يتم تشغيل الدفاعات الفطرية للعدوى الفيروس عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير). وهما خنازير حشوية RIG-I وPKR ربط إلى الرنا الفيروسي التوقيع، وتغير التشكل، oligomerize، وتفعيل الإشارات المضادة للفيروسات. يتم وصف الأساليب التي تسمح لرصد ملائم تبديل متعلق بتكوين وoligomerization هذه خنازير حشوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تفعيل مراقبة من نمط المضادة للفيروسات الاعتراف المستقبلات RIG-I وPKR بواسطة البروتياز المحدودة الهضم وPAGE الأصلية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
دفاعات المضيف لعدوى فيروس تعتمد على الكشف السريع عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) من نظام المناعة الفطري. في السيتوبلازم، وخنازير RIG-I وPKR ربط إلى بروابط محددة RNA الفيروسي. هذا يتوسط أول تبديل متعلق بتكوين وoligomerization، ومن ثم تمكن من تفعيل استجابة للفيروسات المضادة للفيروسات. في حين وضعت أساليب لقياس التعبير الجيني للفيروسات المضيف بشكل جيد، وأساليب لمراقبة مباشرة للدول تفعيل RIG-I وPKR هي إلا جزئيا وأقل راسخة.
هنا، نحن تصف طريقتين لرصد RIG-I وPKR التحفيز على العدوى مع محفز مضاد للفيروسات المعمول بها، فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13). محدودة التربسين الهضم يسمح لتحليل التغيرات في حساسية الأنزيم البروتيني، مشيرا إلى التغييرات متعلق بتكوين جزئي للخنازير. التربسين هضم لست] من خلايا وهمية نتائج المصابة في التحلل السريع من RIG-I وPKR، whereaق الكلورين العدوى 13 يؤدي إلى ظهور مقاومة للالبروتيني RIG-I الجزء. أيضا PKR يظهر المقاومة التي يسببها فيروس جزئية لعملية الهضم التربسين، والذي يتزامن مع الفسفرة السمة المميزة لها في الثريونين 446. تشكيل RIG-I وجرى التحقق من الأوليغومرات PKR من قبل الأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE). على العدوى، وهناك تراكم قوية من RIG-I والمجمعات من oligomeric PKR، في حين ظلت هذه البروتينات كما مونومرات في عينات المصابة وهمية.
محدودة الهضم البروتيني وPAGE الأم، إلى جانب كل من لتحليل لطخة غربية، تسمح لقياس حساسية ومباشرة من خطوتين متنوعة من RIG-I وتفعيل PKR. هذه التقنيات هي سهلة نسبيا وسريعة لأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن.
المقدمة
A حدثا هاما في الدفاع المضيف المضادة للفيروسات هو الكشف السريع عن مسببات المرض عن طريق ما يسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 1،2. الكشف عن الخلايا من عدوى فيروس الحمض النووي الريبي يعتمد على اثنين من helicases الحمض النووي الريبي حشوية، RIG-I (حمض الريتينويك الجينات محرض I) وMDA5 (ميلانوما التمايز بروتين يرتبط 5) 3-5. ويتكون RIG-I اثنين من المجالات N-محطة التوظيف كاسباس (بطاقات)، وهو نوع المركزية دتش مربع RNA helicase المجال، ومجال-C محطة (CTD) 4،6. في حين يطلب من CTD والمجال helicase للاعتراف غير المتمتعة بالحكم الذاتي (الفيروسية) الرنا، وبطاقات توسط إشارات المصب مما يؤدي إلى إنشاء حال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. البذر من خلايا A549 للعدوى
- زراعة قارورة T75 الخلايا A549 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في خلية ثقافة المتوسط (DMEM تستكمل مع FCS 10٪، 526.6 ملغم / لتر L-الجلوتامين، 50.000 U / البنسلين لتر، و 50 ملغ / لتر الستربتوميسين).
