مقالة منهجية

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/51345

⸱

مارس 28, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Micro-BioRobotics @SSSA, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Department of Biology, University of Pisa, 3Center for Biomolecular Nanotechnologies @UniLe, Istituto Italiano di Tecnologia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل التفاعل جسيمات متناهية الصغر مع مجموعات سكانية فرعية محددة من الخلايا المناعية بواسطة التدفق الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهبوا النانوية المهندسة مع خصائص واعدة جدا لأغراض علاجية وتشخيصية. يصف هذا العمل وسيلة سريعة وموثوق بها من تحليل التدفق الخلوي لدراسة التفاعل جسيمات متناهية الصغر مع الخلايا المناعية. الخلايا المناعية الأولية يمكن تنقية بسهولة من الأنسجة البشرية أو الماوس عن طريق الأجسام المضادة التي تتوسط العزلة المغناطيسي. في المقام الأول، والسكان مختلفة من الخلايا تعمل في عداد الكريات تدفق يمكن تمييزها من الضوء إلى الأمام ومتناثرة (FSC)، والذي يتناسب مع حجم الخلية، وضوء متناثرة الجانب (SSC)، ذات الصلة إلى الخلية التعقيد الداخلي. وعلاوة على ذلك، والأجسام المضادة fluorescently المسمى ضد مستقبلات محددة سطح الخلية تسمح بتحديد عدة مجموعات سكانية فرعية داخل نفس العينة. في كثير من الأحيان، كل هذه الميزات تختلف عندما عزز الخلايا عن طريق مؤثرات الخارجية التي تتغير حالتها الفسيولوجية والمورفولوجية. هنا، 50 نانومتر FITC-شافي تستخدم 2 النانوية كنموذج لتحديد اله استيعاب المواد ذات البنية النانومترية في الخلايا المناعية في الدم البشري. مضان الخلية وزيادة خفيفة متفرقة الجانبية بعد الحضانة مع النانوية سمح لنا لتحديد الوقت والاعتماد تركيز التفاعل بين الخلايا جسيمات متناهية الصغر. وعلاوة على ذلك، ويمكن تمديد هذا البروتوكول للتحقيق رودامين-شافي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة 2 جسيمات متناهية الصغر الأولية، والخلايا المناعية العصبي المركزي نظام المقيمين، معزولة عن فئرانا معدلة وراثيا التي تعبر عن وجه التحديد بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في نسب الوحيدات / البلاعم. أخيرا، التدفق الخلوي وتأكدت البيانات المتعلقة جسيمات متناهية الصغر الداخلي في الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد متناهية الصغر هندسيا والملهم في الوقت الحاضر اهتمام علماء الحياة عن التطبيقات المحتملة لالطب الحيوي 1. هناك طائفة واسعة من المواد العضوية وغير العضوية يمكن أن تستخدم لإنتاج النانو ذات أشكال مختلفة، والميزات المادية الكيميائية. بين هذه الهياكل، تظاهر النانوية المهندسة من الشكل الكروي إمكانات كبيرة للطب التشخيص ومتعدية 2. هي التي تحرك الأساسية وتصميم السطح قبل تطبيق ممكن، وأنه ينطوي على دراسة عميقة من استجابات الخلايا المستهدفة التالية جسيمات متناهية الصغر الاتصال والتفاعل. سوف النانوية التي يعتقد على أن تدار بشكل متعمد لمواضيع الإنسان تأتي في اتصال مباشر مع عدة أنواع من الخلايا المناعية. مسؤوليتهم للحفاظ على سلامة الجسم يجعلها موضوعا حيويا للتحقيق في لطب النانوي 3.

الجزء الخلوية في الجهاز المناعي الفطري تتمثل أساسا عن طريق البلعمة؛ الأكلcytes. فيما بينها، ونسب الوحيدات / بلعم الخلايا المشتقة، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة نظام العصبي المركزي، ولعب دورا رئيسيا في الدفاع المناعي 4،5. وهم قادرون على تحريك ردود وقائية في غضون ساعات قليلة بعد أن واجهت مع جهات أجنبية. علاوة على ذلك، خلايا الوحيدات تنسيق وإرشاد الاستجابة المناعية التكيفية من خلال الإفراج عن السيتوكينات. تحدث كل هذه الأحداث حتى في وجود مواد هندسيا، التي ينظر إليها إلى حد كبير "السوى" من قبل النظام المناعي 6.

