مقالة منهجية

Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق

69.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51455

⸱

مايو 17, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lady Davis Institute and Department of Oncology, McGill University, 2Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet, 3Goodman Cancer Centre and Department of Biochemistry, McGill University

في هذه المقالة

ملخص

ريبوسوم تلعب دورا محوريا في تخليق البروتين. Polyribosome (polysome) تجزئة من قبل السكروز التدرج الكثافة الطرد المركزي يسمح تقرير مباشر من الكفاءة ترجمة mRNAs والفردية على نطاق الجينوم واسعة. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة يمكن استخدامها لتحليل الكيمياء الحيوية من والريبوسوم عوامل المرتبطة polysome مثل المحرمين وجزيئات الإشارة.

الملخص

ترجمة مرنا يلعب دورا محوريا في تنظيم التعبير الجيني ويمثل أكثر عملية والطاقة المستهلكة في خلايا الثدييات. وفقا لذلك، وتعتبر التقلبات الترجمة مرنا للعب دور رئيسي في مجموعة متنوعة من الحالات المرضية بما فيها السرطان. ريبوسوم أيضا استضافة المحرمين، والتي تسهل للطي من البروتينية الوليدة، وبالتالي تحوير وظيفة واستقرار البروتينية توليفها حديثا. بالإضافة إلى ذلك، تشير إلى أن البيانات الناشئة ريبوسوم بمثابة منصة لذخيرة من إشارات الجزيئات، التي تورطت في مجموعة متنوعة من التعديلات بعد متعدية من البروتينية حديثا توليفها لأنها تخرج من الريبوسوم، و / أو مكونات الآلات متعدية. هنا، يتم وصف طريقة راسخة من تجزئة الريبوسوم باستخدام كثافة السكروز التدرج الطرد المركزي. بالتزامن مع تطوير خوارزمية "انوتا" لفي المنزل يسمح هذا الأسلوب تقرير مباشر من diffeترجمة رينتيال من mRNAs والفردية على نطاق الجينوم واسعة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول تنوعا يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات البيوكيميائية التي تهدف إلى تشريح وظيفة من المجمعات البروتين المرتبط الريبوسوم، بما في ذلك تلك التي تلعب دورا محوريا في للطي وتدهور البروتينية توليفها حديثا.

المقدمة

الشبكات التنظيمية التي تتحكم في التعبير الجيني تم دراستها على نطاق واسع في العقدين الماضيين. الغالبية العظمى من هذه الجهود البحثية التي تركز على تنظيم النسخي، حيث كانت تستخدم التغييرات في مستويات مرنا حالة مستقرة على نطاق الجينوم واسعة لتحديد ما يسمى محات "التعبير الجيني". تكشف الدراسات التي أجريت مؤخرا أن مستويات مرنا الحالة المستقرة تتوافق فضفاضة فقط إلى تكوين بروتيوم 1،2، مما يشير إلى أن آليات ما بعد النسخي، بما في ذلك الترجمة مرنا، ولعب دورا رئيسيا في تنظيم التعبير الجيني 3،4. في الواقع، تشير التقديرات إلى أن ~ يتم تحديد 50٪ من مستويات البروتين على مستوى الترجمة مرنا في الخلايا الليفية الماوس مخلد 5.

