مقالة منهجية

تفعيل مراقبة من نمط المضادة للفيروسات الاعتراف المستقبلات RIG-I وPKR بواسطة البروتياز المحدودة الهضم وPAGE الأصلية

DOI:

10.3791/51415

⸱

يوليو 29, 2014

 , 
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تشغيل الدفاعات الفطرية للعدوى الفيروس عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير). وهما خنازير حشوية RIG-I وPKR ربط إلى الرنا الفيروسي التوقيع، وتغير التشكل، oligomerize، وتفعيل الإشارات المضادة للفيروسات. يتم وصف الأساليب التي تسمح لرصد ملائم تبديل متعلق بتكوين وoligomerization هذه خنازير حشوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دفاعات المضيف لعدوى فيروس تعتمد على الكشف السريع عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) من نظام المناعة الفطري. في السيتوبلازم، وخنازير RIG-I وPKR ربط إلى بروابط محددة RNA الفيروسي. هذا يتوسط أول تبديل متعلق بتكوين وoligomerization، ومن ثم تمكن من تفعيل استجابة للفيروسات المضادة للفيروسات. في حين وضعت أساليب لقياس التعبير الجيني للفيروسات المضيف بشكل جيد، وأساليب لمراقبة مباشرة للدول تفعيل RIG-I وPKR هي إلا جزئيا وأقل راسخة.

هنا، نحن تصف طريقتين لرصد RIG-I وPKR التحفيز على العدوى مع محفز مضاد للفيروسات المعمول بها، فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13). محدودة التربسين الهضم يسمح لتحليل التغيرات في حساسية الأنزيم البروتيني، مشيرا إلى التغييرات متعلق بتكوين جزئي للخنازير. التربسين هضم لست] من خلايا وهمية نتائج المصابة في التحلل السريع من RIG-I وPKR، whereaق الكلورين العدوى 13 يؤدي إلى ظهور مقاومة للالبروتيني RIG-I الجزء. أيضا PKR يظهر المقاومة التي يسببها فيروس جزئية لعملية الهضم التربسين، والذي يتزامن مع الفسفرة السمة المميزة لها في الثريونين 446. تشكيل RIG-I وجرى التحقق من الأوليغومرات PKR من قبل الأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE). على العدوى، وهناك تراكم قوية من RIG-I والمجمعات من oligomeric PKR، في حين ظلت هذه البروتينات كما مونومرات في عينات المصابة وهمية.

محدودة الهضم البروتيني وPAGE الأم، إلى جانب كل من لتحليل لطخة غربية، تسمح لقياس حساسية ومباشرة من خطوتين متنوعة من RIG-I وتفعيل PKR. هذه التقنيات هي سهلة نسبيا وسريعة لأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A حدثا هاما في الدفاع المضيف المضادة للفيروسات هو الكشف السريع عن مسببات المرض عن طريق ما يسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 1،2. الكشف عن الخلايا من عدوى فيروس الحمض النووي الريبي يعتمد على اثنين من helicases الحمض النووي الريبي حشوية، RIG-I (حمض الريتينويك الجينات محرض I) وMDA5 (ميلانوما التمايز بروتين يرتبط 5) 3-5. ويتكون RIG-I اثنين من المجالات N-محطة التوظيف كاسباس (بطاقات)، وهو نوع المركزية دتش مربع RNA helicase المجال، ومجال-C محطة (CTD) 4،6. في حين يطلب من CTD والمجال helicase للاعتراف غير المتمتعة بالحكم الذاتي (الفيروسية) الرنا، وبطاقات توسط إشارات المصب مما يؤدي إلى إنشاء حالة المضيف المضادة للفيروسات.

