تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

يتم تعريف الاكسدة تحديدا كشرط التي تنتج من الأكسدة الخلوية دولة غير متوازن. في تفاعلات الأكسدة والاختزال التي تحدث بشكل روتيني معقدة داخل الخلايا تحديد للدولة الأكسدة الخلوية. تتكون تفاعلات الأكسدة والاختزال لجميع التفاعلات الكيميائية التي تتكون في نقل الإلكترونات بين الذرات من الجزيئات البيولوجية المنتجة والحد من أكسدة الجزيئات (أي تفاعلات الأكسدة والاختزال). وحفزت هذه التفاعلات حسب الأنواع تفعيلها إلكترونيا (أي الأنواع الموالية للأكسدة)، والتي تتميز عدم الاستقرار الهيكلي المدقع وتفعيل عفوية من الإلكترونات غير متوازن التي تتبادل مع الجزيئات الحيوية المجاورة. ردود الفعل هذه غير منتظمة يؤدي إلى تلف الحمض النووي والبروتين كرسلة، وأكسدة الدهون، ويؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلايا ^1. وقد ارتبطت زيادة مستويات الاكسدة مع الشيخوخة والتقدم من مختلف الحالات المرضية ^2. الاكسدة لهاتم الإبلاغ عن أن تكون مسؤولة عن التعديلات الأوعية الدموية في مرض السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية ^3،4. إنها تلعب أيضا دورا حاسما في تنكس الخلايا العصبية في مرض الزهايمر ومرض باركنسون ^5. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت الاكسدة باعتبارها عاملا حاسما في تطور سرطان تنظم والأحداث النقيلي ^6،7. بالإضافة إلى ذلك، قد الالتهاب والاستجابات المناعية انتزاع والإجهاد التأكسدي ⁸ مزيد من الدعم.

في الخلايا الحية، وتستمد الأنواع الموالية للأكسدة من الأكسجين (ROS؛ أنواع الاكسجين التفاعلية) أو النيتروجين (RNS؛ الأنواع النيتروجين التفاعلي). ROS تشمل شق الهيدروكسيل، وأنيون الفائق ^(OH) (O ₂ ^-)، وبيروكسيد الهيدروجين (H ₂ O _2). وRNS الأساسي هو أكسيد النيتروز ^(NO). يمكن إنشاء سلسلة من الأنواع رد الفعل الثانوي بحلول التفاعلات عفوية بين:ن ROS وRNS أو المعادن الحرة أيونات ^9. على سبيل المثال، وأنيون الفائق يتفاعل مع أكسيد النيتروز لتشكيل peroxynitrate (ONOO ^-)، في حين H ₂ O ₂ التفاعل مع الحديد ^{2 +} يولد جذور الهيدروكسيل. ، وذلك بسبب قدرتها على التفاعل مع العديد من الجزيئات الحيوية، تعتبر ROS وRNS تهديدا خطيرا للحفاظ على الدولة الأكسدة الفسيولوجية ^10. للحفاظ مجهزة الخلايا الدولة الأكسدة مع سلسلة من الجزيئات إزالة السموم المضادة للأكسدة والانزيمات. وديسموتاز الفائق (الاحمق)، كتالاز، الجلوتاثيون البيروكسيداز وPeroxiredoxins تشكل أساسا مضادة للأكسدة الأنزيمية-الترسانة الخلوية التي توفر الحماية من الأنواع الموالية للأكسدة بما في ذلك H ₂ O _2، OH وOONO ^{- 11.} أيضا الجزيئات المضادة للأكسدة مثل فيتامين C و E، البوليفينول وCoenzymeQ10 (CoQ10) هي ذات أهمية حاسمة لإرواء ROS وخطيرة رفع أسمائهمrivatives ^12،13. ومع ذلك، والإنتاج المفرط للROS وRNS، أو اختلال وظيفي في النظام المضاد للأكسدة، وينقل للدولة الأكسدة الخلوية نحو ¹⁴ الاكسدة.

