يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

خلية كاملة MALDI-TOF الطيف الكتلي هو الطريقة السريعة لدقة وتحليل أنماط مختلفة من تنشيط البلاعم

8.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50926

⸱

ديسمبر 26, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول استخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF للخلية الكاملة على الخلايا حقيقية النواة. هنا ، نوضح دقة هذه التقنية من خلال تحليل حالات التنشيط المتعددة للضامة استجابة لبيئتها الدقيقة.

الملخص

MALDI-TOF هي تقنية قياس الطيف الكتلي المستخدمة على نطاق واسع في الكيمياء والكيمياء الحيوية. كما تم تطبيقه في الطب لتحديد الجزيئات والمؤشرات الحيوية. في الآونة الأخيرة ، تم استخدامه في علم الأحياء الدقيقة للتحديد الروتيني للبكتيريا المزروعة من العينات السريرية ، دون خطوات تحضير أو تجزئة. لقد طبقنا نحن وآخرون تقنية قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF كاملة الخلية بنجاح على الخلايا حقيقية النواة. تتراوح التطبيقات الحالية من تحديد نوع الخلية إلى تقييم مراقبة الجودة لزراعة الخلايا والتطبيقات التشخيصية. هنا ، نصف استخدامه لاستكشاف الأنماط الظاهرية للاستقطاب المختلفة للضامة استجابة للسيتوكينات أو البكتيريا المقتولة بالحرارة. سمح بتحديد بصمات الأصابع الخاصة بالبلاعم التي تمثل تنوع الاستجابات البروتينية للبلاعم. يوضح هذا التطبيق دقة وبساطة الطريقة. قد يكون البروتوكول الذي وصفناه هنا مفيدا لدراسة استجابة المضيف المناعي في الحالات المرضية أو قد يمتد إلى تطبيقات تشخيصية أوسع.

المقدمة

قياس الطيف الكتلي بالليزر بمساعدة المصفوفة / التأين (MALDI-TOF MS) هي تقنية شائعة لقياس الطيف الكتلي لدراسة العينات البيولوجية. يسمح استخدام شعاع الليزر ومصفوفة امتصاص الطاقة بعملية تأين ناعمة: تبخر وتكوين جزيئات حيوية كبيرة أحادية الشحنة في الغالب. تسمى هذه العملية الامتصاص / التأين ، مما يبرر الاختصار MALDI. ثم يتم تسريع هذه الأيونات عن طريق تطبيق الجهد والدخول إلى محلل TOF الذي يسمح بفصل هذه الأيونات وتحديد كتلها1.

MALDI-TOF MS تم استخدامه على نطاق واسع في علم الأحياء والكيمياء والطب لتحديد الجزيئات والمؤشرات الحيوية2-4 أو لمراقبة التعديلات اللاحقة للترجمة على البروتينات5،6. في الآونة الأخيرة ، طبقت عدة مجموعات MALDI-TOF MS لتحديد الكائنات الحية الدقيقة من العينات السريرية7،8. يستخدم هذا التطبيق الميكروبيولوجي الآن بشكل روتيني في الإعدادات السريرية. تتمتع الخلية الكاملة MALDI-TOF بالعديد من المزايا مقارنة بالتطبيقات الكلاسيكية ل MALDI-TOF MS. تتم معالجة العينات التي تحتوي على خلايا كاملة مباشرة ، وتجنب الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا لتجزئة أو فصل كميات كبيرة من المواد. علاوة على ذلك ، ليست هناك حاجة إلى توصيف القمم المختلفة: يعتبر الطيف بأكمله بمثابة بصمة للعينة ، وتقارن خوارزميات المطابقة الطيف المختبر بقاعدة بيانات للأطياف المرجعية.

< p class = "jove_content">لقد طبقنا نحن وآخرون تقنية تحليل الخلية الكاملة هذه على الخلايا حقيقية النواة. يمكن اشتقاق العديد من التطبيقات من هذه التقنية: (1) تحديد أنواع الخلايا الرئيسية من عينة مختلطة9-11. (2) تقييم جدوى مزارع الخلايا بمرور الوقت (بما في ذلك التطبيقات الصناعية لمراقبة الجودة)12؛ (3) مراقبة حالات التنشيط لخلية واحدة من نوع13 ؛ (4) تقييم التحول الخبيث لعينة سريرية14،15.