من بين الأساليب المستخدمة في علم المناعة تاريخيا لتحليل الخلايا، والتدفق الخلوي تمثل واحدة من أقوى الأدوات. علاوة على ذلك، توفر تقنيات لتحديد أو تنقية جزء من السكان مناعية معينة (غالبا ما تستغل الاستبعاد أو وجود بروتين واحد غشاء واحد) يسمح التحقيق الدقيق للآثار جسيمات متناهية الصغر معينة على أن م الابتدائي خاصةنوع ليرة لبنانية 7. ومع ذلك، قد الخلايا تقديم التعديلات الفسيولوجية والمورفولوجية بعد التعرض للجزيئات. كذلك، قد النانوية تتداخل مع المعلمات البصرية محددة، مثل امتصاص أو انبعاث الضوء عند أطوال موجية محددة، والتأثير على النتائج المتحصل عليها 8. لذلك، ينبغي اعتبار حدود الاستخدام والتكيف في نهاية الأمر المقايسات المناعية الكلاسيكية لدراسة المواد الجديدة.

هذا العمل يتناول الكشف عن التفاعلات جسيمات متناهية الصغر مع الخلايا المناعية الأولية من قبل التدفق الخلوي. لمعالجة هذه المسألة، و 50 نانومتر FITC-شافي كانوا يعملون 2 النانوية على أنها نموذج المواد متناهية الصغر لوصف الأسلوب. يمكن أن تنتج جسيمات السيليكا بطريقة دقيقة جدا في مقياس النانو متري. الحجم والشكل، والسطح الخصائص، مثل تهمة أو للا مائية، يمكن ضبطها بدقة لزيادة توافق مع الحياة الخاصة بهم 9. العديد من الميزات من شافي 2 النانوية تسمح لهم أن تستخدمنموذج لتسليم المخدرات الجسيمات 10. وعلاوة على ذلك، والأصباغ الفلورية أو نقاط الكم يمكن شرك أو مرتبطة هذه الجسيمات تقديم المفيد نانو أدوات لأغراض التصوير 11.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق

تم تجهيز العينات البشرية والحيوانية في أعقاب المبادئ التوجيهية من وزارة الصحة الإيطالية، والقانون 116/92 وتوجيه المجلس 86/609/EEC المجتمعات الأوروبية.

1. الثقافات الوحيدات الخليوي

  1. الثقافة الإنسانية THP-1 في الخلايا T-75 التي تحتوي على قوارير متوسطة RPMI-1640 تستكمل مع مصل الإنسان 10٪، 50 U / البنسلين مل و 50 ملغ / مل الستربتوميسين، 0.05 ملي β-المركابتويثانول عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
  2. الثقافات الانقسام عندما متموجة (كل 3-5 أيام).

2. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs) من بافي معاطف

  1. قبل البدء في بروتوكول العزلة، وإعداد محلول الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.2، 2 مم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، و 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، مضيفا 5 مل BSA الأسهم إلى 95 مل الحل الشطف العازلة (1: 20 التخفيف). ديغا المخزن المؤقت وابقائه الباردة (2-8° C).
    هام: عدم ديغا المخزن المؤقت قد يؤدي إلى نتائج أقل من المستوى الأمثل بسبب الفقاعات قد منع عمود العزلة (انظر الخطوة 3.2).
    ملاحظة: تخثر سترات الدكستروز صيغة-A (ACD-A) أو الدكستروز الفوسفات سترات (CPD) يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك. على العكس، يمكن أن البروتينات الأخرى الزلال أو الأمصال من الأنواع الأخرى استبدال BSA. لا تستخدم مخازن تحتوي على الكالسيوم 2 + أو + 2 ملغ.
  2. الحصول على المعاطف الشهباء من المتبرعين الأصحاء (الذين تتراوح أعمارهم بين 20-60 سنة).
  3. إعداد 50 مل أنابيب المخروطية لكثافة التدرج الطرد المركزي. تحديد عدد الأنابيب اللازمة لمعالجة الدم (كل أنبوب يمكن معالجة 35 مل من الدم المخفف) وإضافة 15 مل من Ficoll-Paque إلى كل أنبوب فارغ.
  4. تمييع 8 مل من الدم مع 24 مل من برنامج تلفزيوني / BSA / حل EDTA (1:4 تمييع).
  5. طبقة بعناية محلول مخفف على رأس Ficoll-Paque (الكثافة = 1.077 جم / مل) في كل من أنابيب مخروطية 50 مل. لا يختلطانالدم وFicoll-Paque.
    هام: لتجنب اختلاط الدم وFicoll-Paque، عقد الأنبوب في زاوية 45 درجة وطبقة الخليط الدم ببطء.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. سوف الخلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) لا تزال في واجهة البلازما Ficoll-Paque، في حين المحببة والرواسب الكريات الحمراء بسبب ارتفاع الكثافة في الضغط الاسموزي من Ficoll-Paque.
  7. نقل الخلايا الطور البيني (خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية، PBMCs) إلى 50 مل أنبوب جديدة مليئة PBS / جيش صرب البوسنة / EDTA وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. يغسل بيليه مرتين مع برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA لإزالة الصفائح الدموية. تدور في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  9. ثقافة الخلايا في كامل RPMI-1640 مع المصل البشري 10٪ والمضادات الحيوية أو الشروع في تنقية حيدات.

