نقدم بروتوكول للتحقيق في المختبر المضخات هروب رأس المال من الزائفة الزنجارية. هذا البروتوكول يسمح لتوليد قوية، عكسها، والانضباطي التدرج بروتون داخل الغشاء الحويصلية، وبالتالي يجب أن تكون قابلة للتكيف مع أي بروتين الغشاء تنشيط من قبل قوة protomotive.
مقالة منهجية
في المختبر التحقيق في هروب رأس المال مضخة MexAB من الزائفة الزنجارية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هناك حاجة العلمية الناشئة عن أدوات موثوقة لرصد غشاء النقل البروتين. نقدم منهجية تؤدي إلى إعادة تشكيل مضخات هروب رأس المال من البكتيريا سالبة الجرام الزائفة الزنجارية في بيئة بيوميمتيك التي تسمح لإجراء تحقيق دقيق لنشاطهم النقل. يتم استيفاء ثلاثة شروط مسبقة: تحاوز في بيئة شحمي، استخدام مؤشر ذات الصلة للنقل، وتوليد التدرج بروتون. يتم إعادة تشكيل غشاء نقل البروتين في الجسيمات الشحمية جنبا إلى جنب مع جرثومي، وضوء تنشيط مضخة البروتون الذي يولد التدرج بروتون الذي هو قوي وكذلك عكسها والانضباطي. واستخلص من نشاط البروتين من اختلافات درجة الحموضة التي تحدث داخل الحويصلية، وذلك باستخدام pyranin، التحقيق الفلورسنت التي تعتمد على درجة الحموضة. وصفنا خطوة بخطوة الإجراء حيث تنقية البروتين غشاء، وتشكيل الحويصلية، البروتين إعادة، والنقل وnalysis يتم معالجتها. على الرغم من أنها تم تصميمها خصيصا لنقل التجمع الوطني الديمقراطي، يحتمل أن تتكيف الأساليب المذكورة للاستخدام مع أي نقل البروتين غشاء أخرى تنشط بها التدرج بروتون.
المقدمة
بروتينات الغشاء لا يتجزأ تمثل ما يصل إلى 30٪ من الجينات المشفرة في الجينوم حقيقية النواة. إلا أنهما يشتركان أدوار محورية مثل حفظ بوابة (مستقبلات)، ونقل المواد المغذية، الأيونات أو المركبات الضارة (النقل) أو الحفاظ على نفاذية الغشاء عبر طبقات ثنائية (قنوات) بين جميع الخلايا الحية 1. مضخات هروب رأس المال دورا رئيسيا في المقاومة ضد العلاج بالمضادات الحيوية 2. في البكتيريا سالبة الجرام الزائفة الزنجارية، والتي هي محمية من قبل الغشاء الخارجي، ويتم تنظيم نقل هروب رأس المال كما نظم الثلاثي حيث MexB، مضخة هروب رأس المال الموجود في الغشاء الداخلي، يعمل جنبا إلى جنب مع MexA، وهو بروتين محيط بالجبلة، وOprM، و قناة الغشاء الخارجي. يعمل بروتين الغشاء الداخلي حشوية كما مضخة تعتمد على الطاقة مع خصوصية الركيزة واسعة. يعمل بروتين الغشاء الخارجي باعتباره porin بينما هو ثلث الموجود في الفضاء محيط بالجبلة ويعتقد لتحقيق الاستقرار في مجمع كامل 3. في ما يلي، ونحن نركز على تصميم مقايسة وظيفية للجمعية MexA MexB.
التي تراكمت لديها المعلومات الهيكلية على مدى 5 سنوات الماضية وذلك بفضل تقرير الأشعة السينية من AcrB البروتين مثلي من الإشريكية القولونية 4-7. على الرغم من أنه من الواضح أن مهمة لزوجين هذه المعلومات مع البيانات الديناميكية والحركية، وتصميم مقايسة وظيفية لهذا نقل هو التحدي الحقيقي 8. في الواقع، لا بد من الحفاظ على غشاء بروتينات في بيئة الغشائي ويجب المحافظة على حجرة مغلقة لنقل اتجاهي من الركيزة التي ينبغي تحقيقها.
