يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في المختبر الفحص لتقييم أثر مناعة مقررات تمهيدية بشأن فيروس نقص المناعة CD4 T محددة المستجيب خلية وظيفة

13.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50821

⸱

أكتوبر 15, 2013

 ,  ,  ,  , 
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

وضعنا مقايسة في المختبر للتحقيق في دور مسارات مناعة في تنظيم إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة.

الملخص

T خلية الإرهاق هو عامل رئيسي في إزالة الممرض فشلت خلال العدوى الفيروسية المزمنة. وupregulated مسارات مناعة، مثل PD-1 و IL-10، على هذا المستضد التعرض المستمر وتساهم في فقدان الانتشار، وانخفاض وظيفة لحل الخلايا، وضعف إنتاج السيتوكينات من قبل خلايا CD4 و CD8 T. في نموذج الفئران من الإصابة LCMV، إدارة منع الأجسام المضادة ضد هذه الممرات اثنين زيادة استجابات الخلايا التائية. ومع ذلك، لا يوجد حاليا أي فحص في المختبر لقياس أثر هذه الحصار على إفراز السيتوكينات في الخلايا من عينات الإنسان. لدينا بروتوكول والمنهج التجريبي تمكننا من تحديد بدقة وكفاءة إعادة إنتاج السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة من الموضوعات فيروس نقص المناعة البشرية المصابة.

هنا، ونحن تصور وتصميم التجارب في المختبر تمكن من قياسات إفراز السيتوكينات من الخلايا CD4 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة وتأثيرها على سل أخرىمجموعات فرعية ل. تم استنفاد خلايا CD8 T من الدم الكامل وتم عزل PBMCs المتبقية عبر Ficoll طريقة الانفصال. ثم تم تحضين PBMCs المنضب CD8 مع منع الأجسام المضادة ضد PD-L1 و / أو IL-10Rα، وبعد التحفيز مع حمام سباحة الكمامة الببتيد HIV-1، وحضنت الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. بعد أن جمعت 48 ساعة، طاف للتحليل خلوى بواسطة صفائف الخرز وكريات خلية تم جمعها للتحليل المظهري إما باستخدام التدفق الخلوي أو تحليل النسخي باستخدام QRT-PCR. لتحليل أكثر تفصيلا، تم الحصول على السكان مختلفة من الخلايا عن طريق استنزاف فرعية انتقائية من PBMCs أو عن طريق الفرز باستخدام التدفق الخلوي قبل أن يتم تقييمها في نفس المقايسات. توفر هذه الأساليب نهج حساسة للغاية ومحددة لتحديد التشكيل الإنتاج خلوى من قبل خلايا تي المساعد مستضد محددة وتحديد التفاعلات الوظيفية بين مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية.

المقدمة

خلال العدوى الفيروسية المستمرة، وخلايا محددة-T فيروس اكتساب عيوب وظيفية في عملية تعرف باسم الخلايا التائية الإرهاق. في الدراسات المجراة في نموذج الفئران من LCMV عدوى فيروسية مزمنة في وقت مبكر إلى أن الخلايا T الفيروس محددة استنفدت خفضت وظيفة لحل الخلايا ضد الخلايا المصابة فيروسي، وتفقد قدرتها على التكاثر وخفضت القدرة على إنتاج السيتوكينات مثل IL-2، TNF- α الإنترفيرون γ و1،2. شبكة معقدة من الممرات مناعة، مثل PD-1 و IL-10، وupregulated خلال الالتهابات المزمنة وتسهم في ضعف الخلايا التائية (إعادة النظر في 3،4). في الجسم الحي إدارة منع الأجسام المضادة ضد هذه الممرات المثبطة في الماوس LCMV نموذج استعادة وظيفة خلايا تي فيروس محددة استنفدت وتعزيز إزالة الفيروسية، مشيرا إلى أن استنفاد الخلايا التائية هي ظاهرة عكسها جزئيا (مراجعة في 5).

