إثراء وتطهير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عن طريق الكشف عن مستضدات سطح الخلية باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة TG30 و GCTM-2

ملخص

ونصف استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة TG30 (CD9) وGCTM-2 للكشف المشترك عن مستضدات سطح الخلية عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتحديد وإثراء الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الحية (hESC) باستخدام الاختيار الإيجابي وكذلك استخدام الاختيار السلبي لتطهير hESCs من مجموعة خلايا مختلطة.

الملخص

يمكن للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) أن تجدد نفسها إلى أجل غير مسمى في المختبر، ومع الإشارات المناسبة يمكن حثها على التفريق إلى جميع أنساب الخلايا الجسدية المحتملة. يمكن استخدام مشتقات hESC المتمايزة في علاجات الزرع لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية للخلايا. ومع ذلك، عادة ما تسفر بروتوكولات التمايز hESC عن خليط من أنواع الخلايا المستهدفة وغير المستهدفة، فضلا عن الخلايا المتبقية غير المتمايزة. من أجل ترجمة مشتقات hESC المتمايزة من المختبر إلى العيادة ، من المهم أن تكون قادرا على التمييز بين الخلايا غير المتمايزة (متعددة القدرات) والخلايا المتمايزة ، وتوليد طرق لفصل هذه المجموعات السكانية. لا يمكن تحقيق التطبيق الآمن لأنواع الخلايا الجسدية المشتقة من hESC إلا مع مجموعات خالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، حيث يمكن أن تحفز hESCs المتبقية الأورام المعروفة باسم الأورام المسخية بعد الزرع. وتحقيقا لهذه الغاية، نقوم هنا بوصف منهجية للكشف عن المستضدات السطحية المرتبطة بالخلايا المتعددة الخلايا مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة TG30 (CD9) وGCTM-2 عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتحديد TG30 Hi-GCTM-2^Hi hESCs باستخدام الاختيار الإيجابي. باستخدام الاختيار السلبي مع منهجية TG30/GCTM-2 FACS ، تمكنا من اكتشاف وتطهير hESCs غير المتمايزة في المجموعات السكانية التي تمر بمرحلة مبكرة جدا من التمايز (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). في دراسة أخرى، عينات متعددة القدرات خالية من الخلايا الجذعية من TG30^{متمايزة}Neg-GCTM-2^{خلايا Neg} التي تم اختيارها باستخدام بروتوكول TG30/GCTM-2 FACS لم تشكل المسخ زرع مرة واحدة في الفئران المناعية للخطر، ودعم قوة بروتوكولنا. من ناحية أخرى، TG30/GCTM-2 FACS بوساطة التمرير المتتالية من TG30 متعدد القدرات المخصب^مرحبا-GCTM-2^مرحبا hESCs لم يؤثر على قدرتها على تجديد الذات في المختبر أو متعددة الجوهرية. لذلك، فإن خصائص منهجية TG30/GCTM-2 FACS توفر فحصا حساسا للحصول على مجموعات غنية للغاية من hPSC كمدخلات لإجراء فحوصات التمايز وتخليص hESC الورمي المحتمل (أو المتبقي) من مجموعات الخلايا المشتقة.

المقدمة

تشمل HPSC (hPSC) الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (hIPSC). يمكن أن تجدد HPSC نفسها إلى أجل غير مسمى في ظروف ثقافية مناسبة دون أن تفقد قدرتها المعروفة باسم "متعددة". يعرف تعدد الخلايا بأنه إمكانية تمييز الخلية إلى أي نسب خلايا جسدية بشكل أساسي بما في ذلك الخلايا الممثلة لكل طبقة من طبقات الخلايا الجرثومية الجنينية الثلاث. توفر الإمكانات الرائعة ل hPSC وسيلة لمجموعة كبيرة ومتنوعة من التطبيقات القائمة على الخلايا بما في ذلك الخيارات العلاجية. على سبيل المثال ، هناك اضطرابات تنطوي على موت الخلايا وانحطاطها ، حيث تتعرض الوظائف الطبيعية للخلايا في جسم الإنسان للخطر ، كما هو الحال في قصور القلب وإصابات العمود الفقري والسكري ومرض باركنسون وبعض أنواع السرطان وغيرها من الأمراض السريرية. المرضى الذين يعانون من هذه الشروط يمكن أن تعالج عن طريق زرع خلايا جسدية صحية ووظيفية التي تم اشتقاقها من hPSC في المختبر. ومع ذلك، فإن بروتوكولات التمايز hPSC الحالية ليست فعالة 100٪ وتسفر عن خليط من أنواع الخلايا المستهدفة وغير المستهدفة، فضلا عن hPSCs المتبقية التي لم تخضع للتمايز، بدلا من الاستمرار في التجديد الذاتي^1-3. وجود حتى عدد قليل من hPSC في عينة من الخلايا الجسدية المشتقة من hPSC المخصصة لزرعها في المرضى يشكل خطرا سريريا خطيرا لأن هذه الخلايا بطبيعتها المتأصلة لتشكيل أنسجة جميع الطبقات الجرثومية الجنينية الثلاث ، يمكن أن تشكل في الجسم الحي نوعا من الورم المعروف باسم المسخ. لذلك ، يمكن اعتبار مجموعات الخلايا المستهدفة فقط التي تقرر أنها خالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات آمنة لزرعها في المرضى. وهناك عدة نهج أبلغ عنها لاحتمال إنجاز تطهير مركبات الكربون الهيدروفلورية المتبقية بعد التمايز (انظر الاستعراض بولانكو ولاسليت^4). وقد أبلغنا سابقا عن استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة TG30 (CD9) وGCTM-2 إلى جانب فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتحديد الخلايا الجذعية متعددة القدرات والتمييز بينها وبين الخلايا التي تمر بمرحلة مبكرة من التمايز في ثقافات خطوط hESC^5-7.