إذا RIG-I في حالة صامتة، أي في حالة عدم وجود الحمض النووي الريبي يجند محددة، يتفاعل البطاقة الثانية مع المجال helicase المركزية ويحتفظ RIG-I في السيارات المثبطة التشكل 7-11. RIG-I بربط قصيرة المزدوجحبلا (س) RNA تحمل 5'-ثلاثي الفوسفات (5'PPP)، طويلة الرنا المزدوج الجديلة، والجيش الملكي النيبالي polyU / UC-الغنية، والهياكل التوقيع الكلاسيكية التي هي موجودة على الجينوم من العديد من الفيروسات RNA 12-16. اثنين من الخصائص الرئيسية لتفعيل RIG-I هي التحول إلى التشكل مغلقة 6،17 وهومو oligomerization 6،18،19. مفتاح بتكوين يعزز الحمض النووي الريبي ملزمة، يعرض بطاقات للإشارات المصب، وreconstitutes موقع أتباز نشطة 8،9،11،20. تشكيل المجمعات RIG-I من oligomeric يؤدي إلى تعزيز توظيف المصب جزيئات محول الإشارات لتشكيل منبر للفيروسات نقل الإشارة 11. سلسلة إشارات RIG-I-تنظيم ينشط في نهاية المطاف عامل النسخ IRF-3 لمدة تصل التنظيم من الانترفيرون (IFN-alpha/beta) الجينات وبالتالي التعبير الجيني للفيروسات حفزت الجينات (ISGS) للاستجابة للفيروسات الكامل 21،22 . واحدة من أفضل ISGS تتميز البروتينات هو تنشيط الحمض النووي الريبين كيناز (PKR) 23. PKR ينتمي إلى عائلة حقيقية النواة ترجمة الشروع عامل ألفا 2 (eIF2α) تحركات ويتكون من المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي ملزمة المجال-N محطة وكيناز C نطاق المحطة. يشكل المجال كيناز واجهة dimerization حاسمة لتفعيل PKR وينفذ وظائف الحفاز للبروتين. ملزمة من PKR لالرنا المزدوج الجديلة الفيروسية يؤدي إلى تغيير موقفها والسماح بتكوين dimerization وصناعة السيارات في الفسفرة في الثريونين 446 بين المخلفات الأخرى. PKR ثم يتوسط الفسفرة من eIF2α، وبالتالي عرقلة ترجمة الفيروسية mRNAs و23-27.

كلا RIG-I وPKR الخضوع لإعادة ترتيب هيكلية رئيسية، شكل مجمعات من oligomeric وتكون بعد translationally تعديلها من قبل الفسفرة / نزع الفسفات وubiquitination 10،11،19،23،24،26-29. من أجل فهم أفضل منها هياكل الحمض النووي الريبي الفيروسي يتم تفعيل RIG-I وPKR (وفي أي مرحلة مضادات فيروسية يمكن أن به التدخل)، من المهم أن تحدد بدقة حالة التنشيط. لكل من خنازير تم وصفها سابقا أن التنشيط يؤدي إلى ظهور مقاومة للشظايا البروتين التربسين 6،17،30 والعليا الأوليغومرات 6،18،19. ومع ذلك، وبالنظر إلى ثروة من الأدب على هذه العوامل الرئيسية للاستجابة للفيروسات المضيف 1،2،24، وتطبيق أساليب مباشرة يبدو نادرة نسبيا. أملا في تحفيز استخدام أوسع، ونحن نقدم بروتوكولات مريحة وحساسة لتحليل بقوة الدول تفعيل RIG-I وPKR. إصابة الإنترفيرون المختصة خط الخلية البشرية A549 مع المنشط أنشئت من RIG-I وPKR، والموهن فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13) 31،32. بعد إجراء lysing بسيطة، يتم اختبار مقتطفات من الخلايا المصابة بواسطة محدودة التربسين الهضم / تحليل لطخة غربية لتقييم التحول متعلق بتكوين جزئي، والأزرق الأصلي هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) / analys طخة غربيةهو قياس تشكيل الأوليغومرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البذر من خلايا A549 للعدوى

  1. زراعة قارورة T75 الخلايا A549 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في خلية ثقافة المتوسط ​​(DMEM تستكمل مع FCS 10٪، 526.6 ملغم / لتر L-الجلوتامين، 50.000 U / البنسلين لتر، و 50 ملغ / لتر الستربتوميسين).
  2. قبل البدء في حصاد الخلايا، خلية الاحماء مستنبت، برنامج تلفزيوني و0.05٪ التربسين EDTA-في بالحمام المائي تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
  3. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 10 مل PBS. إزالة برنامج تلفزيوني مرة أخرى.
  4. إضافة 3 مل من التربسين EDTA-وتوزيعها على قدم المساواة في القارورة. نقل القارورة في حاضنة مع 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. عندما يتم فصل كل الخلايا، إضافة 7 مل من مستنبت الخلية، resuspend الخلايا، ونقل تعليق الخلية في أنبوب 15 مل الصقر.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 800 x ج لمدة 5 دقائق على RT، وإزالة طاف و resuspend بيليه في 10 مل الطازجة مستنبت الخلية.
  7. عد الخلايا مع غرفة الفرز.
  8. إضافة 2.5 × 10 6 خلايا في 5 مل من مستنبت الخلية في اثنين من قوارير T25 لكل منهما. احتضان لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. يخدم احد قارورة لمراقبة وهمية واحدة للعدوى الكلورين 13.