تم عرض إعادة تشكيل بروتينات الغشاء في proteoliposomes على نطاق واسع، واستعرضت (انظر ريغو وليفي 9). تسمح هذه البروتوكولات لرصد البروتينات الغشاء النشاط، على سبيل المثال عن طريق اتباع ركائز عبر الغشاء الحويصلية. في هذه الحالة تنشأ من القيود علىvailability من ركائز المعايرة (الفلورسنت، والإشعاعية، الخ.) وعن حقيقة أن في كثير من الأحيان هذه هي ركائز مسعور وتميل لعبور الأغشية بغض النظر عن وجود نقل. كبديل، يمكن للمرء متابعة التغيرات الطيفية من صبغة الإبلاغ حساسة للتغيرات الكيميائية التي تحدث نتيجة النقل. كما ذكر أعلاه، البروتونات تنشيط النقل عبر MexB. وبالتالي، خيارا ذات الصلة لرصد التغيرات الطيفية من صبغة حساسة لدرجة الحموضة التقارير لمتابعة تغيرات درجة الحموضة بسبب النقل الركيزة يحركها البروتون. اختيار صبغة الفلورسنت يتجنب أي آثار مصطنعة نظرا لطبيعة مسعور من الركيزة.
وثمة صعوبة أخرى هي جيل من التدرج بروتون. عدة بروتوكولات يمكن العثور عليها في الأدب. فيما بينها، واستخدام تقنية valinomycin على نطاق واسع ولكن أظهرنا أنه مملة لأداء 10-11. وعلاوة على ذلك فمنلا استنساخه وليس عكسها. نحن لجأت الى استخدام جرثومي (BR)، وضوء تنشيط مضخة البروتون من Halobacter salinarium، وسلبية الغرام البحرية تلزم archaeon الهوائية المحبة للملوحة. وcoreconstituted هذا البروتين في الجسيمات الشحمية مع MexB، وعند الإضاءة، ومضخات البروتونات داخل غرفة واحدة من الجسيمات الشحمية ويخلق ΔpH (الحمضية داخل) البروتين التي يحتاجها لنقل الركيزة 12-13 بالتالي.
البروتوكول
1. إنتاج البروتين وتنقية
- MexA، MexB من الزائفة الزنجارية
- تحويل البلازميدات إيواء MexA وMexB الجينات في E. سلالة إنتاج القولونية (مثل C43 DE3). لوحة على LB أجار تستكمل المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة. اختيار مستعمرة واحدة لتطعيم وO / N preculture. في صباح اليوم التالي، تلقيح preculture في 1 لتر من LB وينمو بمعدل 37 درجة مئوية تحت الإثارة (240 دورة في الدقيقة).
- مرة واحدة قد وصلت إلى مرحلة الخلايا الأسي (OD 600 = 0.6-0.8) لحث مع IPTG 1 ملم. أداء الاستقراء لمدة 2-3 ساعة عند 30 درجة مئوية تحت الانفعالات.
- خلايا الطرد المركزي (9،000 x ج لمدة 20 دقيقة) و resuspend في 30 مل تريس، حمض الهيدروكلوريك 20 ملم، ودرجة الحموضة 8، كلوريد الصوديوم 150 ملم.
- تعطيل الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية (10،000 رطل، 4 تمريرة). تجاهل الخلايا غير منقطعة والهيئات إدراج بواسطة الطرد المركزي في 9،000 x ج لمدة 20 دقيقة.
- الأغشية بيليه 1 ساعة على 100،000 XG وصesuspend كل بيليه في 30 مل مكرر تريس 10 ملم ودرجة الحموضة 7.4، الجلسرين 20٪ (ث / ت)، 10 ملي إيميدازول، كلوريد الصوديوم 500 ملم.
- تحديد تركيز البروتين الكلي الغشاء باستخدام مقايسة اللونية BCA وذوبان الأغشية O / N مع 2٪ مالتوزيد دوديسيل (DDM) في الحجم النهائي يتحدد بحيث المنظفات: البروتين هو 1:1.5 (ث / ث).