هنا ، نصف استخدام MALDI-TOF MS كامل الخلية لاستكشاف الأنماط الظاهرية للاستقطاب المختلفة للضامة استجابة للسيتوكينات أو البكتيريا المقتولة بالحرارة. تلعب البلاعم دورا محوريا في الاستجابة المناعية لمسببات الأمراض الميكروبية. يكتشفون العوامل المعدية في الأنسجة من خلال مستقبلات التعرف على الأنماط القادرة على اكتشاف الأنماط الميكروبية المحفوظة ، مثل عديدات السكاريد الدهنية (LPS) 16. البلاعم هي خلايا احترافية تقدم مستضد تتفاعل مع الخلايا التائية لتركيب الاستجابة المناعية التكيفية. تؤثر الخلايا التائية على البلاعم عن طريق إطلاق السيتوكينات التي تعزز أو تنظم نشاط مبيدات الميكروبات للضامة. قياسا على استقطاب الخلايا الليمفاوية Th1 / Th2 ، تم تصنيف البلاعم الالتهابية ومبيدات الميكروبات ومبيدات الأورام إلى ضامة M1 وضامة منظمة المناعة على أنها ضامة M217-19. يشير مصطلح M1 إلى التنشيط الكلاسيكي للبلاعم بواسطة السيتوكينات من النوع الأول ، مثل الإنترفيرون (IFN)-γ وعامل نخر الورم (TNF) ، أو المنتجات البكتيرية ، مثل LPS18،20-23 ، في حين أن البلاعم التي يتم تنشيطها بواسطة مسارات بديلة (إنترلوكين (IL) -4 ، IL-10 ، عامل النمو المحول - β1 تعتبر M2 ضامة19،24،25. إن اللدونة العالية للنمطية الظاهرية والوظيفية للبلاعم استجابة لبيئتها الدقيقة تجعل هذه الضامة مفيدة لتحليل التغييرات الطفيفة من خلال نهج MALDI-TOF MS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام تقنية MALDI-TOF للخلية الكاملة للحصول على طيف كتلي يعتبر بصمة للعينة. سمح تحليل المعلوماتية الحيوية بمقارنة وتصنيف بصمات الأصابع هذه. كان هناك ثلاثة أجزاء رئيسية في هذا البروتوكول:

  1. تحضير العينات البيولوجية: تحكم البلاعم والضامة المحفزة بمؤثر مختلف.
  2. تحليل كل نوع من أنواع العينات مع التكرارات التقنية بواسطة MALDI-TOF MS الخلية الكاملة.
  3. تحليل المعلوماتية الحيوية للبيانات الأولية.

تحضير محاليل معقمة لعزل الخلايا وثقافتها. تحضير وتخزين جميع الكواشف عند 4 درجات مئوية

