سطح حنوني هي منطقة فريدة من نوعها السلف في الجهاز العصبي المركزي الذي يتلقى اهتماما متزايدا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة للتلاعب الجيني السريع في هذه المنطقة السلف باستخدام أسلوب التثقيب الكهربائي تعديلها. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيقات الخلوية والجزيئية الأنساب الخلية ومسارات الإشارات المشاركة في تمايز الخلايا واستجلاء مصير وخصائص الخلايا الوليدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حديثي الولادة حنوني التثقيب الكهربائي السطحية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
على مدى السنوات العديدة الماضية تم التعرف على سطح حنوني كما محراب جرثومي من أهمية خلال الجنينية، ما حول الولادة والكبار العصبية وgliogenesis، بما في ذلك بعد الاصابة. ومع ذلك، وأساليب للاستجواب وراثيا هؤلاء السكان السلف وتتبع الأنساب الخاصة بهم كان محدودا نظرا لعدم وجود خصوصية أو تستغرق وقتا طويلا إنتاج الفيروسات. وبالتالي، فقد كان التقدم في هذه المنطقة بطيئة نسبيا مع عدد قليل من التحقيقات في هذا الموقع. وقد استخدم التثقيب الكهربائي لأكثر من عقد لدراسة خصائص الخلايا الجذعية العصبية في الأجنة، ومؤخرا في الدماغ بعد الولادة. نحن هنا وصف تقنية فعالة وسريعة، وبسيطة للتلاعب الجيني للأسلاف سطح حنوني استنادا إلى نهج التثقيب الكهربائي تكييفها. حنوني التثقيب الكهربائي سطح يسمح لوضع العلامات الوراثية السطحية والتلاعب من هذه الأسلاف، وبالتالي تمثل منهجا لتوفير الوقت واقتصادية لدراسة هذه الخلايا.
المقدمة
الخلايا الجذعية والسلف العصبية موجودة في جميع أنحاء الثدييات CNS 1، 2. طبيعة وخصائص في مناطق جرثومي الجنينية والكبار المحيطة المناطق البطين من الدماغ والحبل الشوكي التي تم توثيقها على نطاق واسع في العقد الماضي 1-3. في جزء كبير منه، وكان هذا نتيجة لتطور أدوات الجينية على نحو متزايد دقيقة، مثل الجهاز العصبي محددة إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية الأليلات floxed أو النسب فيروسات تتبع 4. ومع ذلك، المنطقة سلف واحد الفحص الشامل لديه منطقة حنوني السلف السطح فقط في الآونة الأخيرة وصفها بأي قدر من التفصيل 5-7 وينتظر.
يتم ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا الإجراء هو وفقا لمتطلبات سيناي IACUC. يجب أن المحققين ضمان الامتثال IACUC المؤسسية قبل المتابعة. ويجب تعقيم جميع الأدوات والكواشف قبل استخدامها.
1. إعداد أدوات، حلول، وخليط الحمض النووي
- إدراج 100 ملم البورسليكات النار مصقول أنابيب زجاجية الشعرية في مجتذب micropipette. تعيين التدفئة للسماح للسحب المرجح القياسية لتشكيل غيض من ماصة ما يقرب من 17.5 ملم. قطع نصائح مع مقص جراحي حادة على مسافة حوالي 8-9 ملم من بداية تلميح لإنشاء ما يقرب من 100 ميكرون قطرها الافتتاح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
حنوني السطح نتائج التثقيب الكهربائي في التعبير من الحمض النووي البلازميد في الخلايا معظمهم من الأسلاف، عند أو بالقرب من سطح حنوني 6. وبشكل أكثر تحديدا، واتجاه الأقطاب أمر بالغ الأهمية في فرض اتجاه حركة البلازميد والتعبير اللاحقة. وهكذا، في تكوينات القطب المزدوج، يتم توجيه البلازميد في حوالي متجه مباشرة بين القطب السلبي والإيجابي. لذلك، إذا تم وضع القطب السالب على موقع الحقن والقطب الموجب هو بطني إلى القطب السالب، ستضطر البلازميد في سطح حنوني. فمن المفترض أن توجيه الأقطا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الجانب الأكثر أهمية ل electroporation ناجحة من الأسلاف سطح حنوني هي: 1) استهداف مزيج البلازميد إلى سطح حنوني؛ 2) تجنب توليد القيلة في موقع الحقن؛ و 3) تجنب الوفيات المرتبطة التثقيب الكهربائي الدماغ المتوسط.
تستهدف بشكل مناسب سطح حنوني يتم تحقيق ذلك عن طريق قياس تعطيب وحذرا من الجمجمة لتجنب الاختراق من سطح حنوني. استهداف غير لائق على الجلد المغطي أو البطين الكامنة أو حمة الدماغ سوف يتضح من: 1) تشريد الصبغة الخضراء.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم من جائزة صموئيل Oschin الشامل منتدى معهد أبحاث السرطان السرطان فضلا عن أموال من معهد الطب التجديدي في سيناي، وغيران الأسرة. وأيد المشروع هو موضح في شكل كور قسيمة CTSI بتمويل من المركز الوطني للبحوث الموارد، منحة UL1RR033176، والآن في المركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم، منحة UL1TR000124. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب البورسليكات المصقولة للحريق | العالمية للأدوات الدقيقة ، وشركة | 1B100F-4 | |
| مجتذب الماصات | الدقيقة شركة أدوات السوتر | P-30 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich، Inc. | F7528 | |
| XenoWorks الرقمية Microinjector | Sutter Instruments Company | ||
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus ، BTX Instrument Div< / a | >45-0052 | |
| مم ملاقط بلاتين | هارفارد ، BTX Instrument Div | 45-0487 | |
| SignaGel Electrode Gel Cardinal | Health | 70315-025 | |
| Tris-EDTA Buffer ، درجة الحموضة 8.0 | Integrated DNA Technologies، Inc. | 11-01-02-05 | |
| مصباح حراري بالأشعة تحت الحمراء | VWR | 36547-009 | |
| مقص ناعم أدوات | العلوم الدقيقة | 14060-09 |
المراجع
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