إلى جانب دلالة سلبية، ويمكن ROS تلعب مختلف الأدوار الفسيولوجية في خلايا المنشأ مختلفة. الخلايا تنتج عادة ROS كما يشير الجزيئات البيولوجية للتوسط الأحداث العادية مثل دفاع المضيف وإصلاح الجرح ^15-17. ويتم إنتاج أنواع رد الفعل عادة في الخلايا عن طريق الانزيمات داخل الخلايا مثل أكاسيد النيتروجين (NADPH أوكسيديز) وXO (Xantine أوكسيديز) استجابة لعوامل إشارة، عوامل النمو، وتقلبات داخل الخلايا لمستويات الكالسيوم ^18،19. وقد أفيد أن ROS قد تعدل تفاضلي النشاط من العوامل النووية الهامة مثل البروتين p53 أو المكونات الخلوية مثل ATM-كيناز، وهو المنظم الرئيسي للاستجابة لأضرار الحمض النووي ^20. بالقياس ROS تؤثر بشدة الإشارات الخلوية عن طريق التوسط عشره الأكسدة وتثبيط البروتين phosphatases التيروزين (PTPs)، التي أنشئت كما المنظمين الحرجة من نقل الإشارة ^21. وعلاوة على ذلك، ومنهجيات البروتين على أساس إثبات أن RNS مسؤولة أيضا عن التعديلات والتغييرات بروتين معين من الإشارات الجزيئية. RNS تتفاعل مع مجموعات ثيول السيستين تعديلها إلى S-nitrothiols (SNO) واثار المسارات الجزيئية يصاحب ذلك مع الحالات المرضية مثل أمراض المناعة الذاتية والتهابات ^22،23.

منذ تجارب زراعة الخلايا تتكاثر إلا جزئيا في العديد من العوامل التي تعمل في الجسم الحي، هو ذات أهمية كبيرة لإجراء دراسات الأكسدة في النماذج الحيوانية ^24،25. لتحقيق هذا، وقد اعتبر الزرد نموذج حيواني الفقاريات مناسبة لدراسة ديناميات الاكسدة ^26. الزرد هو نظام النموذج الجديد الذي يمنح العديد من المزايا لدراسة الأحداث الخلوية والجينية خلال الفقاريات ديفelopment والمرض. يمكن أن تتولد مجموعات كبيرة من الأجنة والمتاحة لتلبية الاحتياجات الأسبوعية التجريبية. وعلاوة على ذلك وضوح بصرية غير عادية من الأجنة الزرد، وكذلك صغر حجمها، وتمكن التصوير خلية واحدة وتتبع دينامية في الكائنات كلها ^27. في العقد الماضي، تم إنشاء عدد كبير من المسوخ الزرد لنموذج الإنسان الحالات المرضية مثل السرطان والأمراض الوراثية ^28-31. الأهم من ذلك، وقد تم إنتاج العديد من خطوط المعدلة وراثيا للسماح فرص واسعة من التلاعب الجيني والبيولوجي ^32. على سبيل المثال، تستخدم خطوط الزرد المعدلة وراثيا الأنسجة محددة بانتظام لفي الدراسات المجراة. هذه السطور التعبير عن بروتين فلوري تحت سيطرة المروج المحدد، توفر القدرة على تحديد الخلايا واحد في الجسم الحي، فضلا عن التركيب التشريحي أنهم يشكلون.

وقد استخدمت العديد من الدراسات السمية بالفعل رانه الزرد لتقييم تأثير المواد الكيميائية في الجسم الحي من على التوازن الأكسدة، مما يشير إلى مدى ملاءمة هذا الفقاريات بمثابة نموذج حيواني لمجال اكتشاف الأدوية والاكسدة ^33-35. على الرغم من أن قد تم اختبارها بعض تحقيقات الفلورسنت لرصد الاكسدة في اليرقات الزرد ^36،37، لا توجد فحوصات أنشئت لكشف وقياس مستويات الاجهاد التأكسدي في الأنسجة والخلايا الحية الزرد. نحن هنا وصف الإجراء لفي الجسم الحي الكمي الاكسدة في الخلايا من الأجنة الزرد الحية. أدوات التصوير، FACS الفرز، تحقيقات الفلورسنت والظروف المؤيدة للأكسدة يتم الجمع بين جميع لتوليد مقايسة بسيطة للكشف وتقدير من الأنواع المؤكسدة في الأجنة والأنسجة الزرد.