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلايا الوحيدة البشرية

  1. تحضير وسط زراعة الخلايا. أضف 55 مل من مصل AB + أو مصل الأبقار الجنينية (FBS) و5 مل من محلول المضادات الحيوية (البنسلين بمعدل 10,000 UI/ml والستربتومايسين بمعدل 10,000 ميكروغرام/مل؛ التركيز النهائي البالغ 100 UI/ml للبنسلين و100 ميكروغرام/مل للستربتومايسين) إلى RPMI 1640 متوسط (500 مل).
    1. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) من الكريات البيض (مركزات الكريات البيض).
      1. تحضير أنابيب 50 مل تحتوي على 15 مل فيكول. تمييع الدم في محلول ملحي (المجلد / المجلد ، 1/10). قم بإيداع 30 مل من PBMCs المخففة على Ficoll كما هو موضح سابقا26.
      2. جهاز طرد مركزي عند 700 × جم لمدة 20 دقيقة. تمييع PBMCs في وسط الاستزراع وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. قم بإعداد الخلايا الوحيدة CD14 + من PBMCs باستخدام حبات مغناطيسية مطلية بالأجسام المضادة ل CD14.
      ملاحظة: احتفظ بالمنتجات والخلايا عند 4 درجات مئوية حتى تنفجر الخلايا الأحادية.
      1. تحضير المخزن المؤقت الجاري الذي يتكون من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) درجة الحموضة 7.2 ، 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) و 2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
        2. قم
      2. بفصل PBMCs المحببة برفق (107 خلايا لكل فحص) إلى 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت قيد التشغيل.
      3. أضف 20 ميكرولتر من MicroBeads CD14 إلى PBMCs. امزج وحتضن PBMCs لمدة 15 دقيقة. اغسل PBMCs ب 5 مل من عازلة التشغيل وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. قم بفصل PBMCs المحببة برفق إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتشغيل لمدة 108 PBMCs.
        ملاحظة: استخدم 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت قيد التشغيل لتركيزات PBMC أقل من 108 PBMCs.
      4. انتقل إلى الفصل المغناطيسي.
        ملاحظة: لأقل من 2 × 108 PBMCs ، استخدم عمود MS ؛ لأكثر من 2 × 108 PBMCs وأقل من 2 × 109 PBMCs، أستذب عمود LS.
      5. اشطف العمود المسبق والعمود بمخزن مؤقت قيد التشغيل (500 ميكرولتر لعمود MS أو 3 مل لعمود LS). أضف PBMCs إلى العمود المسبق (انتظر حتى تمر الخلايا غير المسماة عبر العمود). اشطف 3 مرات باستخدام المخزن المؤقت قيد التشغيل (500 ميكرولتر لعمود MS أو 3 مل لعمود LS). قم بإزالة العمود المبدئي.
      6. ضع العمود على أنابيب 15 مل. أضف المخزن المؤقت قيد التشغيل (1 مل لعمود MS أو 5 مل لعمود LS) على العمود وقم بإزالة خلايا CD14 + عن طريق الضغط على العمود.
      7. جهاز الطرد المركزي المصفى عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. اغسل حبيبات الخلية الأحادية ب 10 مل من وسط الاستزراع.
        ملاحظة: قم بتحليل نقاء مستحضر الخلايا الوحيدة باستخدام الأجسام المضادة ل CD14 وقياس التدفق الخلوي (أعلى تقليديا من 95٪).
  2. تمايز الخلايا الوحيدة إلى ضامة.
    1. احتضان الخلايا الوحيدة (106 خلايا وحيدة لكل بئر في 6 ألواح آبار) في 3 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ مصل بشري AB + عند 37 درجة مئوية. بعد 4 أيام ، يتم استبدال وسط المزرعة الذي يحتوي على مصل بشري بوسط مزرعة سعة 3 مل يحتوي على 10٪ FBS لمدة 3 أيام إضافية.
    2. حدد مجموعة الخلايا التي تم الحصول عليها على أنها ضامة مشتقة من الخلايا الأحادية (MDMs) عن طريق قياس التدفق الخلوي (انظر الشكل 1).
      1. استبدل وسط الثقافة ب 3 مل PBS. اكشط MDMs مع شرطي مطاطي واجمع تعليق MDM. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. أضف PBS الذي يحتوي على 2٪ BSA إلى MDMs المحببة وحرك تعليق الخلية برفق. اضبط تركيز الخلية (106 MDMs في 200 مل PBS) واحتضانه عند 4 درجات مئوية.