3. تنقية حيدات الابتدائية من PBMCs

  1. عزل حيدات من PBMCs بواسطة المغناطيسي الفصل باستخدام حبة هوملعموم الوحيدات العزلة عدة:
    1. تمر الخلايا من خلال شبكة 30 ميكرون نايلون (الفلاتر preseparation، 30 ميكرومتر) لإزالة كتل الخلية ممكن.
    2. تحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
    3. تعليق خلية الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). نضح طاف تماما.
    4. بيليه الخلية resuspend في 30 ميكرولتر من العازلة PBS / EDTA / BSA في 10 7 مجموع الخلايا.
    5. إضافة 10 ميكرولتر FCR حجب الكاشف لكل 10 7 مجموع الخلايا.
    6. إضافة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة البيوتين كوكتيل في 10 7 مجموع الخلايا.
    7. تخلط جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في 2-8 درجة مئوية.
    8. إضافة 30 ميكرولتر من العازلة في 10 7 مجموع الخلايا.
    9. إضافة 20 ميكرولتر من بلي مكافحة البيوتين في 10 7 مجموع الخلايا.
    10. تخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في 2-8 درجة مئوية.
    11. في resuspend تصل إلى 10 8 الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة PBS / EDTA / BSA.
  2. separ المغناطيسيأوجه
    1. وفقا لذلك إلى عدد الخلايا الكلي، واختيار العمود MACS المناسبة وMACS فاصل (انظر العمود MACS رقة البيانات).
    2. وضع عمود في المجال المغناطيسي للفاصل MACS.
    3. إعداد العمود قبل الشطف مع كمية مناسبة من PBS / EDTA / BSA العازلة (الأعمدة MS: 500 ميكرولتر؛ الأعمدة LS: 3 مل).
      ملاحظة: الأعمدة هي "وقف تدفق" و لا تجف.
    4. تنطبق على تعليق خلية العمود. جمع التدفق من خلال الخلايا التي تحتوي على أونلبلد، تمثل جزء الوحيدات المخصب.
    5. غسل العمود 3X مع برنامج تلفزيوني / EDTA / BSA العازلة (500 ميكرولتر لMS و 3 مل لLS في غسل).
    6. جمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر، تمثل خلايا الوحيدات المخصب، وإضافة إلى التدفق من خلال من القسم 3.2.4.
      ملاحظة: غسل العمود بإضافة PBS / EDTA / BSA مأخوذة العازلة فقط عندما يكون الخزان عمود فارغ.
    7. (اختياري) إزالة عمود منفاصل ووضعه على أنبوب جمع مناسبة. ماصة العازلة على العمود (الأعمدة MS: 1 مل؛ الأعمدة LS: 5 مل). طرد فورا من الخلايا nonmonocyte المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود.
    8. ثقافة تنقية حيدات في استكمال RPMI-1640 مع المصل البشري 10٪ والمضادات الحيوية.