1. إعداد أدوات وحلول العامل

1. إعداد الحل أسماك المياه. جعل حل الأسهم عن طريق إذابة 2 غرام من أملاح البحر "المحيط الفوري" في 50 مل من الماء المقطر. إضافة 1.5 مل من الماء الأسماك الأسهم إلى 1 L الماء المقطر لإعداد جاهزة للاستخدام أسماك المياه (60 ميكروغرام / مل تركيز أملاح البحر النهائي). الأوتوكلاف جاهزة للاستخدام أسماك المياه قبل الاستخدام. يستخدم هذا الحل كما الزرد المتوسطة الجنين.
2. إعداد لميثيل الجنين في تصاعد مستمر. حل 1.5 غرام من ميثيل في 50 مل من الماء الأسماك العقيمة. تسهيل حل باستخدام المغناطيس على طبق من ضجة. قد تتطلب حل كاملة من مسحوق عدة ساعات. تحقق من الحل بالنسبة الوضوح وقسامة في أنابيب صغيرة. تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أشهر وذوبان الجليد من aliquots في الاستخدام. أجهزة الطرد المركزي في 950 x ج ميثيل في لمدة 5 دقائق قبل استخدام. تجنب تجميد أذاب دورات من مأخوذة.
3. إعداد 50 مل من تريكين / إيثيل 3 أمينوبنزوات مالملح ethanesulphonate (محلول المخزون) عن طريق إذابة 200 ملغ من تريكين في 100 مل من الماء وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام تريس، حمض الهيدروكلوريك 1 M (الرقم الهيدروجيني 9). تخزين هذا السهم عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 يوما. تنبيه: تريكين سامة. استخدام فقا للمبادئ التوجيهية التعامل المناسبة.
4. حمل الاكسدة في الأجنة الزرد
   1. إعداد الحل أكسدة لعام الحث الاكسدة: جعل 50 مل من محلول أكسدة بإضافة H ₂ O ₂ حل الأسهم (بيروكسيد الهيدروجين؛ 100 ملم) لأسماك المياه. استخدام H ₂ O ₂ من تركيز النهائي بين 2 مم و 100 ميكرومتر. إعداد هذا الحل قبل الاستخدام بفترة وجيزة. الحل أكسدة يمكن تطبيقها على كل من جبل بأكمله ROS-كشف وحيدة الخلية أساليب ROS-الكشف. لا تقم بتخزين هذا الحل. تنبيه: H ₂ O ₂ أمر خطير، وضار عن طريق الإستنشاق وإن بلع. اتصال مع المواد القابلة للاحتراق قد يسبب الحريق. التعامل تحت غطاء الدخان وارتداء بيرس المناسبةمعدات الوقاية اونال.
   2. يعد حل للأكسدة المستمدة من الميتوكوندريا الاكسدة الاستقراء: جعل حل الأسهم أكسدة (5 ملم) عن طريق إذابة 3.9 ملغ من روتينون في 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). إبقاء هذا الحل في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      1. حل روتينون محلول المخزون إلى 10 مل من الماء الأسماك لجعل جاهزة للاستخدام الحل. استخدام روتينون بتركيز بين 5-50 ميكرومتر. لا تستخدم روتينون بتركيزات أعلى من 100 ميكرومتر. بتركيزات مناسبة، وهذا الحل أكسدة يمكن تطبيقها على كل من جبل بأكمله ROS-كشف وحيدة الخلية أساليب ROS-الكشف. تنبيه: روتنون سامة وخطرة. التعامل مع البيانات التحذيرية وفقا المناسبة.
   3. حمل الاكسدة عن طريق الجينات تدق إلى أسفل: تدق إلى أسفل nrf2a التعبير الجيني في الأجنة الزرد بواسطة morpholino حقن مكروي كما ذكرت سابقا من قبل Timme-Laragy A. وآخرون، 2012 ^38.
   4. حمل OXIDاطر النسبية الإجهاد بعد تلف الأنسجة: توليد هامش الجرح في زعنفة الذيل من الأجنة الزرد في 72 HPF كما هو موضح سابقا من قبل Niethammer وآخرون، 2009 ^39.
5. إعداد 5 مل من محلول ROS-الكشف عن خلية واحدة طريقة ROS-الكشف:
   1. الحل لعام كشف ROS: ذوب التحقيق الجزيئية ROS-الحساسة عامة في HBSS (محلول الملح المتوازن هانكس و) من أجل إعداد حل العاملة (نطاق التركيز: 2،5 حتي 10 ميكرومتر). يجب أن يكون مستعدا هذا الحل قبل الاستخدام بفترة وجيزة.
   2. الحل للكشف محددة ROS الناجمة عن الميتوكوندريا: قبل الاستخدام بفترة وجيزة، حل مسبار ROS-الحساسة الميتوكوندريا مع DMSO صنع محلول المخزون 5 ملم. حل حل الأسهم في HBSS من أجل إعداد حل العاملة (مجموعة تركيز: 2،5 حتي 10 ميكرومتر).
      ملاحظة: تجنب الضوء والأكسجين تعرض حلول العمل ROS-كشف والحلول الأوراق المالية الخاصة بكل منها. حماية أنبوب من الضوء باستخدامورقائق الألومنيوم. لا تخزن أو تحقيقات إعادة استخدام الذائبة في HBSS. تخزين حلول السهم عند -20 درجة مئوية لمدة شهر.
      تنبيه: التعامل مع تحقيقات الجزيئية وDMSO تحت غطاء الدخان وفقا للمبادئ التوجيهية المناسبة.
6. إعداد 5 مل من محلول ROS-كشف لكامل طريقة جبل ROS-الكشف: ذوبي عام ROS-الحساسة محلول المخزون التحقيق (استقرت في DMSO) في HBSS من أجل إعداد حل العاملة (نطاق التركيز: 2.5-5 ميكرومتر). تجنب الضوء والتعرض للاكسجين. حماية أنبوب من الضوء. إعداد هذا الحل قبل الاستخدام. لا تخزن أو إعادة استخدام هذا الحل. تنبيه: التعامل مع تحقيقات الجزيئية تحت غطاء الدخان وفقا للمبادئ التوجيهية المناسبة.
7. جعل 25 مل من وقف الحل بإضافة 10 مل من مصل بقري جنيني إلى 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الحفاظ على محلول معقم. تخزين هذا الحل في 4 درجات مئوية. مطلوب هذا الحل الوحيد لخلية واحدة - ROS طريقة الكشف.
8. تعيين حاضنة الهواء الزرد في 28 و# 176؛ C.
9. تعيين أجهزة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لخلية واحدة طريقة ROS-الكشف.