النتائج على التم تمديد ه نموذج LCMV بسرعة للعدوى الفيروسية المزمنة مثل الإنسان HBV، HCV وفيروس نقص المناعة البشرية 5. في المزمنة عدوى HIV-1، وupregulated PD-1 و IL-10 مسارات في مواضيع المصابة وترتبط مع معلمات من تطور المرض، مباشرة مع الحمل الفيروسي وعكسيا مع عدد CD4 6-8. الحصار الضد من PD-1 أو IL-10 مسارات في المختبر استعادة انتشار خلايا CD4 و CD8 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة تشير إلى أن، على غرار نموذج LCMV الماوس، T استنفاد الخلايا لدى البشر هي ظاهرة عكسها جزئيا. ولكن نظرا إلى الطبيعة دقيق من التجارب على العينات البشرية فضلا عن القيود في حساسية في المختبر فحوصات، تحقيق شامل في الأوضاع استعادة الفنية من خلال هذه التدخلات حققت غائب لافت للنظر. وكانت فحوصات الانتشار، حتى الآن، والوحيدة التي يعول عليها في المختبر اختبار في معظم الدراسات الفحص، ولكن هناك نقصا ملحوظا من الأدلة على أثر هذه أمورالتدخالت على: 1) قدرة قتل الخلايا التائية السامة، 2) تأثير مضاد للفيروسات من خلايا T على تكاثر الفيروس، 3) الشخصى إفراز السيتوكينات، و 4) تأثير على CD4 الخلايا التائية المساعدة على مجموعات فرعية الخلايا الأخرى.

الخلايا تلطيخ خلوى (ICS) هو مفيد جدا وتستخدم على نطاق واسع على أساس مقايسة تدفق الخلوي الذي يستخدم للكشف عن إنتاج السيتوكينات في مختلف أنواع الخلايا في كل من الفئران والبشر. كما تم استخدامه لدراسة تأثير الحصار الضد من المسارات المثبطة. في المقايسات ICS، يتم حظر إفراز خلوى من خلال إضافة Brefeldin و / أو مونينسين. السيتوكينات المحاصرين داخل الخلايا ثم يتم الكشف عن الأجسام المضادة مع الفلورسنت باستخدام متعدد الألوان التدفق الخلوي. مدة الفحص عادة يقتصر على 6 أو 12 ساعة بعد التحفيز مستضد لأن كلا Brefeldin ومونينسين، والتي عادة المضافة داخل 2 ساعة من إضافة مستضد، هي سامة للخلايا. مقايسة ICS هي تقنية قوية التي كانت ط مفيدةن التحقيق من تأثير في الجسم الحي إدارة منع التدخل الأجسام المضادة في الفئران حيث تم استخراج الخلايا بعد فترة معينة من الوقت بعد التعرض الضد 9. ومع ذلك، هناك العديد من القيود لتطبيق هذا النهج التجريبية لتقييم أثر الحصار المفروض على المستقبلات المثبطة في العينات البشرية. عند تنفيذ التدخلات الضد من المسارات المثبطة في 6 أو 12 ساعة التحفيز في المختبر (عادة الحال مع العينات البشرية)، الحصار من المستقبلات المثبطة في معظم الحالات لا يغير من وتيرة الاستجابة خلايا T مستضد محددة مقاسا المقايسات ICS القياسية 6، 7. أعطت قياسات الإنتاج خلوى في خلايا مقاسا متوسط ​​أو متوسط ​​كثافة مضان نتائج غير متناسقة 6، 7، 10. من ناحية أخرى، عندما يتم تنفيذ ICS عند نقطة أواخر الوقت بعد التحفيز (أي ستة أيام)، والتغييرات في عدد من إفراز السيتوكينات جويمكن ملاحظة أذرع. الاختلافات هي التأثير المشترك للتغير الانتشار والبقاء، والتغيرات في وظيفة المستجيب التي تتراكم على مدى فترة محددة من الوقت 6. طريقة واحدة للتغلب على هذه القيود جزئيا هو احتضان لفترات أطول من الوقت (على سبيل المثال 36 ساعة، 60 ساعة، الخ.) مع مستضد قبل إضافة مانع إفراز خلوى دون انتظار انتشار تحدث. وقد استخدمنا بنجاح هذا الأسلوب لتحديد حركية إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية محددة CD4 و CD8 T 11،12، ولكن هذا النهج ليس قادرا على الكشف عن الاستجابات الصغيرة ولن يعطي نتيجة متكاملة من إفراز السيتوكينات مجموع تحدث منذ التحفيز. لذا، ICS ليست طريقة حساسة بما يكفي للكشف عن تأثير الحصار من مسارات المثبطة على كمية من السيتوكينات التي تنتجها الخلايا التائية تفعيلها مقارنة مع خلوى مرنا الكميات أو قياسات من إفراز خلوى في supernatanر في الوقت نفسه نقطة. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم السيتوكينات التي تنتجها الخلايا التائية تنشيط العمل في الأزياء autocrine من خلال المساهمة في ردود فعل إيجابية أو سلبية حلقات عبر التفاعل مع الخلايا مستضد تقديم. لذلك، إضافة Brefeldin أو مونينسين خلال فحص ICS يمنع إفراز السيتوكينات، وبالتالي تحفيز خلايا T ليس الأمثل. أخيرا، كشف عن السيتوكينات متعددة مع ICS محدودة بسبب توافر وحساسية الأجسام المضادة للكشف عن السيتوكينات مع التدفق الخلوي فضلا عن القيود في عدد من fluorochromes التي يمكن استخدامها في وقت واحد في أي لوحة معينة.