4. تنقية الدم وحيدات الابتدائية من الجامعة

  1. تنقية الدم من وحيدات كله كله باستخدام عدة الوحيدات الدم العزلة باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

5. جسيمات متناهية الصغر التطبع في الكريات البيض في الدم وتنقية وحيدات

  1. لوحة 5 × 10 5 خلية / مل (1 مل ​​/ جيد) من PBMCs المعزولة أو وحيدات إيجابية CD14 تنقيته في لوحة 12 جيدا.
  2. دوامة FITC-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر حل الأوراق المالية وresuspend في المتوسط ​​كاملة إلى تركيز العمل من 100 نانومتر.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من nanop العملالمادة التعليق (100 نانومتر) للعينات المعالجة للتوصل إلى جسيمات متناهية الصغر تركيز النهائي من 1 نانومتر. إضافة نفس الحجم من متوسطة كاملة لضوابط غير المعالجة إلى كل بئر.
  4. بعد 1 ساعة استيعاب جمع العينات في أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق منهم في 6،000 XG في RT.
  5. غسل بيليه مع 1 مل من العازلة تشغيل 3 دقائق في 6،000 XG في RT.
  6. resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من العازلة على التوالي. الخلايا هي الآن جاهزة للقراءة من قبل التدفق الخلوي.

6. عزل الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية (انظر Bertero وآخرون. 7)

7. Replating والمختلطة الدبقية متموجة خلية ثقافة

  1. غسل T-75 قارورة مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني (ث / س كا 2 + / + 2 ملغ)، ثم إضافة 10 مل من Versene واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقيقة.
  2. ماصة طاف صعودا وهبوطا عدة مرات من أجل فصل الخلايا من سطح T-75 وتذوبالمجاميع الخلية.
  3. نقل تعليق الخلية في أنبوب البولي بروبلين 15 مل. جمع كمية صغيرة من التعليق الخلوية لحساب الخلايا مع عدادة الكريات.
  4. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 300 XG في RT.
  5. إزالة طاف و resuspend بيليه في تركيز النهائي من 5 × 10 5 خلية / مل في مستنبت الدبقية كاملة.
  6. لوحة 0.5 مل / جيد في 24 لوحة جيدا، والسماح للخلايا تسوية لمدة 2-4 ساعة قبل العلاج جسيمات متناهية الصغر.

8. جسيمات متناهية الصغر التطبع في الخلايا الدبقية الصغيرة

  1. إضافة 500 ميكرولتر من مستنبت كاملة الدبقية (لضوابط غير المعالجة) أو 500 ميكرولتر من جسيمات متناهية الصغر التعليق 2X رودامين-شافي 2 في مستنبت كاملة الدبقية (للعينات المعالجة) إلى كل بئر.
  2. ماصة للسماح للخلايا المفرزة من الخلايا التمسك nonrapid-في نقاط زمنية المختار وجمعها في 2 مل أنابيب البولي بروبلين.
  3. إضافة 500 ميكرولترمن Versene إلى كل بئر واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم فصل جزء الخلية المتبقية وجمع كل عينة مع الخلايا المناظرة nonadhering من الخطوة السابقة.
  4. الطرد المركزي العينات لمدة 3 دقائق في 300 XG في RT.
  5. resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من AutoMACS تشغيل العازلة.

9. تلطيخ مع CD11b-VioBlue

  1. إضافة 10 ميكرولتر من VioBlue-CD11b البشرية / الماوس الضد إلى 100 ميكرولتر من تعليق خلية (نسبة 1:11) في إدارة العازلة واحتضان 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. إضافة 1 مل من العازلة تشغيل وخلط تعليق خلية.
  3. أجهزة الطرد المركزي كل عينة لمدة 3 دقائق في 300 × ز.
  4. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 100-150 ميكرولتر من العازلة على التوالي.
  5. قراءة العينات إلى عداد الكريات (تخزين العينات في 4 درجات مئوية بين الخطوات الماضيين).
    هام: قبل تحليل العينات، والمضي قدما في الحصول على تعويض من الإشارات المتداخلة طأطياف ن الانبعاثات الملحوظة بين fluorochromes مختلفة (النانوية تألقي مترافق أو الأجسام المضادة).