2. التزاوج من أسماك الكبار واختيار الأجنة الزرد

1. يعبر انشاء الكبار الزوج الزرد وفقا لبروتوكولات القياسية ^40. حدد الخط المعدلة وراثيا المناسبة وفقا للاحتياجات المحددة التجريبية.
2. جمع البيض ووضعها في طبق 90 ملم مع أسماك المياه / الجنين المتوسط. الحفاظ على البيض عند 28 درجة مئوية حتى الأجنة وسوف تتطور وتنمو إلى مرحلة المرجوة التنموية (على سبيل المثال، 48 HPF، 72 HPF؛ HPF: التسميد آخر ساعة).
3. شاشة لتطوير الأجنة. استبعاد كل بويضة غير مخصبة أو الأجنة المتخلفة.
4. تخدير الأجنة عن طريق إضافة 1 مل من تريكين (محلول المخزون) في 50 مل من الماء الأسماك.
5. حدد تيراغرام الأجنة الفلورسنت تحت stereomicroscope.

3. معالجة الأجنة مع مؤكسد عامل

1. استخدام لا يقل عن 30 الأجنة بين 48 ساعةالجبهة الوطنية و72 HPF في حالة مختلفة. غسل الأجنة مرتين مع المياه العذبة الأسماك من أجل إزالة تريكين.
2. تقسيم الأجنة الفلورسنت إلى ثلاثة أطباق. وضع ما لا يزيد عن 30 الأجنة / الطبق.
3. إزالة حل الغسيل وإضافة 10 مل من محلول أكسدة أو 10 مل من الماء الأسماك كحل السيطرة.
4. احتضان الأجنة لمدة 10 دقيقة إلى 1 ساعة عند 28 درجة مئوية. فترة الحضانة يعتمد من مستوى الإجهاد التأكسدي للأن يتسبب في أنسجة معينة. فترات قصيرة هي أفضل ما تتأثر الخلايا الاكسدة الخضوع تدريجيا موت الخلية.
5. نقل الأجنة في طبق جديدة تحتوي على HBSS والأجنة يغسل يحوم. HBSS قبل دافئ عند 28 درجة مئوية.

4. الجامع جبل ROS طريقة الكشف

1. جمع الأجنة بعد العلاج أكسدة ووضع ما لا يزيد عن 10 الأجنة في أنبوب صغير. شطف مع HBSS قدر الإمكان. حماية أنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
2. إضافة 1 مل من محلول ROS-الكشف عنكل أنبوب.
3. احتضان الأجنة في الظلام لمدة 15 دقيقة عند 28 درجة مئوية لتجنب التعرض للضوء.
4. خلال فترة حضانة إعداد شريحة زجاجية لتحليل الجنين كله. وضع 300 ميكرولتر من ميثيل على "الاكتئاب" شريحة زجاجية وانتشاره على سطح الزجاج مع تلميح ماصة. تجنب فقاعات في حين الافراج عن ميثيل.
5. في نهاية فترة حضانة، وإزالة فورا الحل ROS-كشف ويغسل مرتين مع 2 مل من HBSS. غسل الأجنة عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. لا ماصة أو الدوامة.
6. الأجنة نضح يصل الى ماصة باستير الزجاج. الأجنة موقف قرب افتتاح ماصة بلطف وإخراج لهم في ميثيل. توجيه الأجنة بشكل مناسب مع خط النايلون غرامة.
7. مقارنة مضان الأجنة التحكم مع الأجنة المعالجة. بدلا من ذلك، وتحديد معالم stereomicroscope مضان أو متحد البؤر المجهر بحيث يتم تصوير جميع الأجنة باستخدام نفسإعدادات التصوير.