قمنا بتطوير نهج حساسة للغاية في المختبر التجريبي لتقييم تأثير مسارات مناعة في تنظيم إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة وبالتالي CD4 تساعد على تقديم المستضد خلايا (ناقلات الجنود المدرعة) والخلايا القاتلة الطبيعية (الخلايا القاتلة الطبيعية). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتقييم السلطة الإسرائيليةط الحصار من الجزيئات المثبطة CD8 T على وظيفة الخلية عن طريق استنزاف خلايا CD4 T من PBMCs أو من خلال تحفيز الببتيدات مع الأمثل التي يتم التعرف عليها إلا من خلال خلايا CD8 T. وعلى النقيض من الخلايا تلطيخ خلوى المقايسات، قررنا عدم التدخل في إفراز السيتوكينات من الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة من أجل أن يكون قادرا على: 1) إجراء تقدير أكثر دقة لمستويات خلوى المنتجة؛ 2) التحقيق في لجنة أوسع السيتوكينات أو الجزيئات المستجيب، و 3) تقييم أثر السيتوكينات التي تنتجها الخلايا بفيروس نقص المناعة البشرية CD4 T محددة على مجموعات فرعية الخلايا الأخرى. نحن تحفيز PBMCs المنضب CD8 مع HIV-1 الكمامة تجمع الببتيد في وجود أجسام مضادة لعرقلة مسار مناعة من الفائدة. بعد الوقت المطلوب من الحضانة، عادة 48 ساعة، ونحن جمع supernatants لقياس إفراز السيتوكينات مع صفائف حبة وجمع الكريات الخلايا إما لتحليل المظهري من مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا لتحليلها أو النسخي. علما، في رله 48 نقطة زمنية ساعة، ونحن لا كشف عدد كبير من السكان من الخلايا المتكاثرة T 12. هذا هو نهج مرن والعديد من التعديلات من هذا التصميم يمكن تطبيقها لمعالجة الفرضيات المختلفة. على سبيل المثال، مجموعات فرعية الخلايا الفردية (مثل خلايا CD4 T فيروس نقص المناعة البشرية محددة أو PD-1 خلايا CD4 T عالية، الخ.) يمكن فرزها بعد 12 ساعة من الحضانة قبل مزيد من الحضانة لمدة 36 ساعة تليها مجموعة من supernatants وكريات خلية للتحقيق بشكل أكثر تحديدا تأثير التدخلات الحصار على إفراز السيتوكينات من مجموعات سكانية فرعية محددة من PBMCs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. استنزاف وعزل PBMCs عبر Ficoll فصل

