Method Article

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

DOI:

10.3791/51308

March 25th, 2014

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (mM)20
Vol. MHC II Stock to Add (ml)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

to:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (μM)20
Vol. MHC II Stock to Add (μl)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن فحوصات البيوكيميائية مع المؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم سريع، رؤى الكمي في تحديد حاتمة المناعية، الحذف، أو التصميم. هنا، يوصف مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II تحجيم لوحات 384 جيدا. هذا الشكل فعالة من حيث التكلفة يجب أن تكون مفيدة في مجالات deimmunization البروتين وتصميم لقاح والتنمية.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن فحوصات البيوكيميائية مع المؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم سريع، رؤى الكمي في تحديد حاتمة المناعية، الحذف، أو تصميم 1،2. هنا، يتم تحجيم مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II إلى تنسيق 384 جيدا. بروتوكول تقليص يقلل التكاليف بنسبة 75٪ كاشف والإنتاجية أعلى من البروتوكولات التي سبق وصفها جيدا 1،3-5 96. على وجه التحديد، والتصميم التجريبي يسمح تحليل دقيق وقابلة للتكرار تصل إلى 15 الببتيدات ضد واحد أليل MHC II في 384 جيدا لوحة ELISA. باستخدام السائل واحد التعامل مع الروبوت، وهذا الأسلوب يسمح أحد الباحثين لتحليل ما يقرب من تسعين الببتيدات اختبار في ثلاث نسخ على مجموعة من ثمانية تجمعات وأربعة أنواع أليل MHC الثاني في أقل من 48 ساعة. غيرهم من العاملين في مجالات البروتين deimmunization أو تصميم وتطوير لقاح قد تجد البروتوكول أن تكون مفيدة في تسهيل عملهم. على وجه الخصوص، وتعليمات خطوة بخطوة والشكل البصريمن إن الرب يجب السماح للمستخدمين الآخرين بسرعة وسهولة لإنشاء هذه المنهجية في مختبرات خاصة بهم.