      2. أضف 10 مل من الأجسام المضادة ل CD14 و 10 مل من الأجسام المضادة ل CD68 إلى تعليق MDM واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
        ملاحظة: يجب تصنيف هذه الأجسام المضادة باثنين من الفلوروكرومات المختلفة المتوافقة مع تحليل قياس التدفق الخلوي. على سبيل المثال ، يمكن اقتران الأجسام المضادة ل CD14 مع الأجسام المضادة الفيكوريثيرين المقترنة (لتلوين الخلايا الوحيدة) والأجسام المضادة المضادة ل CD68 مع Alexa Fluor 647 المقترنة (لتلوين البلاعم).
      3. أجهزة الطرد المركزي MDMs بحجم 400 × جم لمدة 5 دقائق. قم بفصل حبيبات الخلية برفق واحتضان MDMs في 250 مل 3٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة MDM الثابتة بأجهزة الطرد المركزي PFA عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. اغسل MDMs ب 3 مل PBS و MDMs بأجهزة الطرد المركزي بحجم 400 × جم لمدة 5 دقائق. افصل بلطف حبيبات MDM في 400 مل PBS.
      4. تحليل تمايز الخلايا الوحيدة (التي تعبر عن CD14 ولكن ليس CD68) إلى خلايا وحيدة (تعبر عن CD68 ولكن ليس CD14). ملاحظة: أكثر من 95٪ من الخلايا تقليديا عبارة عن MDM.
  3. تحفيز MDMs لمدة 18 ساعة.
    1. استبدل وسط زراعة MDMs الملتصقة بوسط استزراع طازج سعة 3 مل (يحتوي على FBS 10٪).
    2. للحث على استقطاب M1 أو M2 ، استخدم السيتوكينات المؤتلفة البشرية التالية: IFN-γ و TNF لاستقطاب M1 ، و IL-4 لاستقطاب M2. يتم الحصول على البلاعم M1 أيضا عن طريق التحفيز باستخدام LPS. لاحظ أن محاليل مخزون السيتوكينات محفوظة عند -80 درجة مئوية وأن محلول مخزون LPS يتم حفظه عند -20 درجة مئوية.
      1. قم بتخفيف محلول مخزون IFN-gγ (1 مجم / مل) عند 1/100 في وسط الاستزراع للحصول على تخفيف 10 نانوغرام / مل. أضف 6 ميكرولتر من تخفيف IFN-γ إلى MDMs للحصول على تركيز IFN-γ نهائي يبلغ 20 نانوغرام / مل.
        2. قم
      2. بتخفيف محلول مخزون عامل نخر الورم (1 مجم / مل) عند 1/100 في وسط الاستزراع للحصول على تخفيف قدره 10 نانوغرام / مل. أضف 6 ميكرولتر من تخفيف عامل نخر الورم هذا إلى MDMs للحصول على تركيز نهائي من عامل نخر الورم 20 نانوغرام / مل.
        3. قم
      3. بتخفيف محلول مخزون IL-4 (1 مجم / مل) عند 1/100 في وسط الاستزراع للحصول على تخفيف قدره 10 نانوغرام / مل. أضف 6 ميكرولتر من هذا التخفيف IL-4 إلى MDMs للحصول على تركيز IL-4 نهائي قدره 20 نانوغرام / مل.
      4. أضف 3 ميكرولتر من محلول مخزون LPS (1 مجم / مل) إلى MDMs للحصول على تركيز LPS نهائي يبلغ 1 ميكروغرام / مل.
    3. لتحفيز MDMs بالبكتيريا ، استخدم البكتيريا المقتولة بالحرارة. اغسل البكتيريا الحية باستخدام PBS وقم بتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. استخدم Orientia tsutsugamushi (سلالة Kato (CSUR R163) ، المتفطرة بوفيس (Bacillus Calmette-Guérin ، سلالة BCG CIP 671203) و Coxiella burnetii (Nine Mile في المرحلة الأولى) بسبب معروف أن هذه مسببات الأمراض تصيب البلاعم. وبالتالي ، قم بإعداد O. tsutsugamushi المعلق عند 109 بكتيريا / مل. أضف 50 ميكرولتر إلى MDMs . كرر نفس الخطوة ل M. bovis و C. burnetii.
  4. تحضير عينات بيولوجية لمرض التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF.
    1. اغسل MDMs المحفزة باستخدام PBS بدون Ca2+ أو Mg2+ (قد تتراكم الخلايا في وجود Ca2+ أو Mg2+). اكشط MDMs مع شرطي مطاطي واجمع تعليق MDM. أجهزة الطرد المركزي MDMs. اغسل MDMs مرة أخرى في PBS بدون Ca2+ أو Mg2+ عند 400 × جم لمدة 5 دقائق للتخلص من تلوث FBS.
    2. اضبط تركيز الخلية (2 × 106 MDMs لكل فحص). أجهزة الطرد المركزي MDMs بحجم 400 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المواد الطافية. اجمع كريات الخلايا في 20 ميكرولتر من PBS بدون Ca2+ أو Mg2+.
    3. قم بتحليل العينات على الفور أو تخزينها في PBS عند -80 درجة مئوية قبل التحليل.
< p class = "jove_title" >2. تحليل البلاعم بواسطة Maldi-TOF MS كامل الخلية

