تشكيل مجمعات البروتين في الجسم الحي يمكن تصور من قبل ثنائي الجزيء تكامل مضان. وتنصهر شركاء التفاعل إلى أجزاء مكملة من العلامات الفلورية وأعرب عابر في أوراق التبغ، مما أدى إلى إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت على مقربة من البروتينات اثنين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العديد من البروتينات تتفاعل مع بروتينات أخرى عابر أو يتم دمجها في المجمعات متعددة البروتين لأداء الوظيفة البيولوجية الخاصة بهم. تكامل مضان ثنائي الجزيء (BiFC) هو أسلوب في الجسم الحي لرصد هذه التفاعلات في الخلايا النباتية. في بروتوكول المعروضة وتنصهر البروتينات مرشح التحقيق إلى نصفين التكميلية من البروتينات الفلورية وقدم يبني منها في الخلايا النباتية عن طريق التحول بوساطة الأجرعية. بعد ذلك، يتم التعبير عن البروتينات عابر في أوراق التبغ، ويمكن أن يتم الكشف عن إشارات الفلورسنت استعادة مع متحد البؤر المجهر المسح الضوئي ليزر في خلايا سليمة. وهذا يسمح التصور ليس فقط من التفاعل في حد ذاته، ولكن أيضا توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين يمكن تحديده. لهذا الغرض، تحتوي على جينات علامة علامة فلوري يمكن coexpressed جنبا إلى جنب مع ثوابت BiFC، وبالتالي تصور الهياكل الخلوية مثل رانه هيولي باطني شبكية، الميتوكوندريا، جهاز جولجي أو غشاء البلازما. يمكن رصد إشارة الفلورسنت إما مباشرة في خلايا البشرة ورقة أو في protoplasts واحد، والتي يمكن عزلها من أوراق التبغ تحول. هي مناسبة بشكل مثالي لدراسة BiFC البروتين البروتين التفاعلات في بيئاتها الطبيعية داخل الخلية الحية. ومع ذلك، فإنه لابد من النظر إلى أن التعبير يجب أن تكون مدفوعة من قبل المروجين قوية والتي يتم تعديلها الشركاء التفاعل بسبب الانصهار من علامات مضان كبيرة نسبيا، والتي قد تتداخل مع آلية التفاعل. ومع ذلك، BiFC هو نهج تكميلية ممتازة لتطبيق أساليب أخرى عادة التحقيق البروتين البروتين التفاعلات، مثل coimmunoprecipitation، في المختبر فحوصات المنسدلة أو التجارب الخميرة اثنين والهجين.
المقدمة
دراسة تشكيل مجمعات البروتين والتعريب في الخلايا النباتية في الجسم الحي لا بد من التحقيق في الشبكات الخلوية، مما يشير إلى والعمليات الأيضية. BiFC يسمح التصور من البروتين البروتين التفاعلات في البيئة الطبيعية مباشرة داخل الخلية النباتية الحية 1-5.
في BiFC الاقتراب من تكامل اثنين من شظايا وN-C-محطة nonfluorescent من الرصاص بروتين فلوري إلى بروتين فلوري المعاد. وقد استخدمت أجزاء من العديد من البروتينات الفلورية مختلفة للكشف عن تفاعلات البروتين، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وحامل اللون من الذي يتكون كيميائيا من قبل ثلاثة بقايا متمي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التحول من يبني BiFC في Agrobacteria
- استنساخ يبني BiFC
- تضخيم الجين من الفائدة من القالب المناسب باستخدام أليغنوكليوتيد] تحتوي المرافقة مواقع attB. إجراء PCR باستخدام البلمرة تصحيح التجارب المطبعية. التكيف مع طول الخطوة الصلب لمزيج التمهيدي تصميم وطول الخطوة استطالة وفقا لحجم جزء. التحقق من المنتج PCR بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام وتطهيره باستخدام PCR تنظيف كيت.
- أداء رد فعل BP مع جزء حصلت وناقلات ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذا المثال استخدمنا طريقة BiFC لرصد التفاعل بين عصاري خلوي الجزيئية HSP90 كوصي مع غشاء بروتينات الالتحام AtTPR7 وToc64. AtTPR7 هو جزء من translocon ثانية ويتفاعل مع المحرمين عصاري خلوي، والتي ربما تقديم preproteins إفرازية لإزفاء آخر متعدية إلى غشاء ER. وبالمثل، Toc64 في المغلف الخارجي بلاستيدات الخضراء تعمل في مجال الاستيراد بعد متعدية من خلال تلقي HSP90 preproteins بلاستيدات الخضراء المرتبطة بها. تضم كلا من البروتينات عصاري خلوي يتعرض نظام الحماية المؤقت المجال الذي يتوسط الت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عند التخطيط لتجربة BiFC ينبغي النظر في عدة نقاط. على الرغم من أن ليس لديه معلومات حول هيكلية البروتينات ذات الاهتمام المطلوب، طوبولوجيا أن يكون معروفا عند العمل مع غشاء تمتد البروتينات. البروتينات الفلورية يجب أن تتواجد في نفس المكان التحت خلوية أو مواجهة نفس الجانب من غشاء للسماح التفاعل. وبطبيعة الحال، عند تحليل البروتينات التي تتطلب تسلسل استهداف N-محطة، ويمكن اعتبار فقط علامة-C المحطة. لأنه من الممكن أن العلامة يتداخل مع الاستهداف السليم أو غشاء الإدراج من البروتين من الفائدة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نود أن نشكر يورغن سول لإجراء مناقشات مفيدة وكريس كاري لقراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وDFG فون دير chemischen اندستري (أرقام المنح SFB 1035 A04 مشروع لSS وهل 187/22 إلى RS).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3 &# 039 ؛ ، 5 &# 039 ؛ -Dimethoxy-4 &# 039 ؛ -hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase ، Onozuka-R10 | Serva | 16419 | من Trichoderma viridae< / em> |
| Macerozyme R-10 ؛ | Serva | 28302 | من Rhizopus sp.< / em> |
| GATEWAY ، BP Clonase II ، مجموعة الإنزيم | Invitrogen | 11789- (020) | |
| GATEWAY ، LR Clonase II ، مجموعة الإنزيم | Invitrogen | 11791- (020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel ومجموعة تنظيف PCR | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Invitrogen | Gateway-cloning |
المراجع
- Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