إحدى مزايا استخدام الأجسام المضادة للكشف عن مستضدات سطح الخلية هي أن الخلايا المستهدفة عادة ما تكون قابلة للحياة بعد ربط الأجسام المضادة و / أو وضع العلامات. لذلك، يمكن جمع الخلايا المستهدفة بعد وضع العلامات على الأجسام المضادة وإعادة استزراعها للتوسع وتطبيقات أخرى قبل زرعها. ومن المحاذير بالنسبة للمضادات السطحية للخلايا المعبر عنها في hPSC أنها ليست مقصورة على المرحلة المتعددة القدرات، وفي كثير من الحالات يعاد التعبير عنها مؤقتا أثناء التنمية، وبالتالي سيتم اكتشافها في بعض أنواع الخلايا المتمايزة. لذلك، إذا كان الهدف هو استخدام الأجسام المضادة للكشف عن الخلايا البشرية متعددة القدرات وتطهيرها من عينة من الخلايا المشتقة من hPSC، يجب ألا تتفاعل الأجسام المضادة المختارة أيضا مع المستضدات على أنواع الخلايا المتمايزة المحددة المخصصة للزرع. لسوء الحظ، هناك أعداد محدودة من الأجسام المضادة التي تكشف علامات سطح الخلية على hPSCs ^{الحية 4،}مما يجعل خيارات الاختيار محدودة. وبالإضافة إلى ذلك، أشارت بعض الدراسات إلى أن الكشف عن علامة واحدة سطح الخلية ليست كافية للقضاء على جميع hPSC، مما يشير إلى أن أي محاولة للقضاء على جميع الخلايا الفرعية متعددة القدرات hPSC يجب أن تعتمد على الأساليب التي تستخدم اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة الكشف عن epitopes مختلفة التي أعرب عنها hPSCs ^9-10. وكما ذكر أعلاه، فإن الخلايا المشتقة من hPSC فقط التي يمكن تحديدها على أنها مجموعات خلايا جذعية متعددة القدرات خالية من الخلايا هي الخلايا المناسبة لزرع البشر. قد لا يتحقق الوصول إلى هذا المستوى من الصرامة بتمريرة واحدة من خلال تقنية فرز الخلايا بوساطة الأجسام المضادة. وقد يلزم إعادة زراعة السكان المخصبين من الخلايا المستهدفة المتمايزة والجولات اللاحقة لفرز الخلايا للحصول نهائيا على عينات متعددة القدرات خالية من الخلايا الجذعية.

في مختبرنا، قمنا على نطاق واسع بتوصيف جسمين مضادين لسطح الخلية hES، TG30 (CD9) و GCTM-2، للكشف عن الخلايا الحية متعددة القدرات. وقد أظهرت دراساتنا أن الكشف المشترك بين كل من TG30 وGCTM-2 يرتبط ارتباطا وثيقا مع التعبير عن الجينات الكنسية المرتبطة pluripotency في خطوط hESC ^5-7. TG30/GCTM-2 FACS مناعة أظهرت باستمرار أن الثقافات hESC تشكل تدرجا كميا مستمرا للتعبير TG30/GCTM-2 ^5-7. لقد أنشأنا بشكل تعسفي أربعة مجموعات سكانية (P) من الخلايا داخل هذا التدرج TG30/GCTM-2: P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)، P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low)، P6 (TG30 Mid-GCTM-2^Mid)و P7 (TG30 Hi -GCTM-2^Hi) ^5-7. وقد أظهر وصفنا لهذه المجموعات خلايا P4 و P5 و P6 و P7 أن الكسور الفرعية P6 و P7 تعبر عن عدد كبير من الجينات المرتبطة بالانبعاس إلى متعددة الأشكال وتشكل بكفاءة مستعمرات تشبه الجذعية عند إعادة زراعة ما بعد FACS ^2-3. من ناحية أخرى، P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)الخلايا تعبر عن عدد كبير من علامات التمايز وتشكل أنواع الخلايا المتمايزة تلقائيا التي تحدث عادة في توسيع ثقافات خطوط hESC ^5-6. قررنا اختبار إمكانات FACS TG30/GCTM-2 للإزالة الانتقائية لمركبات الكربون الهيدروفلورية المتبقية بعد التمايز في المراحل المبكرة، وكذلك لإثراء مجموعات الخلايا الجذعية متعددة القدرات. البروتوكول المذكور أدناه يبين كيفية جمع وإعادة زراعة P4 متمايزة (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) خلايا ما بعد FACS لإنجاز تطهير P7 متعدد القدرات (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا). وعلاوة على ذلك، فإننا نفسر أيضا جمع وإعادة زراعة خلايا P7 متعددة القدرات (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)للحصول على ثقافة غنية من الخلايا متعددة القدرات، والتي يمكن استخدامها لاحقا كمحتوى مدخلات محدد لزيادة كفاءة واتساق المقايسات التفاضلية.