- نابذة فائقة السرعة في 100،000 x ج لمدة 1 ساعة لتجاهل مواد غير solubilized والمجمعة.
- احتضان طاف لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية مع الراتنج النيكل (تنقية MexA) أو الراتنج الكوبالت (تنقية MexB) معايرتها مع مكرر تريس 10 ملم ودرجة الحموضة 7.4، الجلسرين 5٪ (ث / ت)، 10 ملي إيميدازول، كلوريد الصوديوم 500 ملم، DDM 0.2٪.
- صب الراتنج في عمود فارغ. جمع التدفق من خلال.
- غسل الراتنج مع 50 مل من مكرر تريس 10 ملم ودرجة الحموضة 7.4، الجلسرين 20٪ (ث / ت)، 10 ملي إيميدازول، كلوريد الصوديوم 500 ملم، DDM 0.2٪، ثم مع 25 مل من مكرر تريس 10 ملي درجة الحموضة 6، الجلسرين 5٪ (ث / ت)، 10 ملي إيميدازول، كلوريد الصوديوم 500 ملم، DDM 0.2٪.
- أزل عrotein مع 20 مل مكرر تريس 10 ملم ودرجة الحموضة 7.4، الجلسرين 5٪ (ث / ت)، إيميدازول 300 ملم، 500 ملم كلوريد الصوديوم، DDM 0.2٪.
- تركيز البروتين مع جهاز الترشيح الفائق وصولا الى 3 مل والحمل على عمود تحلية معايرتها مع العازلة خالية من إيميدازول. قبل إعادة (انظر أدناه)، نابذة فائقة السرعة البروتينات solubilized (100،000 x ج لمدة 20 دقيقة) للتخلص من الدهون والبروتينات unsolubilized. ثم تركيز البروتين مرة أخرى إلى 0.3 مل.
- جرثومي من Halobacter salinarium
- تنمو الخلايا salinarium Halobacter تحت إضاءة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 يوما في المتوسط النمو السائلة التي تحتوي على كلوريد الصوديوم 4 M، MgSO 4 150 ملم، 10 ملم سترات، بوكل 30 ملي، خلاصة الخميرة 5 جم / لتر، وببتون 5 ز / L.
- تعطيل الخلايا عن طريق dialyzing ضد الماء منزوع الأيونات.
- تنقية غشاء الأرجواني على 30-40٪ (ث / ت) التدرج السكروز (100،000 x ج لمدة 17 ساعة).
- ذوبان تعليق الغشاء مع 2٪ octylglucoside لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية (حجم للذوبان من أجل resuspend والغشاء في 2:1 (ث / ث) المنظفات: نسبة البروتين). ويقدر تركيز BR solubilized باستخدام ε (570 نانومتر) = 54،000 M -1 سم -1. قبل إعادة (انظر أدناه)، نابذة فائقة السرعة وBR solubilized (100،000 x ج لمدة 20 دقيقة) للتخلص من الدهون والبروتينات unsolubilized.
ملاحظة: يتم إثراء الأغشية الأم طبيعيا في غرفة واحدة حتى لا حاجة لمزيد من التنقية.
2. إعداد Proteoliposomes
- تشكيل الحويصلية: وضع 400 ميكرولتر من DOPC يذوب في الكلوروفورم (25 ملغ / مل) في كوب زجاجي وإضافة 1.5 ملغ من الكولسترول المخزنة على شكل مسحوق. تجفيفها قبل التلاعب تحت البخار من النيتروجين أو فراغ لا يقل عن 1 ساعة في كوب زجاجي. وDOPC: نسبة الكوليسترول في الدم هو المولي 3.3:1.
- بعد أن جفت، هيدرات الدهون مع 1 مل من HEPES 25 ملي درجة الحموضة 7،K 2 SO 4 100 ملم، 2 MgCl 2 مم، 2 مم pyranine. يجب أن يظهر تعليق عكر في هذه المرحلة.
