كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

ملخص

هنا، نقدم طريقة لدينا أنشئت لإعادة برمجة الخلايا الجسدية الإنسان في iPSCs الإنسان خالية من التحوير مع فيروس سينداي، والذي يظهر نتائج متسقة وتعزيز الكفاءة.

الملخص

وقبل بضع سنوات، وإنشاء الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) إيذانا ببدء حقبة جديدة في مجال الطب الحيوي. الاستخدامات المحتملة لiPSCs الإنسان تشمل النمذجة التسبب في الأمراض الجينية البشرية، العلاج بالخلايا ذاتي بعد تصحيح الجين، وشخصية فحص المخدرات من خلال توفير مصدر للخلايا المريض أعراض محددة وذات الصلة. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات للتغلب عليها، مثل القضاء على ما تبقى من عامل إعادة برمجة التحوير التعبير بعد الإنتاج iPSCs الإنسان. الأهم من ذلك، يمكن التعبير التحوير المتبقية في iPSCs الإنسان غير متمايزة تعوق التفرقة السليم وتضليل تفسير مرض ذات الصلة في الظواهر المختبر. مع هذا السبب، تم تطوير خالية من التكامل و / أو iPSCs الإنسان خالية من التحوير باستخدام عدة طرق، مثل اتش، نظام piggyBac، ناقلات minicircle، ناقلات episomal، والتسليم المباشر وبروتين توليفها مرنا. ومع ذلك، وكفاءة reprogramming باستخدام أساليب خالية من التكامل منخفضة جدا في معظم الحالات.

هنا، فإننا نقدم وسيلة لعزل iPSCs الإنسان باستخدام سينداي الفيروسات (فيروس RNA) إعادة برمجة النظام القائم. يظهر هذا الأسلوب إعادة برمجة نتائج متسقة وعالية الكفاءة بطريقة فعالة من حيث التكلفة.

المقدمة

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لديها القدرة على تعدد القدرات في المختبر، ويكون تجديد الذات، والتي يمكن أن تكون مفيدة محتملة لنمذجة المرض، لفحص المخدرات، ووضع العلاجات المستندة إلى الخلايا لعلاج المرض وإصابات الأنسجة. ومع ذلك، hESCs وجود قيود لاستبدال العلاج الخلية بسبب الحواجز المناعية، الأورام والأخلاقية، ودراسة الجينات المرتبطة بالمرض، يمكن أن تكون معزولة hESCs بأمراض محددة من خلال ما قبل الزرع التشخيص الوراثي (PGD) النهج، لكنه لا يزال تحديا تقنيا والتبرعات الجنين نادرة جدا. وترتبط هذه القضايا إلى التقدم في بيولوجيا الخلايا الجذعية، مما أدى إلى تطور الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs).

يتم برمجتها iPSCs الإنسان وراثيا من الخلايا الجسمية الكبار الإنسان وتؤوي الجذعية تشبه الخلايا المحفزة ميزات مشابهة لhESCs، مما يجعلها مصدرا مفيدا للطب التجديدي مثل داكتشاف البساط، والنمذجة المرض والعلاج بالخلايا في المريض محددة بطريقة ^1،2.

حتى الآن، وهناك العديد من الطرق لتوليد iPSCs الإنسان، بما في ذلك بوساطة فيروس (اتش الارتجاعي و) ^3، غير الفيروس بوساطة (نظام BAC وناقلات ترنسفكأيشن) ⁴ transductions الجينات، والبروتينات نظام التسليم ^5-7.