ترجمة مرنا هو عملية منظمة للغاية حيث يتم ترجمتها إلى بروتينات mRNAs وعبر إجراءات مدبرة من ريبوسوم، الرنا نقل (tRNAs) وعوامل التبعية المشتركيشار إلى mmonly كعوامل الترجمة (تي إف إس) 6. تخليق البروتين هو الأكثر عملية والطاقة المستهلكة في خلايا الثدييات 7 وبالتالي يتم تعديل معدلات ترجمة مرنا العالمية لاستيعاب توافر المواد الغذائية ومعدلات تكاثر الخلايا 8. بالإضافة إلى تغيرات في المعدلات العالمية ترجمة مرنا، ومختلف المحفزات خارج الخلية (مثل الهرمونات وعوامل النمو)، العظة داخل الخلايا (على سبيل المثال مستويات الأحماض الأمينية) وأنواع مختلفة من الإجهاد (مثل ER-الإجهاد) تحدث تغييرات انتقائية في برك من mRNAs والتي هي يتم ترجمتها (translatome) 6. اعتمادا على نوع من التحفيز، النشاط ترجمة بعض، ولكن لا تتأثر جميع mRNAs وبشكل كبير، مما يؤدي إلى تغييرات في بروتيوم المطلوبة لجبل استجابة الخلوية السريع 6. ويعتقد أن هذه التغييرات النوعية والكمية في translatome أن بوساطة التفاعل بين العوامل العابرة المفعول (على سبيل المثال مكونات الآلات متعدية، والعوامل المساعدة أو miRNAs) ورابطة الدول المستقلة العناصر (عناصر الحمض النووي الريبي أو ميزات) موجودة في مجموعات فرعية مختارة من mRNAs و6،9. على سبيل المثال، والتغيرات في مستويات و / أو نشاط منظم معدل الترجمة الشروع العوامل eIF4E وeIF2 تعدل بشكل انتقائي ترجمة النصوص استنادا إلى الميزات 5'UTR محددة 6. ويلزم eIF4E وeIF2 لتوظيف مرنا والبادئ الحمض الريبي النووي النقال إلى الريبوسوم، على التوالي 6. زيادة في النشاط eIF4E يعزز بشكل انتقائي ترجمة mRNAs وإيواء 5'UTRs طويلة ومنظم للغاية بما في ذلك انتشار وبقاء ترميز البروتينات بما في ذلك تحفيز الحلقيات، ج MYC وبي سي إل XL 10. في المقابل، من تعطيل eIF2 يؤدي إلى تخليق البروتين العالمية الغلق، في حين يصل انتقائي تنظيم ترجمة mRNAs وتحتوي قصيرة المثبطة المنبع إطارات القراءة المفتوحة (uORFs) في 5'UTRs الخاصة بهم، مثل تلك ترميز سيد رranscriptional المنظمين للاستجابة البروتين تكشفت (على سبيل المثال ATF4). في استجابة للمؤثرات المختلفة بما في ذلك المواد الغذائية، وعوامل النمو والهرمونات، والهدف الآلي / الثدييات rapamycin (mTOR) مسار يحفز النشاط eIF4E بواسطة تعطيل البروتين 4E ملزم (4E-BP) عائلة من المكثفات الترجمة، في حين أن مسار MAPK phosphorylates مباشرة eIF4E 6،11. بدوره، تحركات eIF2α (أي PERK، PKR، HRI وGCN2) تمنع eIF2 بواسطة phosphorylating الوحيدات التنظيمية eIF2α في الاستجابة للحرمان المغذيات، ER-الإجهاد وعدوى فيروس 6،12. تغييرات في النشاط و / أو التعبير عن TFS، وقد لوحظ مكونات أخرى من الآلات متعدية والعوامل التنظيمية بما في ذلك miRNAs في مختلف الحالات المرضية بما فيها السرطان، متلازمات الأيض، والاضطرابات العصبية والنفسية، وأمراض الكلى والقلب والأوعية الدموية 13-19. بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن متعدية ليchanisms تلعب دورا محوريا في الحفاظ على التوازن الخلية والتي إبطالهما يلعب دورا محوريا في المسببات لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان.