2. العدوى مع فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ 13 (الكلورين 13)

  1. ملاحظة: CL 13 هو متحولة الفيروس الموهن في ألمانيا والتي يمكن التعامل معها في ظل الظروف BSL-2. يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية الوطنية ذات الصلة. سوف محرضات أخرى الإنترفيرون نموذجي يكون فيروس سينداي (سلالة Cantell) أو فيروس مرض نيوكاسل.
  2. قبل دافئ PBS، خالية من مصل المتوسطة، ومستنبت الخلية تحتوي على 5٪ FCS.
  3. إعداد 1.25 × 10 7 PFU / مل من الكلور 13 في المصل خالية المتوسطة لتصيب 2.5 × 10 6 خلايا A549 مع عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 5. إعداد المبلغ قليلا (حوالي 10٪) أكبر من الحاجة لحساب أخطاء ماصة.
  4. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح تحت 1.3.
  5. إضافة 1 مل من التخفيف الكلورين أو 13من المصل خالية المتوسطة (مراقبة غير مصاب، وهمية) إلى الخلايا، واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. نقل قارورة بعناية كل 15 دقيقة لضمان التوزيع العادل للكلور 13 التخفيف وخالية من مصل المتوسطة، على التوالي.
  6. بعد 1 ساعة من العدوى، وإزالة قائح، إضافة 5 مل من قبل حرارة متوسطة الثقافة الخلية مع 5٪ FCS، واحتضان لمدة 5 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

3. إعداد الخلية لست]

  1. إعداد برنامج تلفزيوني / 0.5٪ تريتون X-100 على 4 درجات مئوية. لا تقم بإضافة مثبطات الأنزيم البروتيني سيرين.
  2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني جديد.
  3. تتخلص الخلايا قبالة، ونقل تعليق الخلية في أنبوب الصقر، وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  4. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 30 ميكرولتر PBS / 0.5٪ تريتون X-100. نقل المحللة إلى أنبوب 1.5 مل الطازجة واحتضان لمدة لا تقل عن 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 10.000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ونقل المحللة خلية أوضح (طاف) في أنبوب جديد.
  6. تحديد تركيز البروتين مقايسة برادفورد كما هو موضح في مكان آخر 33.
  7. تخزينها في -20 درجة مئوية أو الشروع في عملية الهضم التربسين (4.1) أو PAGE الأصلي (5.1).