على الرغم من أن تسليم الجينات بوساطة الفيروس يمكن ضمان مستوى معين من الكفاءة، ويمكن أن يترك بصمة ناقلات فيروسية جينية، لأنهم الاندماج في الكروموسومات المضيفة للتعبير عن الجينات إعادة برمجة بطريقة غير المنضبط. حتى عندما التكامل الفيروسية من عوامل النسخ قد تفعيل أو تعطيل الجينات المضيف ^8، فإنه يمكن أن يسبب انحراف الوراثية غير متوقعة وخطر تكون الأورام ^5،9. من ناحية أخرى، تم الإبلاغ عن الأخذ المباشر من البروتينات أو الحمض النووي الريبي في الخلايا الجسمية، ولكن لديها بعض العيوب مثل كثيفة العمالة، TRANSF المتكررةection، وانخفاض مستوى إعادة برمجة ^7،10. حتى episomal وعدم إدماج-اتش، فيروس الغدة المرتبطة، والبلازميد ناقلات لا تزال نسبيا أقل كفاءة ^11. لهذه الأسباب، فمن المعقول في اختيار أساليب إعادة برمجة عدم اندماج مع فعالية عالية من الجيل التوجيهية والتشوهات الجينية أقل. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم برمجة سينداي الفيروسات القائمة. ويعرف هذا الأسلوب لتكون غير متكاملة في جينوم المضيف وتنتج باستمرار iPSCs الإنسان دون التكامل التحوير.

البروتوكول

1. إعداد الخليوي وسائل الإعلام (اليوم 1)

1. الثقافة وتوسيع الخلايا الليفية الإنسان مع وسائل الاعلام DMEM تحتوي على 10٪ FBS.
2. لوحة الخلايا الليفية الإنسان (الشكل 1) على طبق من ذهب 24 أيضا في الكثافة المناسبة لكل بئر في اليوم قبل تنبيغ.
   ملاحظة: ويوصى التخفيفات المسلسل التالية (200K، 100K، 50K، 25K، 12.5K و6.25K) لأن أنواع مختلفة من الخلايا لديها القدرة المرفق مختلفة.
3. احتضان الخلايا لمدة يوم واحد أكثر في 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ الحاضنة، وضمان الخلايا انضمت بالكامل والموسعة.

2. تنفيذ تنبيغ (اليوم 2)

1. في يوم تنبيغ، والتحقق من كثافة الخلايا واختار الآبار الكثافة الأكثر كفاءة (الشكل 2). فمن الأفضل لاختيار ثلاثة كثافات مختلفة: عالية (80 ~ 90٪) والمتوسطة (50 ~ 70٪) ومنخفضة (20 ~ 40٪).
2. 1 ساعة على الأقل قبل تنبيغ، نضح fibroblوسائل الإعلام AST من الخلايا وتغيير 300 ميكرولتر جديدة من الخلايا الليفية المتوسطة.
3. إزالة مجموعة واحدة من 4 مختلفة أنابيب فيروس سينداي من -80 درجة مئوية التخزين. ذوبان الجليد كل أنبوب في نفس الوقت في 37 ° C حمام الماء لبضع ثوان، ثم تأخذ أنابيب الخروج من حمام الماء. بعد ذلك، ذوبان الجليد منهم إلى درجة حرارة الغرفة؛ أنابيب الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 ثانية ووضعها على الجليد حتى الاستخدام. لا إعادة تجميد والذوبان الفيروس منذ سوف التتر لا الحفاظ عليها.
4. إضافة كميات أشار كل من الأربعة أنابيب فيروس سينداي (أكتوبر 4، KLF-4، ج MYC وسوكس-2) لأنبوب الطرد المركزي الصغيرة. تأكد من أن الحل يتم خلط جيد من قبل pipetting بلطف.
   على سبيل المثال، إذا 50K الخلايا / واحد بشكل جيد من 24 لوحة جيدا lookwell لتنبيغ:
   (عيار استنادا إلى شهادة تحليل من تقنيات الحياة، يمكن أن تكون مختلفة من دفعة لدفعة)
   أنبوب hOct-4 = 6.0 × 10 ⁷ CIU، وزارة الداخلية 3 = 5 ميكرولتر
   أنبوب hSox-2 = 6.5 × 10 ⁷ CIU، وزارة الداخلية 3 = 4.6 μ، ل
   أنبوب hKlf-4 = 6.3 × 10 ⁷ CIU، وزارة الداخلية 3 = 4.8 ميكرولتر
   أنبوب HC-MYC = 7.8 × 10 ⁷ CIU، وزارة الداخلية 3 = 3.8 ميكرولتر
   المجموع = 18.2 ميكرولتر من أربعة عوامل فيروس خليط / واحد كذلك (50K الخلايا) من 24 لوحة جيدا
5. اعتمادا على كثافة الخلية؛ إضافة 2X، 1X، 0.5X وحجم من الخليط الفيروس في البئر. يهز بلطف لوحة الأمام إلى الخلف واليمين واليسار (2X: 36.4 ميكرولتر من خليط الفيروس، 1X: 18.2 ميكرولتر و0.5X: 9.1 ميكرولتر).
6. وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ الحاضنة واحتضان بين عشية وضحاها.

