقدير

RSV A2 تم توفيره من قبل الدكتور آر دي سوارت (إيراسموس إم سي ، روتردام ، هولندا). يتم دعم MV و GF من قبل اتحاد Virgo ، بتمويل من مشروع الحكومة الهولندية رقم FES0908 ، ومشروع مبادرة الجينوم الهولندية (NGI) رقم 050-060-452. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات دلو
Reagent< / strong>
PBSLonzaBE17-516FPBS بدون Ca2 + < / sup> Mg2 + < / sup> أو الفينول الأحمر
HBSSInvitrogen14025-100HBSS ، الكالسيوم ، المغنيسيوم ، لا الفينول الأحمر
DMEMInvitrogen31966-047DMEM ، ارتفاع الجلوكوز ، GlutaMAX ، البيروفات
RPMIInvitrogen72400054RPMI 1640 Medium ، GlutaMAX ، HEPES
Reduced Serum Medium (Opti-MEM)Invitrogen51985-026Opti-MEM I Reduced Serum Medium ، GlutaMAX
FCSGreiner Bio-oneFBS (مصل الأبقار للجنين) BSA
Sigma AldrichA7030Albumin من مصل البقر
P / SInvitrogen15140-122البنسلين الستربتومايسين ، سائل
التربسينInvitrogen25300-0540.05٪ Trypsin-EDTA (1x) ، خلايا الفينول الأحمر
HeLaATCCCCL-2
A549 خلاياATCCCCL-185
السكروزسيجما ألدريتشS7903السكروز BioXtra ، & ge ؛ 99.5٪
IgG2 المضاد للماوس - FITCBD Pharmingen555057Mss IgG2b K FITC التحكم في النمط المتشاحي
المضاد ل NP-RSV-FITCAbcamab25849الأجسام المضادة للفيروس المخلوي المضاد للجهاز التنفسي [671] (FITC)
وسط التدرج الكثافة (Lymphoprep)أنابيب Axis-Shield1114545
EDTA BDBiosciences367525
AcetoneMerck Millipore1000141000الأسيتون للتحليل
<قوي> المواد < / قوية >
أنابيب الطرد المركزيBeckman Coulter326823Thinwall ، Polyallomer ، 38.5 مل ، 25 مم × 89 مم
SureSpin 630 الدوار مع دلاء 36 ملSorvall79368متأرجح دوار التيتانيوم
Sorvall WX80 Ultra CentrifugeSorvall46900
CB 150l CO2< / sub> حاضنةالموثق

المراجع

  1. Nair, H., Nokes, D. J., et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 375, 1545-1555 (2010).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults. N. Eng. J. Med. , 352-1749 (2005).
  3. Openshaw, P. J. Antiviral Immune Responses and Lung Inflammation after Respiratory Syncytial Virus Infection. Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (2), 121-125 (2005).
  4. Openshaw, P. J., Tregoning, J. S. Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection. Clin. Microbio. Rev. 18 (3), 541-555 (2005).
  5. Villenave, R., Thavagnanam, S., et al. In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium, the primary target of infection in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 5040-5045 (2012).
  6. Tulic, M. K., Hurrelbrink, R. J., Prêle, C. M., Laing, I. A., Upham, J. W., Le Souef, P., Sly, P. D., Holt, P. G. TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide. J. Immunol. 179 (1), 132-140 (2007).
  7. Vissers, M., Remijn, T., et al. Respiratory syncytial virus infection augments NOD2 signaling in an IFN-β-dependent manner in human primary cells. Eur. J. Immunol. 42 (10), 2727-2735 (2012).
  8. Cherukuri, A., Patton, K., Gasser, R. A. Jr, Zuo, F., Woo, J., Esser, M. T., Tang, R. S. Adults 65 years old and older have reduced number of functional memory T cells to respiratory syncytial virus fusion protein. Clin. Vacc. Immunol. 20 (2), 239-247 (2013).
  9. Shafique, M., Wilschut, J., de Haan, A. Induction of mucosal and systemic immunity against respiratory syncytial virus by inactivated virus supplemented with TLR9 and NOD2 ligands. Vaccine. 30, 597-606 (2012).
  10. Kwilas, S., Liesman, R. M., Zhang, L., Walsh, E., Pickles, R. J., Peeples, M. E. Respiratory syncytial virus grown in Vero cells contains a truncated attachment protein that alters its infectivity and dependence on glycosaminoglycans. J. Virol. 83 (20), 10710-10718 (2009).
  11. Treuhaft, M. W., Beem, M. O. Defective interfering particles of respiratory syncytial virus. Infect. Immun. 37 (2), 439-444 (1982).
  12. Korns Johnson, D., Homann, D. Accelerated and improved quantification of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) titers by flow cytometry. PLoS One. 7 (5), e37337(2012).
  13. Wurfel, M. M., Park, W. Y., et al. Identification of high and low responders to lipopolysaccharide in normal subjects: an unbiased approach to identify modulators of innate immunity. J. Immunol. 175 (4), 2570-2578 (2005).
  14. Kimpen, J. L. Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 7-9 (2001).
  15. Wang, S. Z., Forsyth, K. D. The interaction of neutrophils with respiratory epithelial cells in viral infection. Respirology. 5 (1), 1-10 (2000).
  16. San-Juan-Vergara, H., Sampayo-Escobar, V., Reyes, N., Cha, B., Pacheco-Lugo, L., Wong, T., Peeples, M. E., Collins, P. L., Castano, M. E., Mohapatra, S. S. Cholesterol-rich microdomains as docking platforms for respiratory syncytial virus in normal human bronchial epithelial cells. J. Virol. 86 (3), 1832-1843 (2012).
  17. Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10. Plos One. 8 (1), e53641(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RSV QPCR

مقالات ذات صلة