البروتوكول

تم تنفيذ البروتوكول التالي باستخدام hESC-MEL1¹¹ الثقافات السائبة القياسية التي تقدمها منشأة StemCore في جامعة موناش (ملبورن). يتم استزراع خط الخلية هذا بشكل روتيني على طبقة من الخلايا الليفية الجنينية الماوس المعطل بشكل ميتوتي (MEFs) في bFGF تكمل hESC / KOSR media⁷ ويتم الحفاظ عليها مع الانزيمية الفصام (Collagenase) كل 5-7 أيام⁸. تستخدم ثقافات hESC التي نمت إلى ~ 80٪ التقاء في 75 سم² (T75) كتجمعات مدخلات لهذا البروتوكول. يجب تنفيذ جميع إجراءات معالجة الخلايا الموضحة أدناه في ظل ظروف مطهرة في خزانة السلامة الحيوية من الفئة II التي تمت تصفيتها من HEPA.

قبل يومين من إجراء اختبار TG30/GCTM-2 FACS، قم بإعداد لوحات ثقافة T75 (الموضحة في القسم 1) التي سيتم استخدامها لإعادة زراعة الخلايا المستردة بعد FACS (الموضحة في القسم 4).

1. بذر MEFs وإعداد المتوسطة مكيفة MEF

1.1 يوم -2: طلاء MEFs في قوارير T75

1. ماصة 10 مل من 0.1٪ ث / الخامس الجيلاتين في كل قارورة T75 وإمالة لمعطف السطح بالتساوي.
2. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في خزانة السلامة البيولوجية.
3. أسبيرات الجيلاتين الحل.
4. أضف 20 مل MEF-medium إلى القارورة وقبل التوازن إلى 37 درجة مئوية /5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية.
5. لوحة Mitotically تعطيل MEFs على قارورة (ق) أعدت في الكثافات التالية. لبذور الكثافة 1/3 MEF 1.4 × 10⁴ خلايا / سم² (T75 = 1 × 10⁶ MEFs). لبذور MEF ذات الكثافة الكاملة 5.3 × 10⁴ خلايا / سم² (T75 = 4 × 10⁶ MEFs).

ملاحظة: نستخدم بشكل روتيني ملفات MEFs التي تم تعطيلها بشكل ميتوتيك من خلال γ الإشعاع. يمكن العثور على بروتوكول لإعداد γ المشععة MEFs في Michalska¹².

6. احتضان ثقافات MEF المشععة عند 37 درجة مئوية / 5٪_من ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. يمكن احتضان قوارير 1/3 لمدة 1-4 أيام دون تغيير متوسط MEF. وتستخدم هذه القوارير لإعادة تسلخ خلايا ما بعد FACS (كما هو الحال في البروتوكول 4). يتم احتضان قوارير MEF الكاملة بين عشية وضحاها لتوليد CM وفقا لما يلي في الخطوة 1.2.

1.2 يوم -1: إعداد المتوسطة المكيفة (CM)

1. أسبيرات MEF المتوسطة من قوارير T75 MEF الكامل.
2. إضافة ما قبل متساوية 25 مل hESC / KOSR المتوسطة تكملها مع 5 نانوغرام / مل الإنسان FGF-2 لكل قارورة T75. حضانة في 37 درجة مئوية / 5 ٪_CO2 لمدة 24 ساعة.
3. جمع المتوسطة مكيفة MEF (CM) في أنبوب زراعة الأنسجة العقيمة، ملحق CM الطازجة مع 10 نانوغرام / مل الإنسان FGF-2 ومرشح باستخدام مرشح البولي إيثرسولفون 0.22 ميكرومتر.
4. لإنتاج CM إضافية كرر الخطوتين 1.2.2 و 1.2.3 يوميا على نفس الثقافة MEF لمدة أسبوع واحد.

في يوم إجراء اختبار TG30/GCTM-2، استبدل MEF-medium في قوارير MEF T75 بسي إم وما قبل الاعتدال لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بذر أي hESCs أو خلايا مشتقة من hESC تم استردادها من الإجراء كما هو موضح أدناه. يستخدم CM إما طازجة أو مخزنة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. يستخدم CM في هذا البروتوكول كما هو الحال في أيدينا أنه يزيد من صلاحية خلايا ما بعد FACS مقارنة مع وسائل الإعلام غير مشروطة (النتائج غير مبين).

2. أداء TG30/GCTM-2 FACS المقايسة: تفكيك الثقافات السائبة hESC إلى خلايا واحدة

ملاحظة: بريشيل 20٪ FBS/DMEM-F12 المتوسطة عند 4 درجة مئوية.

1. يستنشق وسائط hESC/KOSR من قارورتين T75 مع خط hESC مثقف.
2. شطف الخلايا في كل T75 مع 10 مل DPBS و أسبيرات لإزالة.
3. إضافة 3 مل TrypLE Express حل التفكك في كل قارورة T75. حضانة في 37 درجة مئوية / 5 ٪_CO2 لمدة 5 دقائق.
4. عثرة على جانب من القوارير للحصول على طرد كامل من الخلايا. تحقق تحت المجهر. إذا لم تطرد الخلايا بسهولة، فاحتضن لمدة 2-3 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية/5٪ من ثاني أكسيد الكربون_2.
5. إضافة 10 مل 20٪ FBS/DMEM-F12 (أبقى في 4 درجة مئوية) إلى كل قارورة T75. باستخدام المصصة 10 مل معقمة triturate بلطف الخلايا المفككة عدة مرات ضد جدار القارورة لتحقيق تعليق خلية واحدة في الغالب.
6. ضع مصفاة خلايا 70 ميكرومتر على أنبوب البولي بروبلين المعقم 50 مل. استخدام ماصة 10 مل معقمة لإجبار تعليق خلية واحدة hESC تجمع من قوارير T75 اثنين من خلال مصفاة.
7. تجاهل مصفاة الخلية، واستبدال غطاء أنبوب والطرد المركزي تعليق hESC المجمعة في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة.
8. تجاهل supernatant وغسل الخلايا عن طريق إعادة استخدام بلطف بيليه في 10 مل 20٪ FBS/DMEM-F12 (prechilled في 4 درجة مئوية).
9. إجراء جهاز طرد مركزي ثان عند 1000 × ز لمدة دقيقتين.
10. تجاهل supernatant، إضافة 10 مل 20٪ FBS/DMEM-F12 (prechilled في 4 درجة مئوية) وتريتورات بلطف إلى خلايا ريسوبيند. ضع أنبوب 50 مل على الجليد. سيتم استخدام هذا الأنبوب لإجراء تحديد عينات الفرز المناعي الموضحة أدناه.
11. خذ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية الواحدة hESC (الخطوة 2.10) لعد عدد الخلايا باستخدام مقياس المحركات. يجب أن تتوقع عائد 10-15 مليون خلية لكل قارورة T75.