10. الانسكاب الطيفية أكثر من التعويض

  1. فتح "إعدادات أداة" مربع (موجودة في جميع البرامج الصك).
    ملاحظة: في حالة استخدام أداة مختلفة عن تلك التي ذكرت في المواد الجدول، يرجى الرجوع إلى دليل محدد أداة لاكتساب التفاصيل.
  2. الحصول على عينة غير المعالجة (بدون النانوية) في سرعة منخفضة فلويديك (إذا سمحت الصك). خلال الاستحواذ، وضبط يدويا إلى الأمام والجانب نثر (FSC وSSC، على التوالي) من خلال تنظيم قنوات الجهد.
    ملاحظة: تعديل وSSC FSC جداول محور من أجل رؤية السكان خلية كاملة في المؤامرة أفضل. أداة تحديد قالب لكل نوع من الخلايا في المصالح يمكن أن تنشأ وحفظها واستخدامها لعمليات استحواذ في المستقبل.
  3. فتح محددة"المنطقة" التبويب في البرنامج. رسم منطقة كبيرة المناسب ("البوابة") حول السكان المطلوب.
    ملاحظة: تدخيل النانوية يؤدي الى تحول SSC من الخلايا. إذا يقتصر بشكل وثيق جدا البوابة حول السكان خلية من الفائدة، فإن البيانات التي حصل عليها وربما يغيب جزء من الخلايا ليتم الكشف.
  4. استخدام عينتين غير ملوثين، واحدة للاستخدام كما عينة فارغة واحدة للحصول على تعويض ضد تلطيخ PI (اختياري)، وعينة واحدة واحدة ملطخة تألقي المناسبة لكل قناة مضان في الحصول على تعويض.
    ملاحظة: استخدام مختلف 1.5 مل أنبوب عينة لكل الأجسام المضادة تألقي مترافق لاستخدامها في وضع العلامات التجربة.
  5. فتح علامة التبويب "التعويض" في "إعدادات أداة" مربع. زيادة أو إنقاص عامل التعويض خلال الاستحواذ حتى كثافة مضان في القناة الجانبية هو تقريبا نفس لنقاط البيع تألقيومكنته السكان سلبية.
  6. الحصول على عينات المعالجة جسيمات متناهية الصغر بعد أن تم تعديل التعويض.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التدفق الخلوي هو أداة مفيدة لتحديد وتوصيف الخلايا المختلفة، وذلك هو الأسلوب المفضل لتحديد الخلايا المناعية محددة، مثل وحيدات، المحببة، والخلايا T والخلايا B، القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، والخلايا الجذعية (DCS)، والمجموعات السكانية الفرعية الأخرى من الكريات البيض.

في محاولة لتوصيف أفضل سلوك خلايا الدم البيضاء استجابة لالنانوية، أجرينا فحوصات الداخلي مع الكريات البيض الأولية المعزولة من الدم من المتبرعين الأصحاء (الشكلان 1 و 2) ومع خط خلية الوحيدات الإنسان (THP-1 الخلايا، الشكل 3) .

كما ورد في الشكل 1A، تم التعرف على المجموعات السكانية الفرعية الرئيسية الثلاثة الكريات البيض في الدم بشكل واضح إلى الأمام ونثر الجانبية بعد PBMCs العزلة. علاوة على ذلك، بعد FITC-شافي 2 العلاج، والخلايا الليمفاوية (الرمادي)، وحيدات (الازرق) والمحببة (أحمر) لديها ن مختلفةمعدل استيعاب anoparticle كما يتضح من الأخضر كثافة مضان (الشكل 1B). بروتوكول يسمح صفها تنقية CD14 حيدات الإيجابية الأولية من PBMCs. تقارير الشكل 2A تدفق الخلوي مؤامرة نقطة من CD14 + حيدات في وجود FITC-شافي 2. ويبين الشكل 2B-FITC شافي 2 تدخيل كميا في نفس الخلايا وأعرب في وغاريتمي الرسم البياني الحجم.

أجريت تجارب مماثلة على استيعاب THP-1 حيدات تعامل مع زيادة تركيزات FITC-شافي 2 النانوية. واستخدمت الخلايا غير المعالجة عن السيطرة السلبية. ويبين الشكل 3A زيادة تعتمد على الجرعة في نثر جنب مع الأمام دون تغيير في نثر THP-1 خط الخلية. في الشكل 3B، جنبا إلى جنب مع رسوم بيانية للSSC وFSC في كل FITC-2 شافي تركيز جسيمات متناهية الصغر اختبار، يعني كثافة مضان (Mويرد FI) الكمي. وتشير هذه البيانات إلى أن العلاج مع FITC-شافي 2 النانوية يؤدي الى استيعاب تعتمد على الجرعة في وحيدات التي أبرزها تعزيز تحبب الخلايا (الجانب نثر) ومضان (قناة خضراء).