- تسخين المحلول لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يصوتن لمدة 10 دقيقة في 40 W 30 ثانية مع نبض، 30 دورات وقفة ثانية في RT. يجب أن تظهر واضحة التعليق في هذه المرحلة.
- للحصول على السكان monodisperse من الجسيمات الشحمية، تنفيذ دورتين من قذف ولكل دورة، وتمرير تعليق الحويصلية من خلال تصفية 11X على الأقل. في الجولة الأولى، استخدم غشاء حجم المسام من 200 نانومتر وللدورة الثانية، استخدم غشاء حجم المسام من 100 نانومتر. قياسات تشتت الضوء الحيوي لا يمكن أن يؤديها في هذه الخطوة للتحقق من تجانس التعليق.
- دمج البروتين
المبدأ: غشاء بروتينات يمكن تشكيلها في الجسيمات الشحمية بفضل تأثير solubilizing المنظفات. يتم تحضين الجسيمات الشحمية المنظفات solubilized مع بروتين الغشاء solubilized المنظفات وتشكيل عيتم تشغيل roteoliposomes قبل التخلص السريع من المنظفات مع الخرز البوليسترين 9.- إضافة 28 ملغ من تريتون X-100 (0.56٪ النهائي)، واحتضان O / N عند 4 درجة مئوية (درجة حرارة الإذابة يمكن تكييفها للبروتين قيد الدراسة).
- إضافة البروتين المنظفات solubilized (BR، MexB وMexA) إلى الجسيمات الشحمية solubilized واحتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إضافة البروتينات إلى تعليق الحويصلية solubilized في النسب التالية (ث / ث): الدهون / MexB = 20، MexB / MexA = 2.5، والدهون / BR = 30.
- إضافة الخرز البوليسترين في 30:1 الخرز: نسبة المنظفات (ث / ث، بالنظر إلى الوزن الكلي للالمنظفات، بما في ذلك المنظفات وأضاف مع البروتينات المنقى)، واحتضان 5 ساعة، في الظلام (بسبب BR) في RT تحت لطيف التحريك. قبل هذا الإجراء، وتفعيل biobeads مع الميثانول والإيثانول الحضانة ويغسل بالماء على نطاق واسع.
- تنقية البروتين proteoliposomes وركائز حرة باستخدام PD-10عمود تحلية معايرتها مع HEPES 25 ملي درجة الحموضة 7، K 2 SO 4 100 ملي وMgCl 2 2 مم.
- تخزين proteoliposomes عند 18 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع.
- تقييم فعالية إعادة على التدرج السكروز.
للتأكد من أن كل من MexB وBR تم تشكيلها في الجسيمات الشحمية، وتنقية التعليق proteoliposome على التدرج السكروز متقطع.- تسوية بلطف proteoliposomes على التدرج خمس طبقات من السكروز (60٪، 20٪، 10٪، 5٪، و 2.5٪، ث / ت).
- نابذة فائقة السرعة لمدة 17 ساعة على 100،000 x ج (مع الحد الأدنى من تسارع وتباطؤ معدلات).
- جمع بعناية مختلف الكسور التدرج (وخصوصا الواجهات بين كل طبقة من السكروز) وتحليلها على SDS-PAGE (10٪) باستخدام Coomassie تلطيخ أو النشاف الغربية. تم العثور على البروتينات تجميعها على الجزء السفلي من الأنبوب، في حين تم العثور على nonincorporated، البروتينات المنظفات solubilized في أعلىالأنبوب. تم العثور على Proteoliposomes والجسيمات الشحمية في واجهات السكروز التي تتوافق مع كثافتها الذاتية. يتم استرداد الليبوزومات فارغة أبعد تصل في الانحدار من proteoliposomes.
