زرع الخلايا يمثل استراتيجية لعلاج انحطاط الشبكية تتميز بفقدان مستقبلات ضوئية. هنا نصف طريقة لإثراء المستقبلات الضوئية القابلة للزراعة وتطعيمها تحت الشبكية في الفئران البالغة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع تحت الشبكية من MACS تنقية الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية في شبكية العين الماوس الكبار
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويمثل ضعف البصر والعمى الناجم عن فقدان خلايا استشعار الضوء في شبكية العين، أي المستقبلات الضوئية، السبب الرئيسي للإعاقة في البلدان الصناعية. يمثل استبدال المستقبلات الضوئية المتحللة عن طريق زرع الخلايا خيارا علاجيا محتملا في التطبيقات السريرية المستقبلية. في الواقع، أظهرت الدراسات السابقة السريرية الحديثة أن المستقبلات الضوئية غير الناضجة، المعزولة عن شبكية عين فأرة حديثي الولادة في اليوم الرابع بعد الولادة، لديها القدرة على الاندماج في شبكية العين الماوس الكبار بعد زرع تحت الشبكية. ولدت الخلايا المانحة مورفولوجيا مستقبلات ضوئية ناضجة بما في ذلك الأجزاء الداخلية والخارجية ، وجسم خلية مستديرة تقع في الطبقة النووية الخارجية ، ومحطات متشابكة على مقربة من الخلايا ثنائية القطب الذاتية. والواقع أن التقارير الأخيرة أظهرت أن المستقبلات الضوئية المانحة تندمج وظيفيا في الدوائر العصبية للفئران المضيفة. لتطبيق السريرية في المستقبل من هذا النهج استبدال الخلايا، تعليق تنقية الخلايا التي تختارها يجب أن تتولد ووضعها في الموضع الصحيح للاندماج السليم في العين. لإثراء سلائف المستقبلات الضوئية، ينبغي أن يستند الفرز إلى مستضدات سطح الخلية المحددة لتجنب التعديل الوراثي للمراسل للخلايا المانحة. هنا نعرض فرز الخلايا المرتبطة بالمغناطيسية (MACS) - إثراء سلائف مستقبلات ضوئية قضيب قابلة للزراعة معزولة عن شبكية العين الوليدية للفئران المراسلة الخاصة بالمصولجان الضوئي استنادا إلى علامة سطح الخلية CD73. الحضانة مع الأجسام المضادة لمكافحة CD73 تليها الأجسام المضادة الثانوية المقترنة حبة صغيرة سمح لإثراء السلائف مستقبلات ضوئية قضيب من قبل MACS إلى ما يقرب من 90٪. بالمقارنة مع قياس التدفق الخلوي ، فإن MACS لديه ميزة أنه يمكن تطبيقه بسهولة على معايير GMP وأنه يمكن فرز كميات عالية من الخلايا في فترات زمنية قصيرة نسبيا. أدى حقن تعليق الخلايا المخصب في الفضاء تحت الشبكي للفئران البرية البالغة إلى ارتفاع معدل التكامل بمقدار 3 أضعاف مقارنة بتعليق الخلايا غير المفحذ.
المقدمة
الرؤية هي واحدة من الحواس الرئيسية للبشر. ويشكل ضعف هذا الشعور والعمى أحد الأسباب الرئيسية للإعاقة في البلدان الصناعية. السبب الرئيسي لضعف البصر أو العمى هو انحطاط الشبكية ، الذي يتميز بفقدان الخلايا المستقبلة ضوئيا ، حيث يمكن ملاحظته في الضمور البقعي ، والتهاب الشبكية الصباغي ، وضمور المخروط القضيب ، وغيرها من الحالات. حتى الآن، لا يتوفر علاج فعال لاستعادة الرؤية المفقودة. في 2006 و 2008 ذكرت مختبرين مختلفين, مستقلة عن بعضها البعض, زرع ناجحة من الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية قضيب في شبكية العين الفئران البرية الكبار1,2. وهكذا، تنشأ إمكانية زرع الخلايا السليفة مستقبلات ضوئية أيضا في شبكية العين المنحطة، لتحل محل مستقبلات ضوئية منحطة واستعادة الرؤية. في الواقع، وقد ثبت مؤخرا، أن مثل هذه الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية زرع تثير معايير مورفولوجية من مستقبلات ضوئية ناضجة من النوع البري، مثل الأجزاء الخارجية المتقدمة بشكل صحيح3،المحطات متشابك على مقربة من الخلايا ثنائية القطب الذاتية وجسم الخلية المستديرة الموجودة في الطبقة النوويةالخارجية 2-4،فضلا عن القدرة على الاندماج وظيفيا في الدوائر العصبيةالمضيفة 5-7. أحد المبادئ الرئيسية لهذه الاستراتيجية هو استخدام الشبكية الفئران الصغيرة بعد