5. وحيد الخلية الطريقة ROS-الكشف

1. نبدأ من الخطوة: 3.5. تأكد من أن يكون لا يقل عن 35 الأجنة لكل حالة.
2. نقل الأجنة في طبق جديد. إزالة أسماك المياه قدر الإمكان. إضافة 10 مل من الجليد الباردة PBS 1X و 400 ميكرولتر من مثبطات البروتياز كوكتيل. dechorionate يدويا الأجنة مع ملقط وإزالة كيس الصفار مع إبرة رفيعة. ملاحظة: إزالة صفار كيس يضمن عينات نظيفة لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية التالية. ويمكن تجنب هذه الخطوة وفقا لنظام مراقبة الأصول الميدانية الصك.
3. نقل-yolked دي الأجنة في 24 لوحة جيدا multiwell (15 / الأجنة أيضا)، وإزالة جميع المياه الأسماك.
4. إضافة 300 ميكرولتر من HBSS، 30 ميكرولتر كولاجيناز P، 50 ميكرولتر التربسين EDTA-في كل بئر.
5. التجانس الأجنة بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا مع طرف ماصة ضيق (1،000 ميكرولتر).
6. احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، والتجانس العينات بواسطة pipetting كل 5 دقائق.
7. تحقق disr الأنسجةuption من خلال مراقبة قسامة من جناسة في المجهر المركب. تسهيل تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting. لا احتضان الأجنة لأكثر من 30 دقيقة.
8. وقف رد الفعل من خلال إضافة 200 ميكرولتر من وقف الحل. مزيج من قبل pipetting بلطف.
9. نقل تعليق الخلية في أنبوب قبل المبردة مع أسفل ضيقة. الحفاظ على أنبوب على الجليد وتجنب التعرض للضوء.
10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 XG في 4 درجات مئوية.
11. إزالة المرحلة العليا واعادة تعليق الخلايا مع الجليد الباردة HBSS بواسطة pipetting بلطف.
12. عد الخلايا وتأكد أن لديك نفس العدد من الخلايا في كل من العينات الخاصة بك. لا تستخدم أقل من 2 × 10 ⁶ خلايا.
13. خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 XG في 4 درجات مئوية.
14. إزالة طاف ووقف بيليه مع 1 مل من الجليد برود HBSS تحتوي التحقيق ROS-حساسة.
15. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق في الظلام. تختلف فترة حضانة وفقا لمستوى الاكسدة ولرانه حساسية من التحقيق.
16. نقل الخلايا إلى أنبوب FACS. إبقاء الأنابيب على الجليد وتجنب التعرض للضوء قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
17. فرز الخلايا مع خلية فارز مضان تنشيط (نظام مراقبة الأصول الميدانية). مجموعة موجات وفقا تيراغرام مضان الأنسجة (على سبيل المثال، GFP) وأطياف الإثارة / الانبعاثات من التحقيق الجزيئية المستخدمة للكشف عن ROS (على سبيل المثال، تحقيقات محددة ROS-الحساسة الميتوكوندريا، تحقيقات عامة ROS-الحساسة).
18. لكل حالة، وقياس جميع العينات ضمن نفس الدورة التجريبية خلال تطبيق إعدادات نظام مراقبة الأصول الميدانية نفسها. حساب النسبة المئوية للخلايا الفلورسنت مثل متوسط ​​مكررات البيولوجية المختلفة. تحليل اثنين على الأقل مكررات لكل حالة.

من خلال تطبيق الأسلوب هنا وصفها، ويمكن قياس بسهولة وكشف الاكسدة (ومستويات ROS) في الأنسجة الجنينية الزرد. بعد عبور الزرد الكبار، يتم جمع البيض ويسمح لتطوير عند 28 درجة مئوية إلى 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF). من أجل حمل الاكسدة، نقترح نهجين مختلفين: 1) معالجة الأجنة مع الكواشف قوية مؤيدة للأكسدة أو 2) تشجيع تشكيل ROS بعد إصابة الأنسجة.

في النهج الأول، قمنا بتوظيف اثنين من الكواشف مختلفة وفقا للاحتياجات المحددة: بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2)، حيث أن عام الخلوية وكيل ROS تشكيل، وروتينون، والسائق محددة ROS الميتوكوندريا. روتنون هو المانع من أنا معقدة من غيرها، والتي هي المسبب deregulations الاكسدة 41.