  1. تستنفد خلايا CD8 + T بإضافة الإنسان CD8 + استنفاد كوكتيل في 50 ميكرولتر / مل من الدم الكامل.
  2. تخلط جيدا واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية).
  3. بعد الحضانة، ومزج الدم الكامل مع HBSS (محلول الملح المتوازن هانك دون كا 2 + أو 2 ملغ +) وطبقة أكثر Histopaque. تدور في إطار التعاون الإقليمي 340 لمدة 30 دقيقة (لا الفرامل، والتسارع البطيء).
  4. جمع PBMCs ونقل إلى 50ML المخروطية جديدة. غسل 2X مع 45 مل 1640 RPMI تستكمل مع 50 وحدة دولية البنسلين، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1٪ HEPES من خلال الدوران لمدة 10 دقيقة في 340 إطار التعاون الإقليمي.

2. حصار الأجسام المضادة وتحفيز المستضد محددة من الخلايا

  1. Resuspend الخلايا في 2X10 6 في حالة في 1640 RPMI تحتوي على 10٪ مصل الإنسان تستكمل مع 50 وحدة دولية البنسلين، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1٪ HEPES،وهو ما يمثل 500 ميكرولتر لكل حالة.
  2. قسامة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب FACS.
  3. تبعا لمسار التحقيق، إضافة PD-L1، IL-10Rα منع الأجسام المضادة و / أو ضوابط نمط إسوي في 10 ميكروغرام / مل واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
  4. تحفيز الخلايا مع حمام سباحة الببتيد HIV-1 الكمامة في 1 ميكروغرام / مل / الببتيد تركيز النهائي. وتشمل أيضا "لا التحفيز" التحكم لكل حالة حظر. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة.

3. جمع وتحليل طاف

  1. بعد 48 ساعة، وتدور أسفل أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية لمدة 7 دقائق في 340 إطار التعاون الإقليمي.
  2. جمع بعناية 2 × 225 ميكرولتر طاف في أنابيب إيبندورف لLUMINEX صفائف حبة من دون إزعاج بيليه.
  3. تعطيل الفيروس في طاف جمعها مع 25 ميكرولتر 0.5٪ PBS-توين لإعطاء تركيز النهائي من 0.05٪ PBS-توين.
  4. مخزن جمع supernatants التي ليست immedتستخدم iately في الفريزر -80 درجة مئوية.
  5. قياس تركيزات خلوى المطلوب باستخدام ميليبور LUMINEX عدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

4. جمع وتحليل المظهري من الخلايا عن طريق التدفق الخلوي

  1. بعد جمع طاف، وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 3ML. تدور الخلايا لمدة 7 دقائق في إطار التعاون الإقليمي و340 صب غسل الزائدة.
  2. وصمة عار للبقاء باستخدام ايف / الميت الميت قابل للتثبيت اللطخة خلية كيت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق في إطار التعاون الإقليمي و340 في 4 درجات مئوية. resuspend في 100 ميكرولتر PBS 1٪ FBS.
  4. إذا تلطيخ لحيدات أو الخلايا مستضد تقديم غيرها، والمستقبلات كتلة التيسير عن طريق إضافة 1.4 ميكرولتر من كاشف FCR حجب ودوامة لخلط.
  5. احتضان لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. إضافة الأجسام المضادة السطحية، الدوامة، واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  7. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1٪ FBS، صب غسل الزائدة، وإضافة 200 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪. احتضانفي درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.
  8. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1٪ FBS، resuspend في 250 ميكرولتر PBS 1٪ FBS، والحصول على تدفق عداد الكريات multilaser (على سبيل المثال BD LSRII أو Fortessa).