الولادة اليوم 4 (PN 4، PN0 كما يوم الولادة)، مما أدى إلى خليط من أنواع مختلفة من الخلايا لزرع. على خلفية تطبيق علاجي في المستقبل ، يجب تنقية هذا الخليط لخلايا السلائف المستقبلة. وقد وصفت CD73 كأول علامة سطح الخلية محددة لتصورات ضوئية الشباب في شبكية العين8-10. هنا، ونحن نثبت طريقة تنقية الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية على أساس هذه العلامة سطح الخلية ومع استخدام تقنية فرز الخلايا المرتبطة المغناطيسية (MACS). قد يكون ل MACS مزايا بالمقارنة مع تقنيات فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت ، نظرا لأوقات الفرز السريعة والتكيف الأسهل مع ظروف GMP. يمكننا أن نظهر إثراء ~ 90٪ ومعدل تكامل أعلى يصل إلى 3 أضعاف عند زرع السكان المخصبين في الفضاء تحت الشبكية في شبكية العين البرية الكبار. وهكذا، فإن المستقبل الضوئي القائم على MACS إثراء الخلايا السليفة وزرع تحت الشبكية، هي تقنيات موثوقة وواعدة لتطوير استراتيجية علاجية تجديدية لعلاج انحطاط الشبكية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بيان الاستخدام الأخلاقي ورعاية الحيوانات:
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للقوانين الأوروبية والألمانية (Tierschutzgesetz) وتم الالتزام ببيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة دريسدن و Landesdirektion Dresden (رقم الموافقة: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. قبل بدء تفكك الخلية وفرز الخلايا
- تسمية ثلاثة أنابيب رد فعل 15 مل مع: غسل (W)، كسر إيجابي (+) وكسر سلبي (-).
2. انفصال الشبكية
- قطع رأس الجراء PN 4 باستخدام مقص.
- شطف رأس الجراء قريبا في الإيثانول 70٪ تليها الغسيل في برنامج تلفزيوني.
- نقل الرأس إلى HBSS الباردة وتنجيل العين (كرر هذه الخطوة لجميع رؤساء). ل enucleate، افتح الجفون وركز العين مع ملقط منحني في منطقة العصب البصري. ثم سحب العين بعناية من المدار.
- بعد تجميل جميع العيون، قم بعزل الشبكية: أدخل مقصا مغلقا إلى العصب البصري وافتح الشفرات. بيل وRPE / chorid بها. إزالة العدسات والأوعية الدموية باستخدام ملقط منحني.
- نقل شبكية العين المعزولة إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل تحتوي على محلول papain (التي تقدمها عدة فك فصيلة papain).
- احتضان شبكية العين في محلول papain لمدة 30-60 دقيقة في حمام مائي أو شاكر (400 دورة في الدقيقة) في 37 درجة مئوية.
- في حين أن شبكية العين تحتضن في محلول الباباين ، ماصة 1 مل من محلول أوفوموكويد إلى أنبوب تفاعل 15 مل (التسمية "1").
- إضافة 60 ميكرولتر من DNase I (10 ملغ / مل) + 60 ميكرولتر من محلول أوفوموكويد (التي تقدمها عدة) + 520 ميكرولتر من EBSS إلى أنبوب رد فعل 15 مل (التسمية "2").
- بعد حضانة الباباين، نقل محلول papain التي تحتوي على شبكية العين هضمها جزئيا إلى أنبوب رد الفعل "2".
- باستخدام ماصة مصقول النار، وإجراء التفكك الميكانيكية (10x صعودا وهبوطا).
- ماصة تعليق خلية واحدة إلى أنبوب رد فعل "1". في محاولة لتوليد 2 طبقات بطبقات بلطف تعليق الخلية على رأس الحل ovomucoid.
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق بسرعة 300 × غرام (حوالي 1300 دورة في الدقيقة).
- تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
3. فرز الخلايا باستخدام المغناطيسية المرتبطة فرز الخلايا (MACS)
- إضافة X ميكرولتر الجرذ المضادة CD73 الأجسام المضادة ل500 ميكرولتر من أجل تحقيق تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل.
- احتضان 5 دقائق على الجليد.
- ملء أنبوب رد الفعل 15 مل إلى 10 مل مع MACS العازلة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق بسرعة 300 × ز.
- أزل الناتنات الفائق.
- Resuspend بيليه في 480 ميكرولتر MACS العازلة وإضافة 120 ميكروغرام من الميكروبات IgG الماعز المضادة للفئران.