في النهج الثاني، ونحن يسببها تراكم ROS من خلال خلق الجرح في زعنفة الذيل من جنين الزرد39. بدلا من ذلك، يمكن تعزيز ظروف الاكسدة في الأنسجة الزرد بواسطة هدمت مع حقن morpholino في Nrf2 المسار استجابة للأكسدة التي هي الدفاع الخلوية الأولية من الآثار السامة للخلايا الاكسدة 38.

بمجرد يسببها الإجهاد التأكسدي في الأجنة الزرد، وتراكم أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) يمكن قياسها باستخدام تحقيقات ROS-حساسة معينة عامة أو الميتوكوندريا، والتي أصبحت الفلورسنت على تفعيل (أي أكسدة).

ويمكن تحليل الأجنة المعالجة باستخدام طريقة كله جبل ROS-كشف أو من خلال تطبيق واحد خلية ROS طريقة الكشف على النحو الموجز في الشكل 1. اختيار بين أساليب تعتمد على الحاجة لإجراء قياس النوعية أو الكمية من الاكسدة. وتتمثل النتائج ممثل كلا الأسلوبين في الشكل 2 والشكل 3.

كله طرق جبل ROS-الكشف

ويبين الشكل 2 تطبيق أسلوب كله جبل ROS-الكشف عن التصوير في الجسم الحي من الاكسدة. على وجه الخصوص، وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لمتابعة كل من "قوية" الاكسدة الناتجة عن العلاجات الموالية للأكسدة الخارجية فضلا عن "منخفض" الاكسدة المتولدة عن أكثر الظروف الفسيولوجية مثل الإصابات الجرح أو حذف الجينات.

وبفعل المستويات الفسيولوجية الأنواع المؤكسدة عن طريق توليد اصابة في الدقيقة أو الجرح واسعة في زعنفة الذيل من جنين الزرد حية في 72 HPF. وقد ثبت أنه بعد الإصابة، H 2 O 2 يتراكم في الجرح هامش 20 دقيقة بعد الجرح 39. من أجل تصور تراكم الاكسدة على هامش الجرح، وحضنت الأجنة مع عامالتحقيق ROS-حساسة وتصويرها في 20 دقيقة بعد اصابة 39. من خلال مقارنة زعانف الذيل سليمة مع ذيول جرح، فمن الممكن التمييز بين تراكم التحقيق الفلورسنت على هامش الجرح (الشكل 2A). تم الكشف غير محددة إشارة ضعيفة مضان في جميع أنحاء الأنسجة زعنفة الذيل في كل الظروف.

من أجل التحقق من صحة تراكم محددة من التحقيق ROS-الحساسة على هامش الجرح، وH 2 O 2 المستويات الجرح تم تخفيضها عن طريق نهج الدوائية. منذ أن ثبت أن هامش الجرح H 2 O 2 تراكم حساس للغاية لVAS2870 DUOX-39 المانع، والأجنة ما قبل المعالجة مع هذا المانع قبل اصابة. مقارنة بين مضان من التحقيق ROS-حساسة، من VAS الأجنة ما قبل المعالجة والضوابط منها، يشير إلى أن الإشارة تعتمد على تراكم ROS (أي H 2 O 2) (الشكل 2B).

بالإضافة إلى ذلك، نحن في تولد مستويات عالية من الأنواع المؤكسدة في الأنسجة الزرد عن طريق علاج الأجنة الزرد مع روتينون. وحضنت الأجنة المعالجة روتنون والضوابط مع لجنة التحقيق ROS تراعي عامة للكشف عن الأنواع ROS تحديدا. بعد ذلك، تم غسلها لجنة التحقيق من وتم تصوير الأجنة تحت المجهر مضان ستيريو. تم الكشف عن الإجهاد التأكسدي في الجسم كله من الأجنة (الشكل 2C). صور عالية التكبير تظهر المناطق التشريحية حيث يتم استقلاب التحقيق بنجاح (الشكل 2D). صور حقل مشرق (لوحات العلوي) تميز الهياكل التشريحية، بينما الصور مضان (لوحات أقل) تشير الخلايا ROS-الإيجابية. كما يتضح من الصور الفلورسنت النتائج هي أساسا تقرير النوعي للكشف الاكسدة، الذي يتحقق من خلال مقارنة التحكم مع الأجنة المعالجة.