5. تحليل الخلايا عن طريق QRT-PCR

  1. لخلايا لا تحليلها عن طريق التدفق الخلوي: بعد جمع طاف، وخلايا ليز في 300 ميكرولتر العازلة في Qiagen RLT تحتوي على 1٪ بيتا المركابتويثانول. إذا لم المستمر مع بروتوكول، يمكن تجميد الخلايا في -80 درجة مئوية بعد هذه النقطة.
  2. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام عدة عزل الحمض النووي الريبي التالية بروتوكول الشركة المصنعة.
  3. توليف [كدنا] من الحمض النووي الريبي باستخدام التوليف [كدنا] طقم التالية بروتوكول الشركة المصنعة.
  4. أداء الكمي PCR باستخدام تقنية SYBR الأخضر.
  5. خلق مزيج التمهيدي لكل التمهيدي المستخدمة بما في ذلك الجينات التدبير المنزلي (مثل IL-13، IL-10، الإنترفيرون γ، GAPDH) وذلك بإضافة الاشعال لنوكلياز خالية من المياه لإعطاء تركيز النهائي من 10ميكرومتر. الحفاظ على الجليد.
  6. إنشاء مزيج الرئيسي لكل التمهيدي بإضافة 10.5 ميكرولتر nuclease خالية من المياه، 12.5 ميكرولتر SYBR الخضراء، و 1 ميكرولتر مزيج التمهيدي في لوحة جيدا. الحفاظ على الجليد.
  7. ماصة 24 ميكرولتر مزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة التي سيتم استخدامها.
  8. إضافة 1 ميكرولتر [كدنا] إلى كل بئر وفقا للقالب.
  9. سقف الآبار وأجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 3 دقائق في 800 إطار التعاون الإقليمي.
  10. تشغيل لوحة على جهاز QRT-PCR، مثل أداة Stratagene MX3005P.

6. التكيف للداخل الخلايا تلطيخ خلوى في 48 ساعة

إضافة Brefeldin ومونينسين 6 ساعة قبل الخلايا تلطيخ خلوى. يضاف Brefeldin بتركيز 10 ميكروغرام / مل بينما يتم إضافة مونينسين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. للراحة، Brefeldin يمكن إضافة 12 ساعة قبل وصمة عار بتركيز من 5 ميكروغرام / مل.

  1. بعد وصمة عار السطح، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1٪ FBS وصمة عار لفيالسيتوكينات tracellular مثل IL-12، الإنترفيرون γ، وTNF-α استخدام عدة التثبيت / Permeabilization الحل والبروتوكول.
  2. غسل الخلايا، resuspend في 250 ميكرولتر PBS 1٪ FBS، وتعمل على تدفق عداد الكريات multilaser (على سبيل المثال BD LSR الثاني أو Fortessa).

7. التكيف لفرز الخلايا

  1. 16 ساعة بعد التحفيز، وصمة عار للبقاء باستخدام ايف / الميت قابل للتثبيت الميت وصمة عار خلية كيت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تبقي الخلايا على الجليد خلال الإجراء بأكمله.
  2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق في إطار التعاون الإقليمي و340 في 4 درجات مئوية. resuspend في 100 ميكرولتر PBS 1٪ FBS.
  3. إضافة الأجسام المضادة السطحية، ودوامة لخلط، واحتضان الخلايا على الجليد في الظلام لمدة 20 دقيقة.
  4. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1٪ FBS في إطار التعاون الإقليمي و340 في 4 درجات مئوية وresuspend في 500 ميكرولتر RPMI الباردة 1640 تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني تستكمل مع 50 وحدة دولية البنسلين، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1٪ HEPES.
  5. تصفية الخلايا باستخدام 5 مل البوليرينيه أنبوب الجولة القاع مع غطاء الخلوي مصفاة.
  6. إعداد أنابيب جمع لنوع بإضافة 200 ميكرولتر 1640 RPMI تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني تستكمل مع 50 وحدة دولية البنسلين، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين، و 1٪ HEPES لكل أنبوب. إبقاء جميع أنابيب على الجليد أثناء الفرز.
  7. يعيش فرز مجموعات فرعية من الخلايا في المصالح على صك (على سبيل المثال BD FACS الأغنية II) يقع في منشأة مجهزة للمواد biohazardous.
  8. بعد أن تم فرز الخلايا، وخلايا المكان مرة أخرى في الحاضنة لمدة المبلغ المطلوب من الوقت والمتابعة مع تحليل جمع طاف / LUMINEX وتحليل خلية جمع بيليه / PCR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عند تنفيذ القياسات خلوى استخدام هذا النظام في المختبر، فمن الضروري أن تكون قادرة على التمييز بين الاستجابات مستضد محددة بالمقارنة مع أي سيطرة التحفيز. بشكل عام، درسنا ردودا إيجابية عن أي قيم التحفيز الأنتيجين التي تعطي زيادة على الأقل ثلاثة أضعاف في مستويات خلوى بالمقارنة مع أي سيطرة التحفيز والتي كانت ضمن مجموعة خطية من الفحص. نحن نستخدم عالية الحساسية المقايسات مجموعة حبة التي يمكن الكشف عن تركيزات منخفضة مثل السيتوكينات 0.16 جزء من الغرام / مل، مما يتيح لنا أن نلاحظ ضع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