ملاحظة: يستخدم نظام FBS في هذا الجزء من البروتوكول لزيادة صلاحية الخلية بعد FACS.

3. تلطيخ immunofluorescent من مستضدات سطح الخلية TG30 وGCTM-2

1. Aliquot 150 ميكرولتر (~ 100،000 خلية) من تعليق خلية واحدة hESC (من الخطوة 2.11) في كل من أنابيب الطرد المركزي الدقيق الستة من 1.5 مل. سيتم استخدام هذه الاقتباسات الستة لعناصر التحكم في التلطيخ المطلوبة لمعايرة المقايسة على جهاز FACS. المتبقية ~ 9 مل تعليق الخلية سيكون عينة الفرز الخاص بك في الثقافة التي فصلت سوف تكون ملطخة للكشف عن TG30 وGCTM-2، وفقا للجداول 1 و 2.
2. إجراء ردود فعل ملزمة من الأجسام المضادة الأولية في 20٪ FBS/DMEM-F12. يجب أن تكون أحجام التفاعل النهائي ~ 9 مل لعينة الفرز و 200 ميكرولتر للعناصر التحكم. تضمين عناصر تحكم متساوية النوع كأجسام مضادة أساسية. ضع الأنابيب أفقيا على الجليد واخلطها برفق لمدة 30 دقيقة على منصة هزازة.
3. أجهزة الطرد المركزي الأجسام المضادة الأولية ردود الفعل في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة.
4. تجاهل supernatant وغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق بيليه في 20 مل 20٪ FBS/DMEM-F12 (prechilled في 4 درجة مئوية) لعينة الفرز و 200 ميكرولتر للضوابط.
5. أداء تدور الثانية في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة.
6. إجراء ردود فعل ملزمة من الأجسام المضادة الثانوية في 20٪ FBS/DMEM-F12. يجب أن تكون أحجام التفاعل النهائي 2.5 مل لعينة الفرز و200 ميكرولتر للعناصر التحكم. إعداد PE-مكافحة الماوس CD90.2 أنبوب رد الفعل في هذه المرحلة. ضع الأنابيب أفقيا على الجليد واخلطها برفق لمدة 30 دقيقة على منصة هزازة.

ملاحظة: خلال فترة الحضانة هذه، من المريح جمع CM وإعداد قوارير MEF T75 مع CM كما هو الحال في القسم 1.2.

7. أجهزة الطرد المركزي الأجسام المضادة الثانوية ردود الفعل في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة.
8. تجاهل supernatant وغسل الخلايا مرتين عن طريق إعادة تعليق بيليه في 20 مل 20٪ FBS/DMEM-F12 (prechilled في 4 درجة مئوية) لعينة الفرز و 200 ميكرولتر للضوابط.
9. قم بإجراء دوران بمعدل 1000 × غرام لمدة دقيقتين بعد كل غسل ووضع أنابيب على الجليد.
10. تجاهل المضادات العملاقة وكريات الخلايا ريسوسبند في 20٪ FBS/DMEM-F12 تكملها يوديد البروبيديوم (PI) في 0.3 ميكروغرام /مل. استخدم 2-3 مل لعينة الفرز و300 ميكرولتر للعناصر التحكم.

ملاحظة: لا تقم بإضافة PI إلى أنبوب التحكم مع خلايا غير ملطخة.

11. استخدام P1000 micropipette لإجبار كل تعليق الخلية الفردية من خلال 35 ميكرومتر غطاء مصفاة الخلية, إلى جانب 5 مل أنبوب البوليسترين جولة أنابيب الاختبار القاع.
12. جهاز طرد مركزي 50 غرام/ دقيقة لفرض من خلال تعليق الخلية المتبقية على أغطية مصفاة.
13. إعادة إنفاق كل تعليق خلية واحدة عن طريق النقر على جانبي الأنابيب، ووضعها على الجليد. خلاياك جاهزة الآن ل FACS. يرجى المضي قدما على الفور.