للحصول على مزيد من الإيضاحات بشأن نوع من التفاعل بين الخلايا المناعية والنانوية، تم عزل الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية والخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا المناعة العصبي المركزي نظام المقيمين، وتنقيته. استخدام نموذج الفأر وراثيا معربا عن الخلايا الدبقية الصغيرة الخضراء الفلورسنت يسمح التصور من الآليات العصبية التهابات مختلفة. الماوس المعدلة وراثيا B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J المستخدمة في هذا العمل يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت سيطرة CX3CR1 المروج 12. بعد 7 أيام في المختبر (DIV)، ويظهر مضان المجهري ثقافة الدبقية الابتدائي مختلطة مع عدد كبير من الخلايا النجمية (GFP الخلايا الملتصقة السلبية ق) وبعض الخلايا الخضراء (GFP إيجابية، الشكل 5A). في هذا نموذج الفأر، ثلاثة مجموعات سكانية فرعية الدبقية يمكن تمييزها من قبل التدفق الخلوي مع واحد تلطيخ CD11b الضد: أول CD11b - GFP - (الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الأخرى)، ومجموعة متميزة الثاني من دبقية CD11b + GFP + الخلايا، و الثالث CD11b + GFP - حيوانية (الشكل 4A). هذين مجموعات سكانية فرعية الأخير على حد سواء قادرة على استيعاب النانوية مع زيادة الكفاءة طفيف من GFP + السكان (الذي يمثل الخلايا الدبقية الصغيرة غير ناضجة دوريات نسخ من CX3CR1 المروج)، كما يتضح من تحليل التدفق الخلوي (الشكل 4B). تدخيل حدث يمكن التحقق مزيدا من الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام نفس تركيز النهائي من رودامين-شافي 2 النانوية كما هو مبين في الشكل 5B.

= "دائما"> figure-results-1
الشكل 1. FITC-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر الداخلي في الكريات البيض في الدم المعزولة. A) إلى الأمام الممثل نثر (FSC) مقابل نثر الجانب (SSC) التدفق الخلوي مؤامرة نقطة من Ficoll-Paque الكريات البيض في الدم المعزولة. B) الأخضر مضان تراكب الرسم البياني مؤامرة من الكريات البيض في الدم الثلاثة الرئيسية مجموعات سكانية فرعية خلية في وجود من 1 نانومتر FITC-شافي 2 النانوية (+45 بالسيارات) لمدة 1 ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
2 جسيمات متناهية الصغر الداخلي في CD14 + حيدات المنقى. A) إلى الأمام الممثل نثر (FSC) مقابل نثر الجانب (SSC) التدفق الخلوي مؤامرة نقطة من تنقية حيدات إيجابية CD14. B) مضان أخضر الرسم البياني مؤامرة من الفئات السكانية الوحيدات تنقيته في وجود 1nM FITC-شافي 2 النانوية (+45 بالسيارات) لمدة 1 ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الرقم 3. آثار FITC-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر على استيعاب THP-1 الخلايا. A) إلى الأمام الممثل نثر (FSC) مقابل الجانب scatterinز (SSC) التدفق الخلوي مؤامرة نقطة من THP-1 خط خلية الوحيدات، وبعد ساعة من التعرض 1-FITC شافي 2 النانوية زيادة التركيز. B) التي تعتمد على تركيز الاختلاف من نثر الجانب (SSC)، ونثر الأمام (FSC) والأخضر مضان في وجود FITC-شافي 2 النانوية (+45 بالسيارات) لمدة 1 ساعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. رودامين-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر في استيعاب الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية معزولة عن B6.129P-CX3CR1 الفئران tm1Litt / J. أ) البروتين الفلوري الأخضر (GFP) مقابل تدفق CD11b-VioBlue الخلوي مؤامرة نقطة من العلاقات العامةالدبقية مختلطة imary معزولة عن B6.129P-CX3CR1 الفئران tm1Litt / J. وترد السكان في الجزء العلوي الأيمن والأرباع اليمنى السفلى، على التوالي B) مؤامرة مضان الأحمر تراكب الرسم البياني المجموعات السكانية الفرعية الخلايا الدبقية الصغيرة في وجود من 1 نانومتر رودامين-شافي 2 النانوية (+45 بالسيارات) لمدة 30 - CD11b + + GFP وCD11b + GFP. دقيقة (الرسم البياني الحمراء) مقابل التحكم (الرسم البياني الرمادي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الرقم 5. التصور من GFP +-الخلايا الدبقية الصغيرة. (A) الإسفار المجهري في 7 DIV و (ب) متحد البؤر المجهريمن رودامين-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر الداخلي (الأسهم الحمراء) في GFP +-الخلايا الدبقية الصغيرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم بروتوكول التجريبية نقطة حاسمة جدا أن تؤخذ بعين الاعتبار. من المهم حقا للعمل في 4 درجات مئوية (على الجليد)، وربما في الظلام خلال جميع الخطوات تلطيخ، بسبب ارتفاع درجات الحرارة والأضواء قد تؤثر سلبا على العائد تلطيخ. يمكن أن الجسيمات النانوية و sonicated معلق أفضل فقط قبل الاستخدام.