4. تحديد بتكوين جزئي التغييرات من التعرف على الأنماط مستقبلات

  1. علاج TPCK-التربسين من الخلية لست]
    1. تمييع L-1-tosylamido-2-الفنيل كيتون كلوروميثيل المعالجة (TPCK) التربسين في برنامج تلفزيوني إلى تركيز العمل النهائية من 2 ميكروغرام / ميكرولتر.
    2. ضبط في اثنين من أنابيب جديدة لتركيز البروتين النهائي من 25 ميكروغرام لكل المحللة البروتين (وهمية أو كلور 13) في الحجم النهائي من 9 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني. وبالتالي، ينبغي أن يكون أربعة أنابيب مع 25 ميكروغرام لكل المحللة، مرتين وهمية والكلورين مرتين العدوى 13. مجموعة واحدة كما مراقبة المدخلات (غير المعالجة) ومجموعة واحدة لتلقي العلاج مع TPCK-التربسين.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (غير المعالجة)أو 1 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / ميكرولتر TPCK-التربسين (تركيز النهائي: 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى الخلية لست وتخلط ردود الفعل من قبل pipetting. لا تجمد وذوبان الجليد مأخوذة-TPCK التربسين، لأنها سوف تؤثر سلبا على كفاءة الهضم.
    4. احتضان لست] عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. وقف رد الفعل بإضافة 5X تغيير طبيعة عينة العازلة (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10٪ SDS، الجلسرين 50٪، 25٪ β-المركابتويثانول، و 0.5٪ برومفينول الأزرق) والمغلي لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية. من المهم أن لا تمديد الوقت التربسين الحضانة. في حالة أي مقاومة للشظايا البروتيني قابلة للكشف، يجب تقصير وقت التربسين الهضم.
    5. بعد الغليان، ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
  2. SDS بولي أكريلاميد جل الكهربائي (PAGE) والغربية التنشيف
    1. تحميل العينات على كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) هلام بولي أكريلاميد تحتوي على التراص 5٪ على مدى هلام حل 12٪. فصل البروتينات في 25 مللي أمبير في هلام حتىالأزرق برومفينول تنفد.
    2. تنشيط الغشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF) لمدة 30 ثانية مع الميثانول ووضعها في نقل العازلة (48 ملي تريس، 39 ملي glycin، 1.3 ملي SDS، 20٪ الميثانول).
    3. إعداد النشاف مع نظام النشاف شبه الجافة والسماح بنقل البروتينات في 10 V لمدة 1 ساعة. اتخاذ غشاء بها، شطفه بالماء لفترة وجيزة، واتركها لتجف.
    4. تنشيط الغشاء عن طريق نقل قريبا في الميثانول. يغسل لمدة 5 دقائق مع TBS. منع 10٪ مع الحليب الخالي من الدسم في TBS لمدة 1 ساعة على RT أو عند 4 درجة CO / N. غسل 3X الغشاء لمدة 5 دقائق مع كل TBS.
    5. إعداد الأجسام المضادة التخفيف على النحو الموصى به في الجدول 1 واحتضان الغشاء لمدة 1 ساعة على RT أو عند 4 درجة CO / N.
    6. غسل 3X الغشاء لمدة 10 دقيقة مع كل TBS-T. إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة إلى جانب الفجل البيروكسيداز في التخفيف 1:20،000 في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBS. احتضان 45 دقيقة في RT.
    7. غسل 3X الغشاء لمدة 10 دقيقة مع كل TBS-T، وسوقتا إضافيا مع شمال شرق TBS.
    8. للكشف عن إشارة استخدام عدة chemiluminescense التجارية ونظام التصوير الرقمي هلام.
  3. Coomassie بريليانت الأزرق G-250 تلطيخ
    1. أداء SDS-PAGE كما هو موضح في 4.2.1. تحميل عينات على هلام بولي أكريلاميد SDS وتشغيل هلام في هلام 25 مللي أمبير في حين يدير برومفينول الأزرق خارج.
    2. أداء Coomassie بريليانت الأزرق G-250 تلطيخ في RT. تفعل كل حضانات تحت الهز المستمر.
    3. نقل الجل على حل التثبيت تحتوي على 40٪ الميثانول وحامض الخليك 10٪ لمدة 30 دقيقة.
    4. تبادل المخزن المؤقت إلى حل destaining (25٪ من الإيثانول وحمض الخليك 8٪)، واحتضان لمدة 5 دقائق.
    5. وصمة عار الجل مع 0.2٪ Coomassie برلنت الأزرق G-250 في 40٪ الميثانول وحامض الخليك 10٪ لمدة 1 ساعة.
    6. يزيل اللون هلام مع الحل destaining وتبادل المخزن المؤقت بعد 10 دقيقة، 30 دقيقة، و 60 دقيقة.
    7. تخزين هلام في 25٪ من الإيثانول، حمض الخليك 8٪، و 4٪ الجلسرين في 4 درجات مئوية.
    8. أداء التصوير والتحليل كما هو موضح تحت 4.2.8.

5. تحليل من oligomeric دول التعرف على الأنماط مستقبلات

  1. الصفحة الأم
    1. إعداد 50 ميكروغرام من المحللة الخلية في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني وإضافة 5 × عازلة الأم العينة (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 1٪ deoxycholate الصوديوم، و 50٪ الجلسرين، و 0.5٪ برومفينول الأزرق) إلى تركيز النهائي من 1X.
    2. تحميل عينات فورا على هلام بولي أكريلاميد الأصلي مع 5٪ كما التراص و 8٪ كما حل هلام. فإن أي تأخير يؤدي إلى فقدان المجمعات الأصلي 34.
    3. تشغيل هلام في هلام 20 مللي أمبير في الساعة 4 درجة مئوية مع 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 9.0 هيدروكسيد الصوديوم، 384 ملي glycin مثل الأنود و 50 ملي تريس درجة الحموضة 8.3، 384 ملي glycin، 1٪ deoxycholate الصوديوم كمادة عازلة الكاثود. بعد 1.5-2 ساعة (قد ترك برومفينول الفرقة الزرقاء جل ما يقرب من 45 دقيقة في وقت سابق) انتهاء الكهربائي.
  2. التنشيف الغربية
    1. تنشيط polyvinylidene الفلوريد (PVDF) الغشاء لمدة 30 ثانية مع الميثانول ووضعها في Towbin العازلة (25 ملي تريس، 192 ملي glycin، 0.1٪ SDS، 20٪ الميثانول).
    2. تجميع غرفة طخة الرطب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وملء خزان مع العازلة توين.
    3. أداء النشاف مع 250 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    4. عندما يتم الانتهاء من النشاف المضي قدما كما هو موضح من 4.2.3 جرا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاعتراف ناهض الفيروسية من خلال سلفة-I أو مشغلات PKR تحويل متعلق بتكوين 6،17،30 6،18،27 وoligomerization. نحن يعاير هذه العلامات من قبل اثنين من تفعيل محدودة الهضم البروتيني والأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE)، على التوالي.