- قبل البدء في حصاد الخلايا، خلية الاحماء مستنبت، برنامج تلفزيوني و0.05٪ التربسين EDTA-في بالحمام المائي تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
- إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 10 مل PBS. إزالة برنامج تلفزيوني مرة أخرى. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الاعتراف ناهض الفيروسية من خلال سلفة-I أو مشغلات PKR تحويل متعلق بتكوين 6،17،30 6،18،27 وoligomerization. نحن يعاير هذه العلامات من قبل اثنين من تفعيل محدودة الهضم البروتيني والأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE)، على التوالي.
أصيب الخلايا A549 الإنسان مع استنساخ فيروس حمى الوادي المتصدع 13 (الكلورين 13)، الذي يتميز حدوث تحور في مستقبلات الإنترفيرون NSS 35،36. نظرا لعدم وجود وظيفية NSS، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الاستشعار عن وجود فيروسات وتفعيل نوع المضادة للفيروسات أنا الإنترفيرون النظام هي حاسمة لنجاح الاستجابات المناعية الفطرية 22. وبالتالي بوساطة الكشف عن الفيروس عن طريق المستقبلات الاعتراف الممرض (خنازير) مثل RIG-I وPKR، مما يتيح استجابة سريعة وتفعيل آليات الدفاع المضادة للفيروسات. هنا، نحن تصف طريقتين لتقييم الوضع مباشرة تفعيل RIG-I وPKR.
محدودة الهضم البروتيني كأداة لرصد التغيرات متعلق بتكوين جزئي من RI.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر اليخاندرو برون من CISA-INIA لتوفير المضادة للفيروس حمى الوادي المتصدع الأمصال. ويدعم العمل في المختبرات لدينا من قبل Forschungsförderung الأحجار الكريمة. § 2 عبس. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum غيسن اوند ماربورغ، وكلية الدراسات العليا لايبنتز للالناشئة الأمراض الفيروسية (EIDIS)، وDFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021، وDFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>ثقافة الخلية< / قوي> | |||
| Dulbecco' s النسر المعدل s medium (< font class = "font6" >DMEM) < / font > | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05٪ Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| <قوي>مواد كيميائية< / قوي> | |||
| L-1-tosylamido-2-فينيل إيثيل كلورو ميثيل الكيتون المعالج (TPCK) التربسين | سيجما ألدريتش | T1426 | |
| <قوي>الأجسام المضادة< / قوي> | |||
| الفأر أحادي النسيلة الأجسام المضادة ل RIG-I (ALME-1)Enzo | Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1: 500 في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBS |
| Mouse أحادي النسيلة مضاد ل PKR (B10) | سانتا كروز | sc-6282 | WB: 1: 500 في الحليب الخالي من الدسم بنسبة 1٪ في TBS |
| Rabbit أحادي النسيلة مضاد ل P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1: 1,000 في 5٪ BSA في TBS |
| Rabbit متعدد النسيلة مضاد ل IRF-3 | سانتا كروز | sc-9082 | WB: 1: 500 في الحليب الخالي من الدسم بنسبة 1٪ في TBS |
| الأرانب أحادي النسيلة مضاد ل P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1: 100 في 1٪ حليب خالي الدسم في TBS |
| مصل الأرانب المضاد ل RVFV فرط المناعة "C2" (MP-12) | يرجى تقديم Alejandro Brun CISA-INIA | WB: 1: 2,000 في الحليب الخالي من الدسم بنسبة 1٪ في TBS | |
| فأر أحادي النسيلة مضاد لبيتا أكتين (8H10D10) | إشارات الخلية | 3700 | WB: 1: 1,000 في الحليب الخالي من الدسم بنسبة 1٪ في TBS |
| النسيلة بيروكسيديز الماعز المترافق المضاد للأرانب | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1: 20,000 في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBS |
| الماعز متعدد النسيلة المترافق بالبيروكسيداز المضاد للفأر | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1: 20,000 في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBS |
المراجع
- Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus inv....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