4. ثقافة ما بعد FACS من TG30/GCTM-2 خلايا الانكسار الفرعي في 75 سم² (T75) قوارير

1. لقد سبق أن أبلغنا عن كيفية إعداد جهاز FACS ل TG30/GCTM-2 مناعة⁷. يسمح الإجراء باسترداد hESCs واحدة قابلة للتطبيق ، خالية من MEFs ، وداخل بوابات P4 (TG30^Neg- GCTM-2^Neg)، P5 (TG30^Low- GCTM-2^Low)، P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)و P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) - انظر الشكل 1E. إعداد جهاز FACS ل TG30/GCTM-2 FACS كما هو الحال في تقريرنا السابق لاسترداد الكسور الفرعية الخلية لاستخدامها بعد ذلك.
2. إضافة 1 مل CM, أعدت كما هو الحال في الخطوة 1.2, إلى كل من اثنين من أنابيب اختبار 5 مل البوليسترين الجولة القاع قبل جمع الخلايا من آلة FACS. ضعه على الثلج
3. استعادة 400،000 خلية لكل من P4 متباينة (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) وP7 متعدد القدرات (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)الخلايا الفرعية باستخدام TG30/GCTM-2 FACS.
4. الطرد المركزي أنابيب جمع في 1000 × ز لمدة 5 دقائق.
5. يستنشق الحشرات الخارقة. إضافة 1 مل مسبقة 37 درجة مئوية / 5٪ CO₂ CM لإعادة إنفاق كل بيليه الخلية باستخدام ميببولتور P1000. زرع الخلايا لكل كسر على قارورة MEF T75 1/3 قبل التوازن مع CM (معدة وفقا للخطوة 1.2)
6. الثقافة عند 37 درجة مئوية/5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية.
7. أسبيرات CM يوميا واستبدالها مع CM أعدت حديثا (كما هو الحال في الخطوة 1.2) لمدة أسبوعين تقريبا. ثقافات P7 متعدد القدرات (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)تظهر الخلايا المستعمرات البشرية الجذعية مثل بعد أسبوع واحد وتصل إلى ~ 80٪ التقاء في 9-11 يوما. ثقافات P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)تنمو الخلايا في الغالب كحديقة من الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية التي تصل إلى التقاء في 11-13 يوما. في هذه المرحلة، إذا لزم الأمر، يمكن استخدام ثقافات الخلايا P4 و P7 ل TG30/GCTM-2 FACS بوساطة إعادة زراعة متتالية إما P4 أو P7 subfractions (انظر الشكلين 2 و 3).

النتائج

hESC-المشتقات التي هي متعددة القدرات الخلايا الجذعية الخالية يمكن الحصول عليها عن طريق تمرير متتالية من الخلايا من P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) تحت الانكسار.

وقد أثبتت التقارير السابقة أن في الثقافات القياسية hESC خليط من السكان الفرعيين تتعايش تظهر تدرج التعبير من الجينات المرتبطة pluripotency^5,6,13. الكشف المشترك عن مستضدات سطح الخلية مثل TG30 (CD9) و GCTM-2 يسمح بالتمييز بين عدد من المجموعات الفرعية من الخلايا في مرحلة متعددة القدرات وفي مراحل مختلفة من التمايز المبكر ، كما هو مبين في تعبيرهم عن علامات الخلايا الجذعية وعوامل النسخ المحددة^{النسب 5،6،13}. بالاتفاق مع التقارير السابقة، كنا قادرين على التمييز P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)،P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low)،P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)،وP7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)خلايا في خط hESC-MEL1 المستخدملهذه الدراسة (الشكل 1). مع هذه النتيجة، شرعنا في جمع P4 متباينة (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)خلايا وP7 متعدد القدرات (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)خلايا لمزيد من الثقافة في الدراسات المذكورة أدناه.

لقد حققنا فيما إذا كان استخدام نهج الاختيار السلبي يمكننا تطهير hESCs غير المتمايزة من مجموعات الخلايا التي تمر بمرحلة مبكرة جدا من التمايز (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). استخدمنا عددا محددا من P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)الخلايا التي تم استزراعها على التوالي بعد FACS(الشكل 2A)لمدة أسبوعين تقريبا ، وإعادة دمجها باستخدام TG30/GCTM-2 FACS قبل إعادة الصياغة في كل مقطع. وأظهرت النتائج أن P4-subfraction المخصب ل TG30^Neg-GCTM-2^Neg أنواع الخلايا المتمايزة بعد التمرير المتتالي، ووجود طفيف من P7 (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)الخلايا في المقطع الأولي(الشكل 2A،الممر 1) اختفى في نهاية المطاف بعد مزيد من التمرير، لتصبح عينات متعددة القدرات خالية من الخلايا الجذعية (الشكل 2A، الممر 3).

ويمكن تحقيق إثراء خلايا hESC متعددة القدرات عن طريق جمع خلايا TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا الخلايا.

واستنادا إلى الملاحظات السابقة باستخدام هذا المقايسة، نتوقع إثراء hESCs متعددة القدرات من خلال جمع P7 (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)الخلايا التي ينبغي أن تشكل مستعمرات hESC. لذلك، حققنا أيضا TG30/GCTM-2 FACS بوساطة تمرير متتالية من P7 متعدد القدرات (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)الخلايا. في هذه الثقافات P7، تم إجراء TG30/GCTM-2 FACS مناعة قبل إعادة صياغة الخلايا في كل ممر وتم إعادة زراعة الخلايا P7 فقط (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). وبهذه الطريقة، لاحظنا أن غالبية الخلايا كانت موجودة في الكسور الفرعية المرتبطة ب المتعددة الخلايا (P6 و P7)، مما يشير إلى إثراء خلايا متعددة القدرات التي حافظت أيضا على القدرة على التمييز وتوليد نسبة صغيرة من P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) خلايا (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، أظهرت ثقافات خلايا P7 عددا كبيرا من المستعمرات الشبيهة ب hESC أثناء التمرغ(الشكل 3B)،مما يشير أيضا إلى الحفاظ على حالة متعددة الخلايا.

الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 استراتيجية الفرز التمثيلي للحصول على الكسور الفرعية TG30/GCTM-2 FACS. (أ): يتم فرز تعليق خلية hES المفكك كخلايا مفردة ويتم ربط الكتل أو المزدوجات المحتملة مع التشتت الأمامي للارتفاع والمنطقة (FSC-H و FSC-A). (ب): تتم إزالة الحطام المحتمل باستخدام FSC-A و SSC-A، ويتم فرز الخلايا السليمة فقط. (ج): يتم استبعاد الخلايا غير القابلة للحياة على أساس فلورية يوديد البروبيديوم (PI) (FSC-A و FL3-A). (د): تم بوابة الخلايا المغذية MEF من قبل الاختيار السلبي على أساس التعبير عن الماوس CD90.2-PE (FL2-A و SSC-A). (هاء): يتم تقسيم جزء hESC القابل للتطبيق المعزول ، الخالي من مغذيات MEF ، أخيرا إلى P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)، P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low)، P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)، وP7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)subpopulations. البوابة السلبية (TG30^Neg-GCTM-2^Neg، المسمى P4) تم تعيينها وفقا للفلورة التلقائية الخلفية للخلايا غير الملطخة وكذلك لعناصر التحكم متساوية النمط. (واو): النسب المئوية لمختلف الملوثات الفرعية المسورة النموذجية لتحليل قياس الخلايا التدفقي TG30/GCTM-2. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.

الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم الثقافات التمثيلية المتتالية للخلايا P4 المتمايزة تلقائيا (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)من خط hESC-MEL1. (أ): مؤامرات FACS TG30/GCTM-2 التمثيلية التي تعرض مجموعات فرعية مسورة من الخلايا (P4 و P5 و P6 و P7) التي تم التمييز عليها من خلال مستوى التعبير المكتشف عن علامات سطح الخلية TG30 و GCTM-2. يتم جمع السكان الأولية من 400،000 hESC-المشتقات التي تعرض P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)مناعة من الثقافات السائبة من خط hESC-MEL1. هذه P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)يتم تمرير خلايا ما بعد FACS على التوالي في ظروف داعمة لتجديد hESC في قوارير T75 ، حتى الوصول إلى التقاء (11-13 يوما). قبل كل مرور، يتم تنفيذ TG30/GCTM-2 FACS لجمع وإعادة زراعة فقط P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) أنواع الخلايا المتمايزة. (ب): مورفولوجيا نموذجية من العشب من P4 متمايزة (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)خلايا بعد 14 يوما. (ج): متفرقة مثل hESC المستعمرات ينظر بعد 14 يوما تختلط مع العشب من P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)الخلايا في الممر 1 فقط، هي الأكثر احتمالا التي تم إنشاؤها عن طريق تلويث P7 (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)الخلايا. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.

الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن P7 (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)الخلايا المستمدة من خطوط hESC يمكن تمريرها على التوالي بعد FACS دون أن تفقد خصائصها متعددة القدرات الجوهرية. ممثل TG30/GCTM-2 FACS مناعة المقاطع المتتالية المختلفة، والتي تبين المجموعات الفرعية التمييزية من الخلايا (P4، P5، P6، و P7) وفقا لمستوى التعبير عن TG30 و GCTM-2. (أ): يتم استرداد السكان بدءا من 400،000 الخلايا التي تظهر P7 (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)الخصائص من الثقافات السائبة من خط hESC-MEL1. يتم تمرير خلايا P7 متعددة القدرات (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)على التوالي بعد FACS في ظروف داعمة لتجديد hESC في قوارير T75 ، حتى تصل إلى ~ 80٪ التقاء (9-11 يوما). TG30/GCTM-2 يتم إجراء faCS المناعية قبل إعادة صياغة الخلايا في كل مرور ويتم إعادة زراعة الخلايا فقط theP7 (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا). تظهر النتائج أن خلايا P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)تحافظ على خصائصها المتعددة القدرات مع التمرير اللاحق ، بما في ذلك الحفاظ على (TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا)التعبير، وتشكيل المستعمرات مثل hESC (هو مبين في B)والحفاظ على القدرة على التفريق كما يمكن استنتاجها من تلخيص جزء صغير من P4 متفاوتة (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) في كل من التدرجات FACS. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.

عينة (وحدات تخزين التفاعل)	الأجسام المضادة الأولية	الأجسام المضادة الثانوية	PE الفئران المضادة للفأرة CD90.2 ب	بروبيديوم يوديد ج
عينة الفرز (~ 9 مل ل ABs الأولية، 2.5 مل ل ABs الثانوية)	(TG30 + GCTM-2) أ	AF 488 الماعز المضادة للفأرة IgG2a + AF 647 الماعز المضادة للفأرة IgM	+	+
التحكم-1: TG30 (200 ميكرولتر)	TG30	AF 488 الماعز المضادة للفأرة IgG2a	-	+
التحكم-2: GCTM-2 (200 ميكرولتر)	GCTM-2	AF 647 الماعز المضادة للفأرة IgM	-	+
التحكم-3: CD90.2 مكافحة الماوس (200 ميكرولتر)	-	-	+	+
التحكم-4: فيكوريثرين (PE) (200 ميكرولتر)	ماوس IgG2a ايزوتيبي	R-phycoerythrin الماعز المضادة للفأرة IgG2a	-	+
التحكم-5: الماوس المناعي الغلوبولين isotype (200 ميكرولتر)	ماوس IgG2a isotype + ايزوتيب IgM	AF 488 الماعز المضادة للفأرة IgG2a + AF 647 الماعز المضادة للفأرة IgM	-	+
التحكم-6: خلايا غير ملونة (200 ميكرولتر)	-	-	-	-

الجدول 1 - الجداول فرز العينة وعناصر التحكم لفرز FACS. ^أ عينة الفرز ملطخة بالمناعة في وقت واحد مع الأجسام المضادة TG30 و GCTM-2. ^ب PE-مكافحة الماوس CD90.2 يستخدم للتعرف على خلايا الماوس وإزالة ملفات الاستثمار متعددة الاستخدامات من hESCs أثناء FACS¹⁴. ^ج يتم استبعاد الخلايا غير القابلة للحياة باستخدام يوديد البروبيديوم بتركيز نهائي قدره 0.3 ميكروغرام / مل. وأضاف كاشف (+)، لا تضاف (-) إلى أنبوب رد الفعل.