أصيب الخلايا A549 الإنسان مع استنساخ فيروس حمى الوادي المتصدع 13 (الكلورين 13)، الذي يتميز حدوث تحور في مستقبلات الإنترفيرون NSS 35،36. نظرا لعدم وجود وظيفية NSS، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاستشعار عن وجود فيروسات وتفعيل نوع المضادة للفيروسات أنا الإنترفيرون النظام هي حاسمة لنجاح الاستجابات المناعية الفطرية 22. وبالتالي بوساطة الكشف عن الفيروس عن طريق المستقبلات الاعتراف الممرض (خنازير) مثل RIG-I وPKR، مما يتيح استجابة سريعة وتفعيل آليات الدفاع المضادة للفيروسات. هنا، نحن تصف طريقتين لتقييم الوضع مباشرة تفعيل RIG-I وPKR.

محدودة الهضم البروتيني كأداة لرصد التغيرات متعلق بتكوين جزئي من RI...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر اليخاندرو برون من CISA-INIA لتوفير المضادة للفيروس حمى الوادي المتصدع الأمصال. ويدعم العمل في المختبرات لدينا من قبل Forschungsförderung الأحجار الكريمة. § 2 عبس. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum غيسن اوند ماربورغ، وكلية الدراسات العليا لايبنتز للالناشئة الأمراض الفيروسية (EIDIS)، وDFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021، وDFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>ثقافة الخلية< / قوي>
Dulbecco' s النسر المعدل s medium (< font class = "font6" >DMEM) < / font >Gibco21969-035
OptiMEMGibco31985-47
L-glutaminePAA25030-024
Penicillin-StreptomycinPAA15070-063
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)PAA10270
0.05٪ Trypsin-EDTAGibco25300-054
<قوي>مواد كيميائية< / قوي>
L-1-tosylamido-2-فينيل إيثيل كلورو ميثيل الكيتون المعالج (TPCK) التربسينسيجما ألدريتشT1426
<قوي>الأجسام المضادة< / قوي>
الفأر أحادي النسيلة الأجسام المضادة ل RIG-I (ALME-1)EnzoLife SciencesALX-804-849-C100WB: 1: 500 في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBS
Mouse أحادي النسيلة مضاد ل PKR (B10)سانتا كروزsc-6282WB: 1: 500 في الحليب الخالي من الدسم بنسبة 1٪ في TBS
Rabbit أحادي النسيلة مضاد ل P-PKR (Thr446)Epitomics1120-1WB: 1: 1,000 في 5٪ BSA في TBS
Rabbit متعدد النسيلة مضاد ل IRF-3سانتا كروزsc-9082WB: 1: 500 في الحليب الخالي من الدسم بنسبة 1٪ في TBS
الأرانب أحادي النسيلة مضاد ل P-IRF-3 (Ser386)IBLog-413WB: 1: 100 في 1٪ حليب خالي الدسم في TBS
مصل الأرانب المضاد ل RVFV فرط المناعة "C2" (MP-12)يرجى تقديم Alejandro Brun CISA-INIAWB: 1: 2,000 في الحليب الخالي من الدسم بنسبة 1٪ في TBS
فأر أحادي النسيلة مضاد لبيتا أكتين (8H10D10)إشارات الخلية3700WB: 1: 1,000 في الحليب الخالي من الدسم بنسبة 1٪ في TBS
النسيلة بيروكسيديز الماعز المترافق المضاد للأرانبThermo Fisher0031460 1892914WB: 1: 20,000 في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBS
الماعز متعدد النسيلة المترافق بالبيروكسيداز المضاد للفأرThermo Fisher0031430 1892913WB: 1: 20,000 في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBS
متعدد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032(2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287(2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RIG I PKR

مقالات ذات صلة