هنا، يوصف بروتوكول للتجزئة من قبل polysomes السكروز كثافة الطرد المركزي التدرج في خلايا الثدييات، والذي يستخدم لفصل polysomes من monosomes، مفارز الريباسي وجزيئات بروتين نووي ريبوزي رسول (mRNPs). وهذا يتيح التمييز بين تترجم بكفاءة (المرتبطة polysomes الثقيلة) من سوء ترجمة (المرتبطة polysomes ضوء) mRNAs و. في هذا الاختبار، وثبتوا على ريبوسوم مرنا باستخدام مثبطات ترجمة استطالة مثل سيكلوهيكسيميد 20 ويتم فصل مقتطفات عصاري خلوي على 5-50٪ سكروز الخطية التدرجات كثافة من قبل تنبيذ فائق. تجزئة اللاحقة من التدرجات السكروز يسمح عزلة mRNAs وفقا لعدد من الريبوسومات التي ربط. يمكن الحمض النووي الريبي المستخرج من كل جزء ثم استخدامها لتحديدتغييرات في توزيع mRNAs وعبر التدرج بين ظروف مختلفة، حيث يزيد كفاءة متعدية من أعلى إلى أسفل التدرج. وتستخدم شمال التنشيف أو الكمي عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (QRT-PCR) لتحديد مستويات mRNAs وفي كل جزء.

بدلا من ذلك، يتم تجميع الكسور التي تحتوي على polysomes الثقيلة (عادة أكثر من 3 ريبوسوم) ويتم تحديد مستويات مرنا المرتبطة polysome على نطاق الجينوم باستخدام ميكروأري أو العميقة التسلسل. فإنه من الأهمية بمكان التأكيد على أن مستويات mRNAs والمرتبطة polysome هي، بالإضافة إلى الترجمة، تتأثر آليات النسخي وبعد النسخي التي تؤثر على مستويات mRNAs وعصاري خلوي 21. لذلك، لتحديد الاختلافات في الترجمة باستخدام بيانات الجينوم على نطاق من المصاحب polysome مرنا فمن الضروري لتصحيح آثار من الخطوات في هذا الجين التعبير المسار التي هي المنبع من transla21 نشوئها. للسماح مثل هذا التصحيح، ويتم إعداد الحمض النووي الريبي عصاري خلوي بالتوازي مع الحمض النووي الريبي المرتبطة polysome من كل عينة ومستويات مرنا حالة مستقرة على نطاق الجينوم ويتم تحديد 21. حاليا، ما يسمى ب "الترجمة الكفاءة" (TE) عشرات (أي بين نسبة سجل بين البيانات مرنا المرتبطة polysome والبيانات مرنا عصاري خلوي) غالبا ما تستخدم لتصحيح آثار التغيرات في مستويات مرنا عصاري خلوي على كفاءة ترجمة ل نظرا مرنا 22. ومع ذلك، باستخدام عشرات TE لتحديد الفرق الترجمة يرتبط مع أعداد كبيرة من النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة بسبب خاصية رياضية من عشرات TE يشار إلى علاقة زائفة إلى 27. في الواقع أشارت دراسة استقصائية لمجموعات البيانات من مختبرات متعددة أن مثل هذه الارتباطات الزائفة ويبدو أن لا مفر منه عند تحليل التغيرات في translatomes 23. دفع هذا التطور من "تحليل الفرق آر anslation "(انوتا) الخوارزمية، والتي لا تعاني من أوجه القصور المذكورة أعلاه 23. انوتا خلال التحليل تم استخدام نموذج الانحدار لاستخلاص التدابير النشاط متعدية مستقلة عن مستويات الحمض النووي الريبي عصاري خلوي. هذه التدابير ثم مقارنة بين الظروف ويحسب الإحصاءات. المستخدم لديه خيار تطبيق طريقة انكماش التباين، مما يحسن القدرة الإحصائية، ويقلل من حدوث نتائج إيجابية كاذبة في الدراسات القليلة مع مكررات 24. بشكل ملحوظ، وقد تجلى ذلك مؤخرا ان الاضطرابات في translatome استولت عليها انوتا، ولكن ليس عشرات TE، ترتبط التغييرات في بروتيوم 25. لذلك، ينصح بشدة لتطبيق التحليل انوتا لتحديد التغييرات في الترجمة على نطاق الجينوم واسعة. في حين تمت مناقشة الأسس النظرية من الخوارزمية انوتا بالتفصيل سابقا 21،23،26، وهنا يتم التركيز على كيفية تطبيقه في الواقع العملي.

ve_content "> وبالإضافة إلى دراسة التغيرات في نشاط الترجمة مرنا في الخلية، وهذا البروتوكول تجزئة الريبوسوم يمكن استخدامها لعزل وكيميائيا ووظيفيا تميز الريبوسوم والمرتبطة polysome المجمعات البروتين. تمت بنجاح تم نشر هذا النهج في الماضي لتحديد المجمعات التي تنظم استقرار البروتينية حديثا توليفها 27 و / أو تشارك في الفسفرة من مكونات الآلات متعدية. كما سيتم مناقشة هذا تطبيق طريقة polysome تجزئة لفترة وجيزة.