خلية واحدة-ROS طريقة الكشف

الرقم 3 تقارير FACS ممثل المؤامرات وتقدير من الاكسدة عن طريق تطبيق خلية واحدة ROS طريقة الكشف. وقد تم تكييف هذه الطريقة لقياس مستويات الاكسدة في الخلايا الزرد التي تعرضت لظروف الموالية للأكسدة كما ورد في البروتوكول ومفصلة في الأساطير الرقم. كما وصفها، وقد تم قياس الاكسدة التي يحتضنها الأنسجة الزرد فصلها في الخلايا واحد مع لجنة التحقيق الجزيئية ROS-حساسة. منذ الإجراء تفارق ونظام مراقبة الأصول الميدانية في حد ذاته قد يسبب تلف الخلايا، يتطلب تحليل العينات التي فقط "الخلايا الحية" تعتبر لالتأكسدي الكميات الإجهاد. وفقا لذلك، ويتم تحليل الخلايا تنفصل عن طريق اختيار جزء من الخلايا تظهر "الخلية الحية" المعلمات المادية (الشكل 3A) واستبعاد الخلايا الميتة (الشكل 3B). وبالتالي، يتم quantitated العينات لمستويات الاكسدة وفقا لمضان من التحقيق ROS-الحساسة ومبديا مضان الذاتية مثل الإيجابية لGFP (الشكل 3C). ينبغي أن تدرج عينة السيطرة السلبية لتحقيق ROS-الحساسة من أجل تقييم الاكسدة الناجمة عن التعامل مع والإجراءات الفنية (الشكل 3C؛ وحة تحكم -). نظام مراقبة الأصول الميدانية النسبية مؤامرة الكمي تظاهروا في رسوم بيانية تبين قياسات مكررات البيولوجية المختلفة (الشكل 3D-E).

إلى جانب مستوى الإجهاد التأكسدي الكميات على العلاجات بيروكسيد الهيدروجين، وقد تم تطبيق هذا الأسلوب ل quantitate مستويات الاكسدة في الظروف الفسيولوجية مثل لنا في morphants nrf2a والضوابط منها (الشكل 3F).

علاوة على ذلك، من خلال الجمع بين وحيدة الخلية طريقة الكشف ROS مع تحقيقات ROS-حساسة معينة مثل لنا الميتوكوندريا ريال عمانيتحقيقات-S الحساسة، فمن الممكن أيضا لقياس الاكسدة في سياق العلاجات الموالية للأكسدة التي تستهدف الميتوكوندريا محددة (الشكل 3G).

الشكل 1. الشكل التخطيطي لطريقة لقياس مستويات ROS في الأجنة الزرد. وعبرت البالغين الزرد في خزانات تربية المناسبة. ثم يتم جمع البويضات المخصبة في الأطباق وتخزينها في 28 درجة مئوية للسماح للجنين لتطوير كامل يمكن تحقيقه. تحريض الاكسدة بطرق مختلفة، إما عن طريق العلاجات الدوائية أو عن طريق الشتائم وراثية أو المادية. بدلا من ذلك، في حالة تحليل متحولة الوراثية، فمن الممكن لتخطي هذه الحضانة والمضي قدما. عند هذه النقطة، فمن الممكن المضي قدما التالية طريقتين مختلفة. وفقا لصحيفة "كله مount ROS-الكشف عن "أسلوب (يسار)، وحضنت الأجنة الزرد فورا مع التحقيق الفلورسنت ROS-الحساسة (1) ومن ثم تحليلها مع مضان المجهر متحد البؤر أو (2). في "خلية واحدة ROS-الكشف عن" أسلوب (يمين)، وفصل الأجنة الزرد في الخلايا واحد (1)، حضنت مع الفلورسنت التحقيق ROS-الحساسة (2) وتحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية للكشف عن مضان وتحديد الكميات (3). في حين أن طريقة "جبل بأكمله-ROS كشف" يسمح الكشف الاكسدة في الأجنة الحية في المقام الأول باعتباره الفحص النوعي "خلية واحدة على أساس" منح الأسلوب على حد سواء القياسات الكمية من مستويات التوتر التأكسدي والنوعية.

وتعرض الشكل 2. نتائج ممثل كله طريقة جبل ROS-الكشف. A) الأجنة الزرد في 72 HPFلاصابة كما هو موضح سابقا من قبل Niethammer آخرون، 2009 39. تظهر الصور مبائر الممثل الأنواع الموالية للأكسدة (ROS) تراكم (رأس السهم) على هامش الجرح من الزعنفة الذيلية الجرحى. تم الكشف عن الأنواع المؤكسدة مع ROS التحقيق عام (CellROX؛ 2.5 ميكرومتر) 20 دقيقة بعد الجرح قد أحرز. شريط النطاق 20 ميكرون. B) وصور تبين مبائر الممثل هامش الجرح الأجنة الزرد في 72 HPF. كانت سابقة التجهيز الأجنة مع VAS2870 (20 ميكرومتر) أو DMSO لمدة 90 دقيقة قبل أحرز الجرح. تم الكشف عن ROS مع لجنة التحقيق العامة ROS-الحساسة (CellROX؛ 2.5 ميكرومتر) 20 دقيقة بعد الجرح. شريط النطاق 20 ميكرون. C) صورة الجسم كله يظهر الاكسدة التي يسببها روتينون في الأجنة الزرد. تم الكشف عن الاكسدة بقوة في المنطقة الذيلية من الأجنة كما هو موضح في لوحة D). روتنون هو المانع من امكانات ETC الميتوكوندريا التي تؤثر بشكل رئيسي skelخلايا العضلات ETAL في الزرد. شريط النطاق، 180 ميكرون.

