Method Article

ثقافة الأنسجة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الابتدائية نخاع العظم الإنسان والأورام الخبيثة في

DOI:

10.3791/50947

⸱

March 8th, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Oncology, University of Alberta, 3Cross Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في طرق الثقافة القياسية تؤخذ خلايا من بيئتهم الفسيولوجية ونمت على سطح البلاستيك من صحن. لدراسة سلوك خلايا نخاع العظام البشرية الأولية أنشأنا نظام الثقافة 3-D حيث تزرع الخلايا تحت الظروف تلخص المكروية مواطن من الأنسجة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم زراعة الأنسجة أداة لا تقدر بثمن لدراسة جوانب كثيرة من وظيفة الخلية، من التطور الطبيعي للمرض. طرق زراعة الخلايا التقليدية تعتمد على قدرة الخلايا إما أن نعلق على التحتية الصلبة من صحن زراعة الأنسجة أو أن تنمو في تعليق في وسط سائل. وقد تم إنشاء خطوط الخلايا الخالد متعددة ونمت باستخدام هذه النهج، ومع ذلك، تفشل هذه الأساليب في كثير من الأحيان عندما تحتاج الخلايا الأولية التي يمكن زراعتها خارج الحي. ويعزى هذا الفشل إلى عدم وجود مكونات المصفوفة خارج الخلية المناسبة من الأنسجة المكروية من النظم القياسية حيث يتم استخدام البلاستيك زراعة الأنسجة كسطح لنمو الخلايا. المصفوفة خارج الخلية هو جزء لا يتجزأ من النسيج المكروية وجودها أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوظائف الفسيولوجية مثل الاستقطاب الخلية، والبقاء على قيد الحياة، وانتشار الأسلحة النووية. هنا نقدم الأنسجة 3 الابعاد طريقة ثقافة حيث نخاع العظم الأولية سلوتزرع ليرة سورية في المصفوفة خارج الخلية وضعت لألخص المكروية من العظام البشرية (نظام الإدارة القائمة على النتائج). جزءا لا يتجزأ في المصفوفة خارج الخلية، يتم تزويد الخلايا مع المواد المغذية من خلال وسيلة تستكمل مع البلازما البشرية، وبالتالي توفير نظام شامل حيث يمكن أن يستمر بقاء الخلية والانتشار لمدة تصل إلى 30 يوما مع الحفاظ على التركيبة الخلوية من النسيج الأساسي. باستخدام نظام الإدارة القائمة على النتائج لقد نمت بنجاح خلايا نخاع العظام الأولية من المانحين العادية والمرضى الذين يعانون من الداء النشواني، ومختلف الأورام الخبيثة الدموية. يسمح نظام الإدارة القائمة على النتائج لالمباشر، في مصفوفة التصور في الوقت الحقيقي من سلوك الخلية وتقييم فعالية قبل السريرية من علاجات جديدة. علاوة على ذلك، يمكن عزل الخلايا من الإدارة القائمة على النتائج في وقت لاحق واستخدامها لزرع في الجسم الحي، الفرز الخلية، والتدفق الخلوي، وتحليل الحمض النووي والبروتينات. أخذت معا، ويوفر طريقة RBM نظام موثوق لنمو العظام الأولية ماروث الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير زراعة الأنسجة لدراسة سلوك الخلية في بيئة تسيطر عليها للحد من التباين المنهجي عند مقارنة العمليات المختلفة في الكائنات سليمة. تأسست هذه الطريقة لأول مرة في أوائل عام 1900 1،2 ويشير إلى تقنية حيث كانت إإكسبلنتس الأنسجة مثقف فيفو السابقين في طبق زجاجي. في منتصف 1900s تم تعديل النظام لتنمو الخلايا المتفرقة بدلا من شظايا الأنسجة سليمة، وأصبح "زراعة الأنسجة" ومصطلح "ثقافة الخلية مرادفا 3. في مثل هذه الأنظمة زراعة الخلايا التقليدية تزرع الخلايا على سطح البلاستيك زراعة الأنسجة مضافين مع متوسط ​​النمو تستكمل مع عوامل النمو المختلفة. ظهرت نوعين من الثقافات على أساس قدرة التصاق الخلايا المختلفة:....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التحضير مسبقا

  1. الحفاظ على ماصات المصلية العقيمة ونصائح ماصة في 4 درجات مئوية.
    استكشاف الأخطاء وإصلاحها: المواد الهلامية Matrigel في درجة حرارة الغرفة (RT)، وسوف تستخدم ماصات الباردة ونصائح منع Matrigel من التبلور أثناء الإعداد الثقافة.
  2. ذوبان الجليد زجاجة من Matrigel في 4 درجات مئوية خلال الليل.