البروتوكول

1. إعداد التدرج السكروز

  1. إعداد 100 مل من 60٪ (ث / ت) حل السكروز في DDH 2 O. يجب أن تتم تصفيته الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون لمنع انسداد الأنابيب خلال الخطوة تجزئة (الخطوة 3.5).
  2. إعداد 5 مل من 10X العازلة السكروز التدرج: 200 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 1 م بوكل، 50 ملي MgCl 2، 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد، 1x أداة مثبط البروتياز كوكتيل (خالية من EDTA)، و 100 وحدة / مل ريبونوكلياز المانع.
  3. استخدام الحل 60٪ أعد كما هو موضح في الخطوة 1.1، وجعل 40 مل من 5٪ و 50٪ في حلول السكروز 1X العازلة التدرج السكروز.
  4. استخدام كتلة ماركر المتوفرة مع صانع التدرج بمناسبة نقطة نصف كاملة على كل polyallomer أنبوب تنبيذ فائق للطبقات (6 أنابيب تنبيذ فائق في المجموع). استخدام الجهاز طبقات المتوفرة مع صانع التدرج، إضافة 5٪ محلول السكروز حتى تصل إلى نقطة نصف كاملة. ثم، تضاف 50٪ محلول السكروز من أسفل حتى interfالآس بين الحلين تصل إلى نقطة نصف كاملة. وينبغي إيلاء عناية خاصة خلال هذه الخطوة بحيث التدرجات متشابهة قدر الإمكان، وهذا أمر ضروري للحصول على استنساخ عالية (انظر أدناه).
  5. ختم أنابيب مع قبعات منطقتين معدل تزويد صانع التدرج ونقل أنابيب مختومة إلى صاحب أنبوب على صانع التدرج.
  6. تشغيل صانع الانحدار الخطي للحصول على 5٪ إلى 50٪ التدرج. سيتم تشكيل 6 التدرجات الخطية في بضع دقائق عن طريق التناوب في ارتفاع زاوية الميل.
    ملاحظة: التدرجات السكروز يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.