3. استبدال الثقافة المتوسطة (يوم 3 ويوم 5)

1. 24 ساعة بعد تنبيغ، استبدل المتوسطة مع الخلايا الليفية المتوسطة 500 الطازجة ميكرولتر.
2. في يوم 5، تغيير متوسطة مع وسائل الاعلام الخلايا الليفية الطازجة.

4. إعداد أطباق MEF لالمشارك الثقافة (اليوم 8)

1. إعداد الخلايا MEF في 60 الأطباق الثقافة ملم مع 10٪ FBS الواردة DMEM المتوسطة دا واحدذ قبل الركض الخلايا الليفية transduced على الخلايا المغذية MEF.
   ملاحظة: نحن نستخدم 5 × 10 ⁵ من MEF في كل طبق 60 ملم.

5. البدء المشارك الثقافة Transduced الخلايا مع الخلايا المغذية MEF (يوم 9)

1. قبل الطلاء الخلايا transduced، الواردة نضح 10٪ FBS DMEM وسائل الاعلام من الأطباق المغذية MEF وإضافة جديدة 10٪ الواردة FBS DMEM المتوسطة.
2. إزالة متوسطة من الخلايا الليفية transduced التي هي في 24 لوحة جيدا وغسل خلايا مرة واحدة مع مد برنامج تلفزيوني. إضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين / EDTA إلى خلايا الليفية تي إتش 24 لوحة جيدا. بعد أقل من 5 دقائق الحضانة مع التربسين / EDTA، عندما تبدأ الخلايا لفصل من لوحة، وجمع الخلايا مع النمو المتوسط ​​في أنبوب 15 مل المخروطية. ثم الطرد المركزي لهم في 6،000 x ج لمدة 4 دقائق.
   ملاحظة: تجميع 2X، 1X، 0.5X الفيروس وينصح الليفية transduced.
3. إزالة المتوسطة طاف ويغسل لاعادة تعليقبيليه الخلية مع 4-5 مل من المتوسط ​​الخلايا الليفية جديدة لتحييد التربسين من. ثم الطرد المركزي في 135 x ج منهم لمدة 4 دقائق.
4. لوحة الخلايا كما المسلسل الكثافة التخفيف والبدء في المشاركة في الثقافة مع وسائل الاعلام على الخلايا الليفية MEF: مثل 1/2، 1/4، 1/8، 1/16، 1/32، 1/64، و 1/128 في 60 مم الطبق. اعتمادا على معدل موت الخلايا خلال الأسبوع الأول من تنبيغ، واحدة قد لا تحتاج إلى تمييع إلى 1/2 أو 1/128 الكثافة. وضعت جانبا الخلايا المتبقية لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع كعنصر تحكم إيجابية لالتحوير RT-PCR.
5. وضع 60 ملم أطباق في 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ حاضنة بين عشية وضحاها.