  1. تحضير مصفوفة CHCA.
    1. أضف 500 ميكرولتر من الأسيتونيتريل ، و 250 ميكرولتر 10٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، و 250 ميكرولتر من ماء الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إلى قارورة. خفف 10 مجم من CHCA في هذا المحلول إلى تركيز نهائي قدره 10 مجم / مل. امزج وصوتنة لمدة 20 دقيقة على الأقل
      ملاحظة: صوتنة سوف يحسن تشبع المصفوفة ولكن هذه الخطوة ليست إلزامية.
    2. جهاز طرد مركزي عند 13,000 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من الحبيبات واحتفظ بالمادة الطافية.
      ملحوظة: قم بإعداد محلول المصفوفة قبل الاستخدام مباشرة. لا يسمح محلول المصفوفة الذي يحتوي على بلورات بالتأين الجيد لجزيئات العينة ، وقد يؤثر ذلك على جودة الأطياف.
  2. تحضير هدف MALDI الفولاذي.
    1. بلل الهدف الفولاذي المصقول بماء الصنبور الساخن. افركي بورق مسح دقيق. أضف 70٪ إيثانول وافرك. اشطفها بالماء عن طريق الفرك. أضف 70٪ إيثانول وافرك بورق دقيق.
    2. اغمر الهدف في 70٪ من الإيثانول والصوتين لمدة 15 دقيقة على الأقل. قم بتغطية الهدف ب 500 ميكرولتر إلى 1 مل من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 80٪. افركي وامسحي بورق دقيق. اشطفها بماء HPLC دون فرك. جفف الهدف في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: قد يؤثر الهدف الذي تم تنظيفه بشكل غير صحيح على جودة الأطياف.
  3. تحضير الودائع.
    1. ضع الهدف النظيف على دعامة أفقية ومستوية للحصول على رواسب موحدة.
    2. قم بإذابة عينات MDM برفق على الثلج. ملاحظة: قد يؤدي الذوبان السريع والقوي إلى تغيير العينات، مما يؤثر على جودة الأطياف. تجانس MDMs (عن طريق سحب ماصة معلق الخلية ذهابا وإيابا) قبل ترسيب 1 ميكرولتر (يحتوي على حوالي 1 × 105 خلايا) على هدف MALDI. أضف 1 ميكرولتر من محلول مصفوفة MALDI على العينة. تجنب خلط البقعة مع الماصة. يؤدي خلط البقع مع الماصات إلى تغيير جودة الأطياف. قم بإزاحة 12-16 عينة / فحص (التكرارات الفنية).
    3. تتبخر تلقائيا في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يحدث التبخر تدريجيا ويؤدي إلى تكوين بلورات المصفوفة / العينة. يمكن تحليل الرواسب على الفور أو تخزينها في الظلام لعدة أيام قبل التحليل (حتى أسبوعين).
    4. يجب على المستخدم التحكم في أن السيتوكينات أو البكتيريا المقتولة بالحرارة المستخدمة في التجربة لا توفر قمم ضمن نطاق أطياف الضامة المحفزة. هنا ، تحققنا من أن السيتوكينات والبكتيريا المقتولة بالحرارة وحدها لا توفر أي إشارة ضمن النطاق المدروس (0-20 كيلو دالتون).
  4. ضبط مطياف الكتلة والحصول على البيانات.
    1. أدخل الهدف الفولاذي الذي يحتوي على عينات في مطياف الكتلة.
    2. تكوين مطياف الكتلة وتشغيل الحصول على البيانات. استخدم التكوين الافتراضي للاكتساب التلقائي للبيانات.
    3. ملاحظة: ترد في التذييل/الجدول 1 عرض تفصيلي لتكوين برنامج flexControl قد يختلف هذا وفقا لمطياف الكتلة والبرامج المستخدمة.
< p class = "jove_title" >3. تحليل المعلوماتية الحيوية