الشكل 3. نتائج ممثل الخلايا واحد طريقة ROS-الكشف. أ) الممثل FACS مؤامرة تظهر عينة نموذجية من الأجنة الزرد نأت إلى الخلايا واحد. هي بوابات الخلايا الحية في المنطقة وفقا R1 مع FSC-H وSSC-H المعلمات. SSC-H: 539 (الجهد)، 1.0 (AmpGain)، الوضع: الخطية؛ FSC-H: E00 (الجهد)، 2.1 (AmpGain) B) الممثل FACS مؤامرة تظهر عينة نموذجية من الأجنة الزرد نأت إلى الخلايا واحد. قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وقد حضنت العينة مع يوديد propidium (PI؛ 1 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق. هي بوابات الخلايا الميتة على المنطقة وفقا R2 مع PI مضان (FL2-H قناة). FSC-H: E00 (الجهد)، 2.1 (AmpGain)، الوضع: الخطية، SSC-H: 539 (الجهد)، 1.0 (AmpGain)، الوضع: لىالقريب. قنوات الجهد: FL-2: 613 دخول C) FACS المؤامرات الممثل تظهر فصل الأجنة الزرد تعرض لمعاملة الموالية للأكسدة (H 2 O 2) والضوابط المعنية. وتصور الخلايا البطانية التي كتبها قناة GFP. المؤامرات FACS تمثل جميع الخلايا المتأثرة الاكسدة (ROS) على UL وUR. يتم رسم الخلايا سلبي على أقل الأرباع (LL وLR). TG (Kdrl: GFP) وحضنت الأجنة الزرد s843 في 48hpf مع H 2 O 2 (2 ملم) أو H 2 O عن السيطرة لمدة 10 دقيقة. قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، تتم معالجة الأجنة كما هو موضح في البروتوكول. تم الكشف عن الخلايا المتضررة من الاكسدة باستخدام مسبار عام ROS-الحساسة الفلورسنت (CellROX؛ 2.5 ميكرومتر). وقد شملت عينة لا المحتضنة مع التحقيق ROS-حساسة مثل السيطرة السلبية. مقارنة العينة تعرضوا لمعاملة الموالية للأكسدة مع التحكم الخاصة، وتآمر على عدد من الخلايا على الأرباع العليا (UL + UR) هو أعلى من ذلك. FACS المكتسباتكانت إعدادات ition على النحو التالي: قنوات الجهد: FL-1: 582 دخول؛ FL-4: 410 دخول D) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا (UL + UR) تتأثر الاكسدة في H 2 O 2 الأجنة المعاملة والسيطرة منهما. ترتبط القياسات لعينات هو مبين في C. تم الكشف عن الخلايا المتضررة من الاكسدة باستخدام مسبار عام ROS-الحساسة الفلورسنت (CellROX؛ 2.5 ميكرومتر). النتائج هي متوسط ​​ن = 2 مكررات البيولوجية المختلفة ± SD. E) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا البطانية (GFP +) تتأثر الاكسدة (ROS +) في H 2 O 2 الأجنة المعاملة والسيطرة منهما. ترتبط القياسات لعينات هو مبين في C. النتائج هي متوسط ​​ن = 2 مكررات البيولوجية المختلفة ± SD. F) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا المتضررة من الاكسدة (ROS +) في morphants nrf2a (nrf2a MO) والضوابط المعنية(السيطرة MO) في 24 HPF. النتائج هي متوسط ​​ن = 2 مكررات البيولوجية المختلفة ± SD G) الرسم البياني تظهر النسبة المئوية للخلايا المتضررة من الاكسدة الميتوكوندريا في الأجنة المعالجة (روتنون؛ 10 ميكرومتر) والضوابط المعنية (السيطرة؛ DMSO) في 72 HPF. بعد تفكك خلايا الأجنة في واحد، وقد تم قياس الاكسدة الميتوكوندريا (الميتوكوندريا ROS +) مع لجنة التحقيق الميتوكوندريا محددة (MitoSOX؛ 5 ميكرومتر). النتائج هي متوسط ​​ن = 3 مكررات البيولوجية المختلفة ± SD.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.