2. إعداد الكواشف

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    منذ خلايا نخاع العظام الأولية تفشل لتتكاثر في ظل ظروف زراعة الأنسجة القياسية، تم إنشاء نظام الإدارة القائمة على النتائج لتقليد عن كثب المكروية العظام، وتوفير نظام للثقافة وتوسيع الخلايا BM فيفو السابقين. أدمجت مكونات رئيسية من المصفوفة خارج الخلية BM، فبرونيكتين، والكولاجين الأول، الكولاجين الرابع، وlaminin 21، في الإدارة القائمة على النتائج مصفوفة لتوفير سقالة هيكلية لهذه الثقافة 3-D. السمحاق الداخلي المبطن للتجويف النخاعي، واجهة بين العظام وBM، غنية في الكولا.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    يوفر نموذج الإدارة القائمة على النتائج نظاما شاملا حيث يتم الاحتفاظ تكوين الخلوية من BM فيفو السابقين لمدة تصل إلى 30 يوما. BM الخلايا المزروعة في الإدارة القائمة على النتائج الذاتي تطبق وفقا لوظيفتها محاكاة عن كثب العمارة BM جدت في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، وهذا هو أول نظام يسمح للتوسع في المايلوما المتعددة استنساخ 8. أهم الخطوات الحاسمة لضمان نمو قوي من الخلايا BM والنجاح الشامل للثقافة هي: 1) للحصول على صحة السكان من الخلايا BM مع> 70٪ قابلية و.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الكتاب تعلن أي تضارب مصالح.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان (1R21CA141039)، BD جائزة العلوم البيولوجية منحة بحثية، والبحوث المؤسسية جمعية السرطان الأمريكية غرانت (IRG # 58-006-53)، إلى مركز جامعة بوردو للسرطان البحوث، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة، وبرنامج المبادرات بحوث السرطان مجلس ألبرتا. وأيد النائب من قبل المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، وبرنامج التدريب الداخلي الوقاية من السرطان (R25CA128770؛ PI: D. Teegarden) من قبل مركز علوم الأورام ومركز الأبحاث التعلم ديسكفري في جامعة بوردو تدار.

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    مجموعة انتشار CellTrace CFSE لقياس التدفقInvitrogen / Life TechnologiesC34554
    Fibronectin من البلازما البشريةMilliporeNG1884448
    Ficoll-Paque PLUSGE Lifesciences17-1440-02
    مصفوفة الغشاء القاعدي MatrigelBD Biosciences354234
    ذيل الجرذ الكولاجين من النوع الأولBD Biosciences354249لا يتم تدليج الكولاجين I من Millipore بشكل صحيح باستخدام هذا البروتوكول
    وسيط تركيب VECTASHIELD للتألق (مجموعة عادية)Vector LaboratoriesH-1000
    SigmaFast Red TR / Napthol AS-MX أقراصSigma-AldrichF4648لتلوين TRAP
    SigmaFast BCI / NBTSigma-AldrichB5655لتلوين الفوسفاتيز القلوي
    مجهر زايس متحد البؤر LSM 510  كارل زايس
    زايس 510 برنامجكارل زايستحليل الصور للتحليل متحد البؤر
    Zeiss Axiovert 200M المجهر المقلوب  Carl Zeiss
    MetaMorphالأجهزة الجزيئية برنامجتحليل الصور ل Axiovert 200M
    FACSort flow cytometer BD Biosciences
    CellQuest Pro software BD Biosciencesلتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
    الخلوي أقراص برنامج برنامج برنامج

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Carrel, A. On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
    2. Harrison, R. G. Observations on the living developing nerve fiber. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).
    3. Earle, W. R.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Three dimensional Tissue CulturePrimary Bone MarrowBone Marrow MatrixExtracellular MatrixCell IsolationFlow CytometryLight MicroscopyCell SortingNucleic Acid AnalysisProtein Analysis

    Related Articles