- احتضان 15 دقيقة على الجليد; لا تحرض، يهز أو مزجها.
- ملء أنبوب رد الفعل 15 مل إلى 5 مل مع MACS العازلة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
- كما تم طرد أنبوب رد الفعل:
- ضبط عمود LS في الحامل المغناطيسي.
- وضع عامل تصفية preseparation أعلى العمود LS.
- هيدرات مرشح preseparation والعمود LS مع 3 مل MACS العازلة وجمع المخزن المؤقت MACS في أنبوب غسل (W).
- أزل الناتنات الفائق.
- Resuspend بيليه في 500 ميكرولتر MACS العازلة.
- قم بتحميل تعليق الخلية 500 ميكرولتر إلى الفلتر، ثم أضف 1 مل من المخزن المؤقت MACS إلى الفلتر واجمع الكسر السالب في أنبوب التفاعل السالب (-).
- بعد ذلك، أضف 3 × 3 مل من المخزن المؤقت MACS إلى العمود لغسل الخلايا غير المرتبطة بالعمود
- مرة واحدة هذه 9 مل هي من خلال العمود LS، وإزالة العمود من موقف المغناطيسي وتثبيته على رأس أنبوب رد فعل الكسر الإيجابي (+).
- تحميل بسرعة 5 مل من المخزن المؤقت MACS في العمود LS ووضع المكبس في العمود LS واضغط عليه حتى المخزن المؤقت بأكمله من خلال العمود.
- الطرد المركزي أنبوب رد الفعل الذي يحتوي على كسر إيجابي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
- إزالة supernatant، resuspend في 500 ميكرولتر من العازلة MACS والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية.
- عد إجمالي عدد الخلايا باستخدام جهاز عد الخلايا الشائعة.
- إعداد تعليق الخلية من كسر مفروز موجب يحتوي على 2 × 105 خلايا / ميكرول في المخزن المؤقت MACS والاحتفاظ عند 4 درجة مئوية
4. زرع MAC فرزها الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية في شبكية العين الماوس
- تأكد من أن يكون كل من الحلول التالية جاهزة: 1 مل برنامج تلفزيوني معقم أو HBSS، 10 ميكرولتر DNAse I، 1-2 مل deionized عقيمة H2O، aliquots من كسور تعليق الخلية في 4 درجة مئوية.
- تخدير الماوس الكبار(أي 2-4 أشهر من العمر) مع حقن داخل الصفاق من هيدروكلوريد ميدتوميدين (0.01 ملغ/10 غرام وزن الجسم), الكيتامين (0.75 ملغ/10 غرام وزن الجسم). ثم القيام بحقن تحت الجلد من البوبرينورفين (0.05 ملغ / كغ وزن الجسم) لتخفيف الألم.
- توسيع التلاميذ مع انخفاض فينيليفرين 2.5٪ تروبيكميد 0.5٪.
- إصلاح الماوس في حامل رأس الماوس ومكان تحت المجهر ستيريو.
- تطبيق قطرة من هلام Visidic لمنع تجفيف العين.
- جعل ثقب صغير على الحدود بين تصلب القرنية (على التوالي أورا سيراتا)باستخدام عقيمة 30 G 1/2 في إبرة.
- قطع غطاء الشريحة المشتركة إلى قطع صغيرة (حوالي 5 ملم × 5 ملم) باستخدام قلم الماس، ووضع واحدة من هذه القطع على رأس القرنية، مما يسمح التصور المباشر للشبكية.
- قم بغسل حقنة الميكرويتر المفروقة عدة مرات بالماء المتأين.
- تحميل حقنة ميكرولتر مع 1 ميكرولتر من تعليق الخلية، إبرة مباشرة عرضيا من خلال الملتحمة والشد ووضع تحت السيطرة البصرية في النصف الأنفي من شبكية العين.
- لكمة بلطف ثقب في شبكية العين حتى الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية، وحقن تعليق الخلية في الفضاء تحت الشبكية.
- مراقبة انفصال الثيران من شبكية العين، والتي ينبغي أن تكون موحدة، وتغطي ما يقرب من 1/4 من مساحة الشبكية دون أي نزيف.
- سحب الحقنة بلطف، ثقب الشبكية الأختام تلقائيا.
- اغسل حقنة الميكرويتر عدة مرات بالماء المتأين.
- تحرير الماوس من حامل الرأس.
- استيقظ الماوس عن طريق حقن هيدروكلوريد atipamozole لعكس تأثير هيدروكلوريد ميدتوميدين.
- ضع الماوس لوقت الاستيقاظ في غرفة مظلمة دافئة (حوالي 25 درجة مئوية).