جسم	مضيف	ايزوتيبي	تخفيف العمل
TG30 (1.4 ملغم/مل)	فأر	IgG2a	1:1,000
GCTM-2 (هجينوما فائقة)	فأر	IgM	1:5 ~ 1:10
AF 488 الماعز المضادة للفأرة IgG2a	ماعز	متعدد النسيلة	1:500
AF 647 الماعز المضادة للفأرة IgM	ماعز	متعدد النسيلة	1:500
R-phycoerythrin (PE) الماعز المضادة للفأرة IgG2a	ماعز	متعدد النسيلة	1:1,000
CD90.2 مكافحة الماوس	جرذ	IgG2b	1:100
تنقية الماوس IgG2a, κ التحكم Isotype	فأر	IgG2a	1:200
تنقية الماوس IgM, κ التحكم Isotype	فأر	IgM	1:200

الجدول 2 - الأرباح تفاصيل الجسم المضاد والتخفيفات لفرز FACS. ^(أ) نظرا للتعبير العالي جدا عن GCTM-2 على سطح الخلية في مركبات الكربون الهيدروفلورية، لا يمكن الوصول إلى التشبع بهذا الجسم المضاد. يجب أن يتم ثدي كل دفعة من GCTM-2 الهجين supernatant ضد عنصر تحكم قياسي أو دفعة سابقة للحصول على نتائج مماثلة مع hESCs في الحجم وتجنب أكثر من تلطيخ.

اسم الوسيط	تكوين
hESC/KOSR متوسط	Dulbecco النسر المعدلة المتوسطة: خليط المغذيات F-12 (DMEM/F-12) تكملها مع 20٪ استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية البشرية 2 (FGF-2) والقلم / ستريب في 1x.
متوسط MEF	دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة، وارتفاع الجلوكوز (DMEM) تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنين (FBS)، 2 M غلوتاماكس، والقلم / ستريب في 1x.

الجدول 3 - الأرباح تكوين وسائل الإعلام الثقافية.

المناقشة

في السياق السريري ، أنواع الخلايا الجسدية المتمايزة هي المنتج النهائي المطلوب للزرع والتطبيقات العلاجية ، وhPSC هي مصدر ذاتي التجديد وقابل للتطوير لتوليد تلك الخلايا الجسدية أو ذريتها في المختبر. وجود hESCs المتبقية غير المتمايزة مع إمكانية متأصلة لتشكيل المسخ هو خطر على السلامة عند النظر في الخلايا الجسدية المشتقة من hESC لزرعها في المرضى. لمراجعة هذه المخاطر وغيرها من المخاطر المرتبطة بالعلاج بالخلايا يرجى الاطلاع على شارب وآخرون. ¹⁶ ولذلك، لتحقيق مثل هذه التطبيقات، من الضروري أن يهدف الباحثون إلى توليد مجموعات مستهدفة من الخلايا التي هي أيضا متعددة القدرات خالية من الخلايا الجذعية. وتحقيقا لهذه الغاية، فإننا نثبت هنا أنه باستخدام منهجية TG30/GCTM-2 FACS، من الممكن رصد وجود خلايا متعددة القدرات (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)في مجموعة خلايا متمايزة والحصول على مشتقات قابلة للحياة متمايزة من hESC يمكن إثراءها وإعادة استزراعها بعد FACS. على الرغم من أنه ليس من الممكن الحصول على عينات خالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات بنسبة 100٪ مع تمريرة واحدة من بروتوكولنا ، يمكن إعادة زراعة مشتقات hESC المخصبة وبعد تمرير متتالي يتم تحقيق نقاء الخلايا الجسدية بنسبة 100٪. كما أن الجدوى الواضحة للخلايا الجسدية للتوسع بعد FACS تسمح أيضا بإنتاج أعداد كافية من الخلايا المناسبة لعلاجات الزرع المحتملة.

دفعتنا النتائج المشجعة لهذه الدراسة التجريبية إلى إجراء تحقيق أكثر شمولا باستخدام بروتوكول TG30/GCTM-2 في دراسة مقارنة مع العديد من خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSC)^15. في تلك الدراسة، وجدنا أن العينات الخالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول FACS TG30/GCTM-2 لم تولد المسخ عند زرعها في الفئران المحرومة من المناعة. لذلك، يمكننا أن نقول بثقة أنه مع استخدام هذا البروتوكول في المختبر، في مرحلة مبكرة التمايز ثقافات الخلية مصممة على أن تكون خالية من TG30 متعدد القدرات^مرحبا-GCTM-2^مرحبا الخلايا لا تتطور المسخ في الجسم الحي. وهذا يدعم بقوة قوة المقايسة لدينا، وتوفير نهج محتمل للقضاء على خطر تكوين المسخ قبل استخدام الخلايا المشتقة من hPSC في التطبيقات السريرية.