3. قياس مضان
- أداء قياسات مضان في 25.0 درجة مئوية باستخدام الطيفي السماح لقياس ثنائي الطول الموجي (مصباح اكس، 150 W). فترات إضاءة بديلة (لتنشيط BR مع موجات الإثارة / الانبعاثات من 550 نانومتر / 550 نانومتر) والقياسات مضان مع موجات الإثارة / الانبعاثات من 455 نانومتر / 509 نانومتر لمدة 2 ثانية لقياس مضان pyranine. تعيين الإثارة وانبعاث عرض الموجات إلى 5 نانومتر. إجراء القياسات في وجود 50 نانومتر valinomycin لمنع تشكيل غشاء عكس ΔΨ المحتملة.
ملاحظة: في الواقع، لأن مضخات البروتونات BR، وهناك اتهامات أكثر إيجابية داخل الحويصلية من الخارج. هذه التهمةيمكن التخلص منها باستخدام التدرج valinomycin، وهو K + حامل الأيون انتقائية. مرة واحدة تضاف إلى valinomycin الجسيمات الشحمية تعليق، كما جزيء مسعور، وسوف تضاف الى الغشاء الحويصلية، نقل سلبي K +، وبالتالي تبديد غشاء ΔΨ المحتملة.
النتائج
يتكون فحص رصد pyranine مضان بوصفها وظيفة من الوقت في حين يتم إنشاء التدرج بروتون. لهذا الغرض، يتعرضون بدلا من العينات لإضاءة (وبالتالي ضخ البروتون بواسطة BR يتم تشغيل) ومن ثم إلى مضان القياس باستخدام الإثارة وانبعاث موجات من pyranine (λ = 455 نانومتر السابقين وλ = 509 نانومتر م).
ويبين الشكل 1 عنصر تحكم تم الحصول عليها مع ممثل الفحص، في غياب MexA / MexB، والتحقق من أن التدرج بروتون التي تم إنشاؤها بواسطة BR هو عكسها. بعد دورة واحدة من تحمض، يتم الاحتفاظ proteoliposomes في الظلام لمدة 45 دقيقة من أجل أن BR لوقف ضخ البروتونات (البروتونات منتشر ببطء وبشكل سلبي عبر طبقات ثنائية الدهون التالية التدرج تركيزهم). بعد هذا الوقت الانتعاش، وتفعيل BR هو ممكن، وذلك ببساطة عن طريق إلقاء الضوء على نفس التعليق مرة أخرى.
الرقم 2يتوافق مع قياس النقل الفعلي. A السيطرة السلبية مع الجسيمات الشحمية الحرة البروتين يظهر أنه، كما هو متوقع، ودرجة الحموضة هو ثابت على الإضاءة (أرقام 2A و 2B، والدوائر البرتقالية). ومع ذلك، proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة في الأغشية لم ضخ البروتون، وبالتالي فإن درجة الحموضة داخل النقصان الحويصلية ويتم بناء التدرج مستقرة (أرقام 2A و 2B والساحات الأرجواني). مثلثات رمادي وأحمر الماس (الشكل 2A) تمثل درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة وMexB، في وجود أو في غياب هويشت 33342، على التوالي. نلاحظ النشاط الركيزة مستقلة حيث يتبدد التدرج بروتون فقط جزئيا MexB مكافحة النقل. ونحن نعزو هذه الملاحظة إلى النشاط القاعدية من MexB.
من أجل اختبار تأثير MexA على نشاط MexB، وأضيف إلى إعادة MexA، أولا في غياب أي الركيزة ( الشكل 2B، والماس الازرق). مرة أخرى، يتبدد التدرج بروتون التي تم إنشاؤها بواسطة BR جزئيا فقط. ويتحقق قياس النقل الفعلي على نفس العينة. مسبقا، يجب أن يكون reinitialized التدرج بروتون ويجب أن يضاف الركيزة في التعليق من أجل الوصول إلى موقع ملزمة لها في البروتين. لهذا الغرض وحضنت تعليق في الظلام في وجود الركيزة لمدة 45 دقيقة. عند إضاءة لاحقة، يمكن للمرء أن يرى أن التدرج بروتون التي تم إنشاؤها بواسطة BR الآن تبدد تماما من MexAB (الشكل 2B، مثلثات خضراء)، نتيجة لنقل الركيزة بواسطة مضخة.