وتدفق تحليل الخلوي الصحيح يتطلب معايرة الصحيح في قنوات مختلفة. يجب أن يتم تنفيذ المعايرة الصك قبل كل دورة تجريبية. إلى جانب القضايا الفنية مع الأجهزة، ويمكن أن يكون هناك أيضا مشاكل مع وضع العلامات الأجسام المضادة. وهو إلزامي لاستخدام الأجسام المضادة في التركيز المناسب. إذا كان تركيز عالية جدا أو منخفضة جدا، يمكن أن شدة إشارة ديساتيسفيينج تكون العاقبة.

مساوئ هذا القلق تقنية الحاجة للعمل مع عينات monodisperse، وعدم القدرة على توطينموقع مصدر الإشارة (أي مقصورات الخلوية المختلفة). وهناك أيضا بعض القيود في اختيار fluorochromes لاستخدامها في تركيبة: الطول الموجي للإثارة ونطاقات الانبعاثات يجب فصل بما فيه الكفاية للسماح للقياس على النحو المناسب. إذا أطياف الأجسام المضادة المستخدمة تداخل، لا بد من التعويض الصحيح.

التدفق الخلوي هو وسيلة قوية لتحليل الخلية في وجود أو عدم وجود الجسيمات النانوية. يسمح هذا الأسلوب دراسة multiparametric لخلية، عددا كبيرا من الأحداث فحصها، سرعة تحليل (أكثر من 1،000 خلية / ثانية)، واستنساخ القراءات الإحصائية. يمكن معالجة العينات دون أن تفقد بقاء الخلية.

باستخدام جزيئات fluorescently المسمى فمن الممكن للتأهل وقياس استيعاب مجموعات سكانية فرعية في الخلية، والتي يتم تحديدها من قبل علامات محددة تعرض على غشاء الخلية. يمكن تغيير المعلمات الخلية في وجود ق النانوية pecific. اعتمادا على الهدف من البحث، وهذه الاختلافات يمكن أن تستخدم لتحديد ظاهرة معينة، مثل نثر الجانب من الخلايا التي يزيد نسبيا مع زيادة معدل استيعاب جسيمات متناهية الصغر.

التعديلات الناجمة عن جسيمات متناهية الصغر من سطح الخلية ويمكن أيضا تمثل الحد من هذه التقنية. لهذا السبب، يجب أن تؤخذ مستقبلات غشاء الخلية دوران دائما في الاعتبار وربما يعرف مقدما لتوصيف السكان الخلية الاهتمام على وجه التحديد. العاهات المدقع التناضح غشاء جسيمات متناهية الصغر في عينات زائد يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية.

سمية المواد متناهية الصغر التي تعتمد على الجرعة وينبغي اختبار تجريبيا لكل السكان الخلية. يجب استبعاد الخلايا الميتة واضحة المعالم من الكمي مضان. على سبيل المثال، Annexin V / PI تلطيخ هي واحدة من العديد من الأساليب المستخدمة عادة للكشف عن خلايا نخرية وأفكارك على حد سواء.

"> الخلايا الأولية، معربا عن GFP هي أيضا أداة قوية لتحديد جزء من السكان خلية معينة وجمع البيانات دون prelabeling. الجمع مع جزيئات الفلورسنت التكميلية يسمح الكمي سريع جدا ودقيق للتفاعل الخلايا جسيمات متناهية الصغر. ويعتقد المخدرات أو الجينات التسليم ل أن تتحسن في المستقبل من تطبيق النانوية قادرة على اطلاق سراح حمولة المخدرات محددة في الأنسجة المحددة.