2. عزل والترسيب من Polysomes

  1. اعتمادا على نوع من الخلايا، خلايا البذور في 1-5 15 سم أطباق بتري (~ 15 × 10 6 خلايا) قبل تحلل يوم واحد على الأقل. في يوم من التجارب ينبغي أن تكون خلايا متكدسة ~ 80٪. ملاحظة: confluency الأمثل أمر بالغ الأهمية لأن معدلات الترجمة والانتشار بشكل مباشر8 النسبي، وبالتالي ينبغي تحليل polysomes في الخلايا المتكاثرة بنشاط (أي سوف تنخفض بشكل كبير معدلات الترجمة في أكثر من خلايا متكدسة في حين confluency منخفض من خلايا قد لا توفر ما يكفي من المواد لمزيد من التحليل). الاستثناءات من هذه القاعدة يمكن أن يتم على سبيل المثال إذا المجرب يهتم بدراسة تأثير الاتصال على تثبيط الترجمة. ومع ذلك، لا ينبغي أن تبقى الخلايا تحت ظروف أكثر متكدسة لفترة طويلة جدا، وهذا قد يكون لها آثار غير مقصودة على translatome.
    إذا كان مطلوبا ترنسفكأيشن، فإن معظم مجموعات المتاحة تجاريا لا تؤثر على مستويات polysome. لأن في اليوم من الخلايا ترنسفكأيشن يجب أن يكون 80-90٪ متموجة، فمن المستحسن لنشر خلايا 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وعزل polysomes 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن من خلايا ~ 80٪ متموجة.
  2. احتضان الخلايا مع سيكلوهيكسيميد في تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل في وسائل الاعلام النمو لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2؛ وغسل الخلايا مرتين مع 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد. سيكلوهيكسيميد هو المانع ترجمة استطالة أن "تجمد" ريبوسوم على مرنا، وبالتالي منع الريبوسوم هرب 20.
  3. تتخلص الخلايا بلطف، في 5 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد وجمعها في أنبوب 50 مل. من المهم أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بسرعة معقولة كما ترك الخلايا على الجليد لفترة طويلة من الزمن ستنخفض بشكل كبير على جودة إعداد polysome.
  4. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. تجاهل الخلايا وطاف resuspend في 425 ميكرولتر من العازلة منخفض التوتر [(5 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 2.5 ملي MgCl 2، 1.5 ملي بوكل و 1X مثبط البروتياز كوكتيل (خالية من EDTA)]، إضافة 5 ميكرولتر من 10 ملغ / مل فروج، 1 ميكرولتر من 1 M DTT، و 100 وحدات من المانع ريبونوكلياز ودوامة لمدة 5 ثانية تليها إضافة 25 ميكرولتر من 10٪ Tritoن X-100 (تركيز النهائي 0.5٪) و 25 ميكرولتر من 10٪ صوديوم Deoxycholate (تركيز النهائي 0.5٪) ودوامة لمدة 5 ثانية. بسبب تورم الخلية، فإن ناقص التوتر العازلة تعطيل غشاء البلازما، في حين يتم استخدام المنظفات ظروف خفيفة الى ذوبان عصاري خلوي والريبوسومات المرتبطة الشبكة الإندوبلازمية دون تعطيل المغلف النووية.
  6. لست] أجهزة الطرد المركزي في 16،000 XG لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية ونقل طاف (~ 500 ميكرولتر) إلى أنبوب قبل المبردة 1.5 مل جديدة. قياس OD في 260 نانومتر لكل عينة باستخدام الطيف والحفاظ على 10٪ من المحللة كمدخل التي سيتم استخدامها لتحديد مستويات مرنا الحالة المستقرة عصاري خلوي. يخفف من المدخلات إلى 750 ميكرولتر في ريبونوكلياز H 2 O الحرة، إضافة 750 ميكرولتر من Trizol وتجميد فلاش في النيتروجين السائل.
  7. نقل أنابيب نابذة فائقة السرعة تحتوي التدرجات السكروز في الدلاء الدوار قبل المبردة. إزالة 500 ميكرولتر من أعلى التدرجات السكروز. ضبط لست] بحيث أنها تحتوي على نفس OD (10-20 OD في 260 نانومتر) في 500 ميكرولتر من العازلة تحلل (موضح في الخطوة 2.5) وتحميلها على كل التدرج السكروز.
    ملاحظة: من المهم لتحميل فورا لست] على التدرجات، حيث سيؤدي ذلك إلى تحسين نوعية خطيرة من الاستعدادات polysome.
  8. تزن كل والتوازن التدرج قبل الطرد المركزي فائقة.
  9. أجهزة الطرد المركزي في XG 222228 (36،000 دورة في الدقيقة)، لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية باستخدام SW41Ti الدوار.
    ملاحظة: من أجل عدم تعطيل التدرجات السكروز، ينبغي اختيار "منخفض" الخيار الفرامل.