6. تغذية الجنينية البشرية الخلايا الجذعية متوسطة ورصد خلايا (اليوم 10)

1. في اليوم التالي، وتغيير وسائل الاعلام الخلايا الليفية الإنسان إلى وسائل الإعلام وفاق مع 10 ميكرومتر Y-27632. بعد ذلك، قم بتغيير متوسطة يوميا مع البشرية المتوسطة ES: 800 مل + 200 مل DMEM/F12 خروج المغلوب المصل استبدال + 10 مل من L-الجلوتامين + 10 مل من 10 ملي MEM الحد الأدنى الأحماض الأمينية غير الأساسية+ 1 مل من 2 المركابتويثانول + 10 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية.
2. قيام وسائل الإعلام التغيير اليومي مع وسائل الاعلام ES الإنسان الطازجة. بعد أسبوع، والتحقق من الأطباق مرة واحدة في 2 ~ 3 أيام تحت المجهر لتشكيل ES مثل مستعمرة كتل الخلية. اعتمادا على نوع من الخلايا، فإن الثقافة تأخذ أكثر أو أقل وقت قبل أن يتم العثور على المستعمرات.

7. نكأ المستحثة افرة القوة الجذعية المستعمرات الخليوي وتوسيع خلايا (يوم 20 ~)

1. بعد ثلاثة أسابيع تنبيغ، يجب أن تظهر المستعمرات نمت بشكل صحيح لالتقاط.
2. قبل يوم من اختيار المستعمرات، وإعداد MEF المغذية في 24 لوحة جيدا.
   ملاحظة: نحن نستخدم 12.5 × 10 ⁵ من MEF في واحد 24 لوحة جيدا.
3. في اليوم التالي، وتغيير المتوسطة من الأطباق MEF من وسائل الاعلام الخلايا الليفية الإنسان إلى وسائل الإعلام وفاق مع 10 ميكرومتر Y-27632. اختيار يدويا مستعمرة واحدة في كل مرة تحت المجهر في قطف هود وجعل كتل أصغر من قبل pipetting ونقلهاعلى إعدادها حديثا MEF dishes.Try لاختيار العديد من الحيوانات المستنسخة.
4. مرور وتوسيع كل بئر من 24 لوحة جيدا إلى 6 لوحة جيدا في البداية. ثم من لوحة 6 جيدا إلى 60 ملم الأطباق قبل مزيد من الانتشار.

8. توصيف iPSCs البشرية (بعد 10 مقاطع)

1. المناعي
   1. لوحة iPSCs الإنسان في 24 لوحة جيدا والثقافة خلال 4-5 أيام مع تغير وسائل الإعلام يوميا.
   2. لبدء الفحص المناعي، وغسل لوحة مع D-PBS مرة واحدة. ثم إصلاح الخلايا مباشرة في بارافورمالدهيد 0.4٪ لمدة 30 دقيقة. بعد أن يغسل ثلاث مرات في مد برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
   3. علاج الخلايا الثابتة بنسبة 0.1٪ تريتون X-100 الحل في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   4. نضح الحل permeablization (0.1٪ تريتون X-100 الحل)، ثم يضاف 0.5٪ BSA حل حجب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   5. إجراء كشف NANOG، أكتوبر 4، SSEA (مرحلة محددة antig الجنينيةأون) وTRA-1-81 (الورم رفض مستضد) باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة الإنسان في 0.5٪ BSA الحل (راجع الجدول المواد لمعدل الأجسام المضادة التخفيف). احتضان الضد الابتدائية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل ثلاث مرات في مد برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   6. تحقق باستخدام المجهر مضان بعد 1 ساعة من الحضانة مع اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للماوس مفتش الأضداد ك 2 ^{الثانية} الأجسام المضادة، التي المخفف 1:2،000 في 0.5٪ BSA الحل في درجة حرارة الغرفة. وصمة عار كل نوى كل الخلايا المغذية MEF وhiPSCs مع دابي.
2. RT-PCR لتأكيد التحوير
   1. استخراج مجموع مرنا من بيليه الخلية باستخدام الكواشف استخراج الحمض النووي الريبي.
   2. القيام على عكس النسخ مأخوذة (1 ميكروغرام) من الحمض النووي الريبي مجموع وكدنا] الناتجة عن PCR التضخيم من قبل الناسخ العكسي.
   3. تحضير مخاليط PCR لاحتواء 2 ميكرولتر من قالب [كدنا]، 10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي 2X PCR، 2 ميكرولتر من 2 بمول الاشعال(إلى الأمام: 1 ميكرولتر وعكس: 1 ميكرولتر) و 6 ميكرولتر من DW. للكشف عن التعبير الجيني، تفعل RT-PCR مع الاشعال المدرجة في الجدول 1.
   4. أداء RT-تقارير إنجاز المشروعات مع GAPDH الجين كعنصر تحكم لكفاءة ردود الفعل التضخيم. تصور وتحليل PCR المنتج بنسبة 1٪ الاغاروز هلام الكهربائي.