. الرقم 1 عكس اتجاه التدرج بروتون بناها الإضاءة BR: Pyranine فلوريداuorescence من proteoliposomes BR تقاس بوصفها وظيفة من الوقت. من 0-15 دقيقة، BR مضخات البروتونات نتيجة لتفعيل الضوء. من 15-60 دقيقة، ويتم تحضين proteoliposomes في الظلام، وخلال هذا الوقت، والبروتونات تتحرك بشكل سلبي من الجسيمات الشحمية حتى درجة الحموضة ودرجة الحموضة intravesicular extravesicular متساوون. من 60-75 دقيقة، BR لا تزال الوظيفية ومضخات البروتونات على الإضاءة.
. الرقم 2 النقل مقايسة: pyranine مضان، وتحويلها إلى تغيرات الرقم الهيدروجيني المقابلة، بوصفها وظيفة من الوقت A) درجة الحموضة داخل الجسيمات الشحمية التحكم (دوائر البرتقال)؛ درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة في الغشاء (المربعات الأرجواني)؛ درجة الحموضة في الداخل. من proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة، وMexB في الغشاء دون هويشت 33342 (د الحمراءiamonds)؛ درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة وMexB في الغشاء مع هويشت 33342 (مثلثات الرمادي) B) درجة الحموضة داخل الجسيمات الشحمية التحكم (دوائر البرتقال)؛ درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة في الغشاء (المربعات الأرجواني)؛ درجة الحموضة داخل من proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة، وMexB MexA في الغشاء دون هويشت 33342 (الماس الأزرق)؛ درجة الحموضة داخل proteoliposomes تحتوي على غرفة واحدة، وMexB MexA في الغشاء مع هويشت 33342 (مثلثات خضراء).
المناقشة
وصفنا إجراء إعادة تصميم لمعايرة غشاء النقل البروتين. بمجرد إنشائها، فإن الإجراء إعادة البروتين يؤدي إلى القياسات التي هي استنساخه جدا. ومع ذلك، فإن الظروف الدقيقة لإعادة تشكيل البروتين تختلف من البروتين واحدة إلى أخرى. يجب توخي الحذر كثيرا في تحقيق الاستفادة المثلى من المعلمات التالية: ط) جودة تنقية (النقاء وعدم وجود مواد مجمعة)؛ ب) كفاءة الخطوة المنظفات solubilizing (عندما يكون ذلك ممكنا، ينبغي تفضيل منخفضة المنظفات CMC لأنها أسهل للحصول على التخلص من)؛ ج) الامتزاز من المنظفات (هو على سبيل المثال من الممكن الجمع بين استخدام الخرز البوليسترين مع خطوة لغسيل الكلى ولكن هذا قد يؤثر على معدل الامتزاز، معلمة حرجة للنشاط اللاحقة من البروتين، انظر المرجع [ 9])؛ د) إعادة الدهن (الطبيعة الكيميائية للدهون، والدهون إلى نسبة البروتين، وجود amphiph إضافيةديزيل هي المعايير الضرورية التي يجب أن تكون متنوعة والأمثل). في درجة الحرارة وفترة حضانة بالإضافة إلى ذلك تؤثر على كل هذه القضايا.
مراقبة الجودة وبالتالي البدائية في كل خطوة من إجراء إعادة. من وجهة النظر هذه، تشتت الضوء هي تقنية مريحة للغاية لأنها سريعة، غير تدميري، وأنه لا يتطلب سوى 20 ميكرولتر من عينة في التركيز على مجموعة مكرومولي. مرة واحدة تتشكل proteoliposomes، والتدرج السكروز هو أيضا من مساعدة كبيرة لأنه يفتح الطريق نحو التحقق المنهجي من إعادة: النوعية (هو البروتين جزءا لا يتجزأ من الواقع في غشاء الحويصلية)، وكذلك الكمية (كم من البروتين في الحويصلية واحد). وهذا الأخير سوف تعالج عن طريق قياس بالضبط البروتين والدهون تركيزات.