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات هي أسرع فئة متزايدة من العوامل العلاجية وركزت التوسع السريع في خطوط الأنابيب biotherapeutic باهتمام متزايد على التحديات المرتبطة بالتنمية واستخدام العقاقير البروتين. ينبع اعتبار واحد فريد من نوعه من حقيقة أنه، في نظام المناعة الصحي والعمل، يتم أخذ عينات جميع البروتينات خارج الخلية بواسطة مستضد تقديم الخلايا (ناقلات الجنود المدرعة). مرة واحدة المنضوية بواسطة ناقلات الجنود المدرعة، والمشقوق بروتين الببتيد إلى شظايا صغيرة، ويتم تحميل شرائح المناعية المفترضة في أخدود من الدرجة الثانية البروتينات التوافق النسيجي الرئيسي المعقدة (MHC II). ثم يتم عرض المجمعات الببتيد-MHC II على سطح APC، والببتيدات مناعة حقيقية....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تضم أربعة أنشطة رئيسية مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II: 1 التجليد: الببتيدات اختبار تتنافس مع الببتيدات السيطرة مرقوم للمرحلة حل ملزم للذوبان البروتينات MHC II. ملزمة يقاس على مدى واسع من تركيزات الببتيد الاختبار. 2-الالتقاط: بعد اقتراب رد فعل ملزم التوازن، يتم التقاطها الببتيد-MHC II المجمعات وفصلها عن الببتيد غير منضم والبروتين عن طريق الاعتراف تعتمد على التشكل مع الأجسام المضادة يجمد. تم الكشف عن الملتقطة السيطرة الببتيد كميا باستخدام مضان حل الوقت: 3-كشفها. 4 التحليل: تتم معالجة البيانات الطيفية، وتآمر وتحليلها للتأكد تعتمد على الجرعة خصائص ملزمة اختبار الببتيد والبروتينات MHC II.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحليل تسلسل الببتيد ناضجة من الأمعائية المذرقية P99 بيتا اكتاماز (جيش تحرير بلوشستان) (بنك الجينات رقم # X07274.1) مع ProPred 16 لدنة الببتيد المفترضة لMHC II أليل DRB1 * 1501 (جدول 4). حددت ProPred 117 الببتيدات nonamer مع إلزامية P1 مرساة بقايا (أي M، L، I، V، F، Y، W أو في الموضع 1، وهو مطلوب لMHC II ملزمة 31). في عتبة 5٪، الببتيدات فقط مع عشرات أكبر من أو يساوي 2.6 المجلدات هي الأرجح. وبالتالي، على عتبة 5٪، ومن المتوق.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أنشأت Biotherapeutics نفسها باعتبارها حجر الزاوية في الطب الحديث، وهو ما يمثل أربعة من الخمسة الاوائل الأدوية مبيعا في عام 2012 32. وقد أظهرت قطاع الصيدلانيات البيولوجية النمو المطرد لعدة سنوات والتطوير المستمر للعوامل الرواية فضلا عن ظهور البدائل الحيوية وسعت خطوط الأنابيب الصيدلانية البيولوجية. والتطلع إلى المستقبل، وتقييم وتخفيف من العلاجات المناعية البروتين تصبح جزءا لا يتجزأ من التنمية biotherapeutic مرحلة مبكرة. لتسهيل هذه العملية، قد التقانات ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل ليونارد مويس قبل ويحمل خيارات الأسهم في EpiVax، وهي شركة مملوكة للقطاع الخاص شركة للتكنولوجيا الحيوية تقع في بروفيدانس، رود ايلاند. العمل الواردة في هذا التقرير البحثي خالية من أي تحيز التي قد تترافق مع الأهداف التجارية للشركة.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01-GM-098977-R21 وAI-098122 لبنك الكويت المركزي وKEG. وأيد RSS في جزء من زمالة مؤسسة لوسي وجزئيا على زمالة برنامج الابتكار ثاير ثاير من كلية الهندسة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
صوديوم رباعي هيدرات ديكاهيدراتسيجما221732
حامض الستريكسيجماC1901
ثنائي القاعدة فوسفات الصوديومسيجماS7907
تريزما هيدروكلوريكأومنبير9310
توين -20سيجماP7949
100٪ DMSOسيجماD8418
أوكتيل- & بيتا ؛ -D-GlucopyranasideFischer29836-26-8
Pefa Bloc SCFRoche1158591600
Dulbecco ' s 10x فوسفات مخزن محلول ملحيInvitrogen14200-166
DELFIA Assay BufferPerkin Elmer4002-0010
DELFIA Enhancement BufferPerkin Elmer4001-0010
Europium Labeled StreptavidinPerkin Elmer1244-360
L243 الأجسام المضادة HLA-DRBiolegend307602
Biotinylated ببتيدات التتبع21st القرن الكيماويات الحيويةطلب مخصص
الببتيدات (1-4 مجم ، 85٪ نقاء)GenscriptCustom Order
مونومرات HLA-DRB1 المنقاة (غير البيوتينيل) معهدأبحاث بينارويا *طلب
384 بئر لوحة EIA / RIAبيضاء حراري460372
بولي بروبيلين 384 بئركوستار3656
فيلم ، AxySeal ، 80 & مايكرو ؛ م ، قضيب ELISA   ؛Axygen AscientificPCR-SP
MilliQ WaterN / AN / A
Epimotion Liquid Handler (أو ما شابه)Eppendorf5075
Select TS Plate Washer (أو ما شابه)BioTek405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (أو ما شابه)الأجهزة الجزيئيةN / A
* يمكن الحصول على جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير البشري المؤتلف II من مختبر Benaroya Tetramer Core. انظر: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory
اختبار مخصص

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MHC II Binding AssayPeptide Epitope AnalysisHigh Throughput ELISASolution Phase CompetitionTime Resolved FluorometryPeptide MHC II ComplexImmunogenic Epitope IdentificationProtein DeimmunizationVaccine DesignLiquid Handling Robot

Related Articles