النتائج

الخلايا الليفية عادة المصابين لا تظهر أي تغيرات شكلية في عدة أيام بعد تنبيغ فيروس سينداي، ولكن بعد خمسة أيام، أنها بداية لديهم أشكال مختلفة (الشكل 1). كما هو موضح في اللوحة اليمنى من الشكل 1، وخلايا لم يكن لديك مورفولوجيا الخلايا الليفية النموذجية أي أكثر من ذلك. لديهم شكل دائري وأكبر نواة من السيتوبلازم. حتى عندما يتم تنفيذ تنبيغ في 80٪ confluency الخلوية، ويبدو أنهم أقل متكدسة في البئر بعد أن تبدأ في إعادة برمجة. إذا هذه الأنواع من التغيرات المو...

المناقشة

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية لhiPSCs يحمل وعودا لم يسبق لها مثيل في البيولوجيا الأساسية، والطب الشخصي، وزرع ^12. في السابق، وأجيال التوجيهية البشرية اللازمة فيروس الحمض النووي الذي يحتوي على مخاطر الاندماج في الجينوم المضيف، والتي يمكن أن تخلق طفرات جينية غير مرغوب فيها التي تحد من زيادة التطبيقات السريرية مثل تطوير الأدوية والعلاجات زرع ^13. مع هذا السبب، تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات لتوليد ناقلات وخالية من التحوير نظام iPSCs البشرية من خلال العديد ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
CytoTune-iPS إعادة برمجة كيت	Invitrogen	A1378002
CF-6,MEFs, مقاومة للنيومايسين, ميتومايسين C المعالجة	الجذع العالمي	GSC-6105M	5 × 105< / sup> / 6 سم أو 12.5 × 105< / sup> / 24 بئر
لوحة Trypsin EDTA 0.25٪ Trypsin مع EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM / F-12 متوسط	Invitrogen	11330-032
24 بئر لوحة زراعة الخلايا ، قاع مسطح مع غطاء	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 &# 956; M (المخزون: 10 ملم)
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 نانوغرام (المخزون: 100 ميكروغرام) بدائل
المصل بالضربة القاضية	Gibco	10828028
Dulbecco & # 039 ؛ s متوسط النسر المعدل (D-MEM ، DMEM) (1X) ، سائل (جلوكوز عالي)	Invitrogen	11965118
مصل بقري للجنين	تخمير حراري علمي	SH30071.03
لتر جلوتامين -200 ملي مولار (100X) ، سائل	GIBCO	25030-081	1/100
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 100X	LIFE TECHNOLOGIES		1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X) ، سائل	GIBCO	21985023	1 / 1,000
Hausser Phase Contrast Heusser Heusser	Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0.1٪ محلول جيلاتين	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
إشارات الخلية المضادة ل Tra-1-81		4745S	1/200
المضاد Oct4 أحادي النسيلة للفأر	سانتا كروز	SC-5279	1/1,000
نانوج	R & D	AF1997	1/1,000
Alexa Flouor 488 الماعز المضاد للفأر	Invitrogen	948492	1/2,000
DPBS (Dulbecco&# 039; s محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، 1X بدون كالسيوم و أمبير المغنيسيوم	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect طقم النسخ العكسي	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
قطف شفاط	NuAire	NU-301
نطاق تشريح	نيكون	SMZ745