جمع طاف هو جزء حتمي من هذا التصميم التجريبي. عندما حصاد supernatants لفحص LUMINEX، أدلى مأخوذة والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لمنع تدهور البروتين بسبب تجميد أذاب دورات. تجميد والذوبان يمكن أن تكون عمليات قاسية للبروتينات، والتقليل من تجميد يذوب، سيتم مكبر إشارة في المقايسات. لذا، فمن الأسهل للحصول على بيانات أكثر دقة للتكرار وعند العمل من مأخوذة التي تم إذابة تجميد نفس العدد من المرات.

وقد أجرينا في السابق تحليل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

نشكر جوردون فريمان لتوفير الحجب الأجسام المضادة لمكافحة PD-L1. نشكر الكادر الطبي والمختبر في مستشفى ماساتشوستس العام وجميع المشاركين في الدراسة لدور لا تقدر بثمن في هذا المشروع.

وأيد هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع لمعاهد الصحة القومية (PO1 AI-080192؛ دك)، والرئة القومي للقلب والدم المعهد من المعاهد الوطنية للصحة (RO1 HL-092565؛ دك). ويدعم دك من قبل جائزة شهادة باحث من صندوق البحوث الصحية كيبيك (FRQS). ويدعم FP من خلال منحة زمالة من ماساتشوستس العام اللجنة التنفيذية مستشفى للبحوث ومعهد هارفارد للصحة العالمية (HGHI).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول الملح المتوازن من هانكس بدون Ca2 + < / sup> أو Mg2 + < / sup>SigmaH9394
RPMI 1640SigmaR0883
Histopaque-1077Sigma10771
مصل بشري ABGemini BioProducts100-512
البنسلين / الستربتومايسينMediatech30 001 CI
L-glutamineMediatech25 005 CI
HEPES العازلةMediatech25060CI
FcR كاشف حجب ،Miltenyi البشري Miltenyi130-059-901
RosetteSep Human CD8 + Depletion كوكتيل الخلايا الجذعية15663
طقم بقع الخلايا الميتة القابلة للإصلاح LIVE / DEAD ، لإثارة الأشعة فوق البنفسجيةInvitrogenL23105
Rneasy Mini KitQiagen74104
Improm-II نظام النسخ العكسيPromegaA3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master MixAgilent600830
BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilization Solution KitBD554714
Tween-20FisherBP337100
IFN- &# 947; التمهيديInvitrogenمن أجل: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH التمهيديInvitrogenمن أجل: TCATCATCTCTGCCCCCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

المراجع

  1. Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
  2. Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
  3. Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
  4. Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
  5. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
  6. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
  7. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
  8. Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
  9. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  10. Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
  11. Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
  12. Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
  13. Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

T CD4 HIV PD 1 IL 10R Ficoll Luminex qRT PCR Gag HIV
في المختبر الفحص لتقييم أثر مناعة مقررات تمهيدية بشأن فيروس نقص المناعة CD4 T محددة المستجيب خلية وظيفة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.