ملاحظة: تم إجراء تحليل المعلوماتية الحيوية باستخدام برنامج التحليل الإحصائي المجاني والمفتوح المصدر R ، جنبا إلى جنب مع مكتبات التحليل المحددة (MALDIquant). يمكن تنزيل R مجانا من موقعه على الويب http://cran.r-project.org/. يتم توفير وصف مفصل للنص النصي على النحو التالي مادة تكميلية.

  1. تحميل البيانات الأولية ومعالجتها مسبقا.
    1. تخزين البيانات الأولية على الكمبيوتر المرتبط بمقياس الطيف الكتلي في ملفات ومجلدات متعددة. استرجاع المجلد الجذر للتجربة مع جميع المجلدات الفرعية. نسخ المجلد الجذر إلى الكمبيوتر الشخصي لتحليله.
    2. استخدم مكتبات readBrukerFlexData و MALDIquant لتحميل البيانات الأولية وتحليلها.
      ملاحظة: يسمح readBrukerFlexData بتحميل البيانات الأولية من مطياف الكتلة إلى كائن معين في R لمزيد من التحليل. انظر وصف MALDIquant لمزيد من المعلومات27.
    3. تحليل الأطياف التي تم إنشاؤها.
      ملاحظة: يتكون كل طيف من قائمة من القمم مع كتلها وشدتها (الوفرة النسبية). استخدم الجذر التربيعي للشدة لتحسين التصور الرسومي للأطياف. قم بتصحيح الخلفية باستخدام خوارزمية قص الذروة غير الخطية الحساسة للإحصاء لتقدير خط الأساس27. استخدم نسبة إشارة إلى ضوضاء تبلغ 6 لاكتشاف القمم. ضع في اعتبارك أن القمم المكتشفة متشابهة عبر الأطياف عندما تكون قيم الكتلة / الشحنة (م / ز) ضمن نافذة 2,000 جزء في الدقيقة.
  2. تعريف النتيجة وحسابها. تصنيف الأطياف باستخدام التجميع الهرمي باستخدام خوارزمية جناح للتكتل ومصفوفة التباين بناء على مسافة Jaccard.
    ملاحظة: يقيس مؤشر Jaccard التشابه بين مجموعات العينات المنطقية (أي وجود / عدم وجود قائمة من القمم).
  3. مقارنة الأطياف والعرض.
    1. تحليل مخططات الأطياف الأولية. ملاحظة: يمثل المحور x نسبة m / z (في Daltons) ويمثل المحور y الشدة (الوفرة النسبية).
    2. تقييم التشابه بين الأطياف عن طريق التجميع الهرمي. تمثيل التشابه (أو الاختلاف) مثل مخطط الشجيرات.
    3. تقييم قابلية التكرار بمتوسط تمثيل عرض الهلام الافتراضي. ملاحظة: تمثيل عرض الهلام الافتراضي هو مخطط خريطة حرارية معدلة حيث يتم ترميز الوفرة النسبية بالألوان مع زيادة شدة اللون الأزرق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الهدف من البروتوكول الحالي هو إثبات دقة تقنية MALDI-TOF MS للخلية الكاملة في تقييم استجابة الخلايا البلعمية لبيئتها الدقيقة.

الشكل 1 يوضح تحضير البلاعم المحفزة من عينات الدم. الشكل 2 يمثل تحليل الخلايا الوحيدة والبلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة (MDMs) عن طريق قياس التدفق الخلوي. لاحظ أن الخلايا الوحيدة عبرت عن CD14 ولكن ليس CD68 (الشكل 1A). وعلى العكس من ذلك، عبرت MDMs عن CD68 ولكن ليس CD14 (الشكل 1B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول استخدام MALDI-TOF-MS على الخلايا الكاملة حقيقية النواة. هنا ، نوضح دقة الطريقة من خلال تحليل حالات التنشيط المتعددة للبلاعم استجابة لبيئتها المكروية.

يعتمد نجاح البروتوكول على عدد قليل من الخطوات الحاسمة. أولا ، قد يغير أي ملوث محلول الأطياف. على سبيل المثال ، من المهم غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني لإزالة وسط الثقافة وبروتينات المصل قبل الترسيب على الهدف. هناك حاجة أيضا إلى تركيز خلية يبلغ 1 × 105 خلايا / ميكرولتر لضمان نتائج قابلة للتكرار. ثانيا ، يعد التبلور خط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للإعلان. RO و JLM و CC هم مخترعو براءة اختراع دولية WO 2011/154650 ، تسمى "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

شكر وتقدير

ريتشارد ويدراوغو مدعوم بمنحة من وزارة سانتي (PHRC 2010). ونشكر لوران غورفيل وكريستوف فلودروبس ونيكولاس أمسترونغ على المساعدة التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المراجع

  1. Mass Gross, J. Spectrometry: A Textbook. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).
  2. Villanueva, J., et al. Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry. Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).
  3. Diamandis, E. P. Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations. Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  4. Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic. 11 (20), 2577-2591 (2005).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Mass Spectrometry and Protein Analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  7. Carbonnelle, E., et al. Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification. J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).
  8. Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains. J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).
  9. Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).
  10. Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PloS One. 5 (10), 13691 (2010).
  11. Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping. Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).
  12. Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).
  13. Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages. J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).
  14. Amann, J. M., et al. Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).
  15. Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis. Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).
  16. Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections. Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).
  17. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).
  18. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  19. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  20. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
  21. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).
  22. Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms. J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).
  23. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).
  24. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  25. Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).
  26. Delaby, A., Gorvel, L., et al. Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency. J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).
  27. Gibb, S., Strimmer, K. MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data. Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الخلايا الوحيدةالخلايا الموجبة لـ CD14قياس التدفق الخلويتحضير هدف MALDIمصفوفة CHCAالتحليل الطيفيالتمييز بين M1 وM2
خلية كاملة MALDI-TOF الطيف الكتلي هو الطريقة السريعة لدقة وتحليل أنماط مختلفة من تنشيط البلاعم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.