لا تعتمد على مقايسة لدينا المعايرة الركيزة نفسها وهذا يتجنب الاعتبارات بعدم الارتياح بشأن احتمال نشر السلبي مصطنعة من الجزيء بسبب تقسيم مسعور في الأغشية. مقايسة يستغل خصائص pyranine باعتباره التحقيق موثوقة والكمية لرصد التغيرات ودرجة الحموضة. نتائجنا تتفق مع النتائج التي تم الحصول عليها مع إجراء آخر حيث تم إجراء تشكيل بروتون التدرج باستخدام valinomycin 10، ولكن لأنها تتيح التدرج أكثر قوة واستنساخه 11. بالإضافة إلى ذلك، التدرج بروتون يمكن ضبطها على وجه التحديد، وذلك ببساطة من خلال تغيير التركيز من المخزن المؤقت (لمزيد من التفاصيل انظر Verchere وآخرون 12).
في الإجراء يتم إجراء قياس التحكم الأول في غياب الركيزة (هذا يتيح الوصول إلى النشاط السلبي من البروتين). ثم يتم قياس البروتين غشاء نقل النشاط الفعلي بعد إضافة الركيزة في نفس كفيت. هذا هو حقا أحد الأصول لأن التجربة يمكن اعتباره، نتائج حقيقية، وغير غامضة الناجم عن الركيزة.
الأنف والحنجرة "> بروتوكول يمكن أن تتكيف مع إنتاجية عالية ومتوسطة (على سبيل المثال 96 بئرا القياسات) أتمتة بسبب إلقاء الضوء على عينة يطلق فإن رد الفعل. أتمتة والموازاة تتمثل في إعداد دفعة كبيرة من proteoliposome، والاستغناء مأخوذة في 96 الآبار لوحة. ركائز (وكذلك مثبطات ممكن) ستضاف فيما بعد وبعد الحضانة في الظلام لمدة 45 دقيقة لوحة سيتعرض للدورات قياس مضان الإضاءة / pyranine على قارئ صفيحة ميكروسكوبية.للحصول على معلومات إضافية بشأن البروتوكول، مدعوون القراء لقراءة Verchere آخرون 12،13
الإفصاحات
ليس هناك شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذه الدراسة من قبل الوكالة الوطنية دي لا بحوث (مشروع ANR-2010-1535-بلان) وبمنحة من منطقة إيل دو فرانس (DIM-Malinf 110058).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DOPC (1،2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| الكوليسترول | Sigma Aldrich | C8667 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93427 | |
| Valinomycin | Invitrogen | V-1644 | |
| Pyranine (8- هيدروكسي بيرين -1،3،6-حمض ثلاثي سلفونيك) | Invitrogen | H-348 | |
| DDM (n-Dodecyl-& beta ؛ -D-maltopyranoside)مجموعة | Affymetrix | D310LA | |
| (الطارد ، محاقن هاميلتون محكمة الغلق)Avanti | Polar Lipids | 610000 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Econo-Pac Chromatography العمود الفارغ | Biorad | 732-1010 | |
| أعمدة تحلية المياه | Bio-Rad | 54805 | |
| أداة تشتت الضوء الديناميكي | Wyatt Technology | DynaPro NanoStar | |
| مقياس الفلور JASCO FP-6200 | JASCO | 6816-J002A |
المراجع
- Granseth, E., et al. Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review). Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).
- Nikaido, H. Multidrug resistance in bacteria. Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).
- Pos, K. M. Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump. Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).
- Murakami, S., et al. Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism. Nature. 443 (7108), 173 (2006).
- Seeger, M. A. Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism. Science. 313 (5791), 1295 (2006).
- Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa. J Mol Biol. 389 (1), 134(2009).
- Su, C. C., et al. Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli. Nature. 470 (7335), (2011).
- Nikaido, H., Takatsuka, Y. Mechanisms of RND multidrug efflux pumps. Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).
- Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in enzymology. 372, 65 (2003).
- Aires, J. R., Nikaido, H. Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli. J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).
- Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys. Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).
- Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press. , (2012).
- Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Sci Rep. 2, 306 (2012).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