توظيف النانوية جهري كما محددة ناقلات التسليم و / أو المناعي للالصيدلة يتطلب معرفة البيئة البيولوجية (أي من خلال التدفق الخلوي) لدراسة التفاعلات الخلية جسيمات متناهية الصغر.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أن Miltenyi التكنولوجيا الحيوية GmbH المزيد رعت تقديم هذه المخطوطة. HIQ نانو شركة ( http://www.hiq-nano.com/index.html ) هي تكنولوجيا النانو تدور خارج الشركة نشأت من IIT.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل FONDAZIONE ISTITUTO ايطالي دي TECNOLOGIA.
فإن الكتاب أود أن أنوه بيوتيك Miltenyi محدودة (بيرجيش جلادباخ، ألمانيا) لرعاية هذه المخطوطة، والدكتور باولو Petrucciani (قسم أمراض الدم والمناعة خدمة نقل، مستشفى وتي بونتيديرا، بيزا، إيطاليا) لتوفير المعاطف الشهباء الإنسان و البروفيسور ماسيمو Pasqualetti (قسم الأحياء - وحدة الخلوي وعلم الأحياء التنموي، جامعة بيزا، بيزا، إيطاليا) لإسكان مستعمرة الماوس.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
HBSSGibco14170-088دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
RPMI-1640 (معدل ATCC)GibcoA10491-01دافئ في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، الفينول الأحمرجيبكو41966-029
البنسلين - الستربتومايسين ، سائلجيبكو15140-122
جنتاميسينجيبكو15710-049
مصل الحصان (الكثير n & deg ؛ 1131917)جيبكو16050-122
& بيتا ؛ -ميركابتو إيثانولجيبكو21985-023
Trypsin 2.5٪Gibco15090-046
مصل بشريمجمع Invitrogen34005100
VerseneInvitrogen15040-033
DNAse ISigma AldrichD5025-150KU
CD11b-VioBlue للإنسان والفأرMiltenyi Biotec130-097-336
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec130-091-376
autoMACS محلول الشطف Miltenyi Biotec130-091-222
تشغيل العازلةMiltenyi Biotec130-092-747
autoMACS Running BufferMiltenyi Biotec130-091-221
طقم عزل الخلايا الأحادية البشرية  Miltenyi Biotec130-096-537
مجموعة عمود الدم الكاملMiltenyi Biotec130-093-545
الدم الكامل CD14 MicroBeads ،Miltenyi Biotecالبشري 130-090-879
MS العمودMiltenyi Biotec130-042-201
LS ColumnMiltenyi Biotec130-042-401
MidiMACS فاصلMiltenyi Biotec130-042-302
فاصل MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
محلول تحلل خلايا الدم الحمراء  Miltenyi Biotec130-094-183
مرشحات الفصل المسبق 30 & مايكرو ؛ mMiltenyi Biotec130-041-407
MACuant محلل مقياس التدفق الخلويMiltenyi Biotec130-092-197
MACuant معايرة الخرزMiltenyi Biotec130-093-607
Ficoll-Paque PremiumGE HealthcareGEH17544202
FITC-SiO2< / sub> الجسيمات النانوية (50 نانومتر ، +45 مللي فولت)شركة
الجسيمات النانوية الرودامين-SiO2< / sub> (50 نانومتر ، +45 مللي فولت)شركةHiQ-Nano
ذات 12 صفيحة فالكونبيكتون ديكنسون353043
HiQ-Nano

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, X. Q., et al. Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).
  2. Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles. Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).
  3. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Immunological properties of engineered nanomaterials. Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).
  5. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).
  6. Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462, 449-460 (2009).
  7. Bertero, A., et al. Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia. Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).
  8. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays. Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).
  9. Malvindi, M. A., et al. SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing. Nanoscale. 4, 486-495 (2012).
  10. Bardi, G. SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery. Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).
  11. Bardi, G., et al. The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance. Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).
  12. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Flow Cytometry AnalysisPrimary Immune CellsNanoparticle InternalizationCell Surface MarkersForward Scattered LightSide Scattered LightConfocal Microscopy ValidationMagnetic Cell IsolationNanoparticle Concentration Dependence

مقالات ذات صلة