وعلى العكس من ذلك، فإننا نظهر أيضا أن TG30/GCTM-2 FACS يمكن استخدامها في استرداد مجموعة خلايا متعددة القدرات مع مستوى عال من التعبير عن هذين المستضدين السطحيين (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). وقد أظهرت الدراسات السابقة أن TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا الخلايا تظهر أعلى ارتباط مع OCT4^مرحبا التعبير وتشكل أكبر عدد من المستعمرات مثل hESC^5,6,13,15. ولذلك السبب أن يتم تنشيط شبكة متعددة المستويات في مستوياتها القصوى في TG30^مرحبا-GCTM-2^مرحبا التعبير عن الخلايا. ونحن نعتبر أن استخدام بروتوكولنا TG30/GCTM-2 FACS واسترجاع P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)يمكن أن تسمح لتنقية واسعة النطاق لثقافات hESC الحية المخصبة ، كمدخلات لمقايسات التمايز.

في الختام، نحن نثبت هنا إمكانية عمليات الفحص الخاصة ب FACS استنادا إلى التعبير المشترك للمضادين السطحيين TG30 و GCTM-2 لكل من تطهير وإثراء hESCs. ومن المرجح أيضا أن تكون الدراسات المقبلة التي تحتوي على بروتوكولات للتمايز الموجه بين مركبات الكربون الهيدروفلورية مفيدة فيما يتعلق بهذه الإمكانية. ونحن ندرك أنه في بعض المقايسات حيث المتمايزة hESC-المشتقات تعبر مؤقتا TG30 (CD9) أو GCTM-2، قد لا تكون هذه الأجسام المضادة اثنين مناسبة أو كافية لتطهير الخلايا متعددة القدرات من السكان المتمايزة في نقطة زمنية معينة في المقايسة⁶. لذلك، هناك حاجة مستمرة لإيجاد أجسام مضادة جديدة تعترف على وجه التحديد بمركبات hESCs الحية للتغلب على الحد المحتمل من التفاعل المتبادل مع بعض أنواع الخلايا المتباينة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
DMEM / F-12	Life	Technologies 11320082	اسم طويل: Dulbecco's Modified Eagle Medium: خليط المغذيات F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	اسم طويل: Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	اسم طويل: مكمل GlutaMAX
الأحماض الأمينية غير الأساسية	تقنيات الحياة	11140050	اسم طويل: MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية
Mercaptoethanol	تقنيات الحياة	21985023	اسم طويل: 2-Mercaptoethanol
DPBS	Life Technologies	14190250	اسم طويل: محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، بدون كالسيوم ، لا مغنيسيوم
TrypLE Express	Life Technologies	12604039	اسم طويل: TrypLE Express (1x) ، بدون فينول أحمر
AF-488	Life Technologies	A21131	الاسم الطويل: Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	الاسم الطويل: Alexa Fluor 647 الماعز المضاد للفأر IgM
PE-anti IgG2a	Life Technologies	P21139	الاسم الطويل: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (& gamma; 2 أ) اقتران
DMEM	Life Technologies	11965-092	الاسم الطويل: Dulbecco's Modified Eagle Medium ، تقنيات
القلم / البكتيريا العقدية	عالية	الجلوكوز 15140-122	الاسم الطويل: البنسلين الستربتومايسين ،
تقنيات الحياة	في الماء المقطر	15230-089.	اسم طويل: ماء مقطر معقم
PI	SIGMA	P4864	اسم طويل: محلول يوديد البروبيديوم
FBS	SIGMA	12203C	اسم طويل: مصل الأبقار الجنيني
الجيلاتين	SIGMA	G-1890	اسم طويل: الجيلاتين من جلد الخنازير
البشري FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	اسم طويل: عامل نمو الخلايا الليفية أساسي ، مؤتلف بشري ، خال من
مرشح 0.22 & mu ؛ م	ميليبور	SCGPU02RE	اسم طويل: Stericup-GP ، 0.22 & mu ؛ م ، بولي إيثر سلفون ، 250 مل ، معقم بالإشعاع
70 مو ؛ مصفاة الخلية m	Becton Dickinson	352350	اسم طويل: مصفاة خلية مع 70 مو ؛ م شبكة نايلون
35 & مو ؛ م مصفاة خلية الغطاء ، أنبوب 5 مل	Becton Dickinson	352235	اسم طويل: أنبوب اختبار دائري من البوليسترين 5 مل ، مع غطاء مصفاة خلية (35 & mu ؛ م)
5 مل من البوليسترين أنبوب اختبار القاع المستدير	Becton Dickinson	352054	اسم طويل: 5 مل من البوليسترين أنبوب اختبار القاع المستدير ، معقم
IgG2a التحكم في النمط المماثل	Becton Dickinson	554126	اسم طويل: الماوس المنقى IgG2a ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشاحي
IgM التحكم في النمط النظيري	Becton Dickinson	553472	اسم طويل: Purified Mouse IgM ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	اسم طويل: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
معايرة 8 قمم	Becton Dickinson	559123	اسم طويل: جزيئات معايرة قوس قزح (8 قمم)
50 مل أنبوب بولي بروبلين معقم	Greiner Bio-One	227261	اسم طويل: أنبوب بولي بروبلين 50 مل مع قاع مخروطي ،
قارورة معقمة T75	Greiner Bio-One	658175	اسم طويل: CELLSTAR غطاء مرشح ثقافة الخلايا 75 سم < سوب > 2 < / sup> قوارير
TG30	Merck Millipore	MAB4427	اسم طويل: الجسم المضاد TG30 ، استنساخ TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	الاسم الطويل: GCTM-2 غير متوفر تجاريا ولكن TG343 والجسم المضاد أحادي النسيلة المكافئ هو
آلة FACS	Becton Dickinson		FACSVantage SE مع خيار FACSDiva
المجهر المقلوب	أوليمبوس		IX71<