- في اليومين التاليين بعد الزرع ، يجب إعطاء البوبرينورفين (0.05 ملغ / كجم من وزن الجسم) عن طريق الحقن تحت الجلد في الصباح وبعد الظهر لتخفيف الألم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
من أجل تقييم قدرة مستقبلات ضوئية قضيب على الاندماج في شبكية العين الماوس، تم استخدام خط مراسل الماوس، الذي هو مدفوع GFP من قبل سستة لووسين الشبكية العصبية (Nrl، Nrl-GFP) المروج11. Nrl هو أقرب علامة على مستقبلات ضوئية قضيب بدء التعبير في E12.5 طوال مرحلة البلوغ، مما يسمح وضع علامات محددة من الخلايا مستقبلات ضوئية قضيب المانحة.
تم قطع رأس الجراء PN 4 Nrl-GFP وتم تلقيح العينين. ثم تم عزل شبكية العين وانشقاقها باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه. ثم تم فرز تعليق الخلية الناتجة باستخدام MACS...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
زرع تحت الشبكية من الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية يمثل أداة موثوقة لتحقيق دمج هذه الخلايا الحساسة للضوء في شبكية العين المضيفة بأعداد كبيرة1,2. وهذا قد يسمح بإنشاء العلاج الخلوي لعلاج أمراض الشبكية التنكسية في المستقبل6. السكان المانحة من الخلايا، معزولة حاليا من شبكية العين PN 4، هو خليط من أنواع الخلايا المختلفة، والتي فقط الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية تتكامل بعد الحقن تحت الشبكية. باستخدام CD73 القائم على لجنة الهدنة العسكرية الفرز، يمكن زيادة نسبة مستقبلات ضوئية داخل تعليق الخلية المانحة إلى ≈ 90٪ التي تسمح بمعدل ت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نود أن نشكر أناند سواروب على توفير فئران Nrl-GFP ، وJochen Haas للحصول على الدعم الفني ، وسيندي بوهم وإيميلي ليسمان تربية الحيوانات.
تم دعم هذا العمل من قبل دويتشه فورشونجسجيمينشافت (DFG): FZT 111 - مركز العلاجات التجديدية درسدن، وبرنامج منح بذور CRTD، وSFB 655، و ProRetina e.V. المؤسسة، وبرنامج الدراسات العليا DIGS-BB درسدن، و Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| نظام تفكك Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | DNase I في الطريقة |
| المنقى للفئران المضادة للفأر CD73 ، استنساخ TY / 23 | BD Pharmingen | 550738 | تركيز المخزون 0.5 مجم / مل |
| الماعز المضاد للفئران IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | الحجم الإجمالي 2 مل |
| PBS | Gibco | 10010-015 | تستخدم لحساب العدد الإجمالي للخلايا |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | تستخدم لتفكك شبكية |
| العين Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | تستخدم لحساب العدد الإجمالي للخلايا |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| كيتامين 10٪ | نسبةفارم | 7538843 | |
| أنتيسيدان | فايزر | 76590 | |
| فينيليفرين 2.5٪ - تروبيكميد 0.5٪ | عيادات جامعية مرشحات الفصل المسبق لصيدلية | ||
| Miltenyi | 130-041-407 | ||
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| فاصل QuadroMACS | Miltenyi | 130-090-976 | |
| تلميع الحريق ماصة باستور | العلامة التجارية | 74777 20 | الماصة يجب أن تكون النصائح مصقولة بالنار وتعقيمها. |
| 15 مل رف أنبوبي | Miltenyi | 130-091-052 | |
| غرفة عد الخلايا | كارل روث | T728.1 | |
| أنابيب معقمة 15 مل يمكن | استخدام Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | بدلا من Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | من Leica M651 MSD |
| أوليمبوس مجهر ستيريو مقلوب CKX41 | أوليمبوس | CKX41 | |
| شفاط ثقافة الخلية Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 مل أنبوب التفاعل | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 مل أنبوب رد فعل | Sarstedt | 72695 | |
| طرد مركزي Eppendorf 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| حامل رأس الماوس | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| حقنة هاميلتون ميكرولتر 5 & micro ؛ ل ، 75RN | هاميلتون | 065-7634-01 | تم تسليمها بدون إبر |
| إبرة خاصة هاميلتون RN 34 جم | هاميلتون | 065-207434 | بلانت ، طول 12 مم |
| Vannas-T & uuml ؛ مقص زنبركي بينجن - شفرات 5 مم أدوات | العلوم الدقيقة | 15003-08 | |
| ملقط دومون # 7 - أدوات العلوم الدقيقة من التيتانيوم بيولوجي | 11272-40 | ||
| أدوات القلم الماسي | التقنية | ||
| 15 مم × 15 مم زلات الغطاء | شرر | MIC3366 |
المراجع
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