3. Polysome التقطير واستخراج الحمض النووي الريبي

  1. إعداد جامع الكسر عن طريق تنظيف مع الماء الدافئ ريبونوكلياز الحرة التي تحتوي على ريبونوكلياز ZAP (بضع البخاخات). كرر هذه الخطوة مع دافئ ريبونوكلياز خالية الماء فقط. التبديل مصباح الأشعة فوق البنفسجية وانتظر الضوء الأخضر لتظهر.
  2. إزالة بعناية الأنابيب من الدوار ووضعها على الجليد. التبديل على جهاز الكمبيوتر، ومضخة، للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية وجزء جامع. ضبط مضخة في 3 مل / دقيقة وفيلل الأنبوب مع الحل مطاردة [60٪ (ث / ت) التي تحتوي على السكروز 0.02٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق] حتى تصل الإبرة. تأكد من أن نرى قطرة واحدة على الأقل الخروج من إبرة، والتأكد من أن يتم تقديم أية فقاعات في محقنة مضخة أو الأنابيب.
  3. وضع 2 مل أنابيب في جامع الكسر. إطلاق برنامج تحليل وتعيين حساسية إلى + / - 10 إلكترون فولت. تعيين "timebase" إلى 100 ثانية.
  4. وضع كل أنبوب تنبيذ فائق في كاشف الأشعة فوق البنفسجية حين التأكد من أن الأنبوب هو في موقف المتعامدة. اختراق أنبوب مع الإبرة من قبل التواء مقبض تحت حامل أنبوب.
  5. ضبط مضخة في 1.5 مل / دقيقة، وجمع الكسور تحديد الوقت إلى 30 ثانية على جامع الكسر (وهذا سوف يؤدي إلى ~ 750 ميكرولتر في كل جزء). وضع مضخة في "الموقف عن بعد"، وبدء ضخ جزء جامع، وفي نفس الوقت بدء التسجيل باستخدام التتبع دق. وهذا بدء النزوح التصاعدي من جرا السكروزdient وكشف في وقت واحد من امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر. وقف جمع في أقرب وقت أول قطرة من حل مطاردة يسقط في 2 مل أنبوب جمع.
  6. حفظ تتبع في تنسيق CSV و(مرة واحدة خطوة اكتمال 3.7)، في تطبيق جداول البيانات، قم بما يلي لتحديد المواقع من كل جزء في ملف تعريف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.:
    1. حدد العمود يحتوي على قيم الموافق الامتصاصية في 254 نانومتر (قناة 0).
    2. إنشاء سلسة مؤامرة مبعثر خط من absorbances.
    3. تعيين وحدة رئيسية من محور X إلى 300 (القيمة التي تم الحصول عليها عن طريق قسمة حجم 5٪ -50٪ السكروز التدرج (~ 12 مل) في الوقت الذي جمع كل جزء (30 ثانية).
  7. إضافة 750 ميكرولتر من Trizol في كل جزء وفلاش تجميد كسور في النيتروجين السائل.
  8. عزل المرتبطة polysome وعصاري خلوي (من 2.6) الحمض النووي الريبي باستخدام بروتوكول Trizol وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لزيادة الغلة الحمض النووي الريبي، والمضي قدما مع PRECI RNApitation في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو -20 درجة مئوية خلال الليل.
    ملاحظة: بسبب كمية من الحمض النووي الريبي عجلت من الكسور polysomal قد لا تكون واضحة للعيان فمن المستحسن لإضافة الناقل. إضافة 1 ميكرولتر من الناقل لأنبوب قبل هطول RNA الخطوة خلال بروتوكول Trizol.
  9. تحديد أي تتوافق الكسور إلى مرنا يرتبط> 3 الريبوسوم (باستخدام وصف نهج 3.6) وتجميع هذه الكسور. استخدام عدة تنظيف الحمض النووي الريبي لأداء تنظيف وتجميع عصاري خلوي المرتبطة polysome الحمض النووي الريبي (من 2.6). تقديم عينات إلى مرفق لتحديد مستويات مرنا على نطاق الجينوم باستخدام ميكروأرس أو العميقة التسلسل.
    إذا ترجمة mRNAs ومحددة تحتاج إلى مراقبة من قبل RT-QPCR، فمن المستحسن استخدام 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (من الكسور المجمعة التي تحتوي على> 3 ريبوسوم أو الحمض النووي الريبي مجموع) لتجميع كدنا].
    ملاحظة: mRNAs ويرتبط> 3 ريبوسوم يتم ضبط تعسفي لتمثيل mRNAs وترجمتها بكفاءة وتحتوي على أكثر من 80٪ من سينت حديثاالبروتينية الحجم 28،29. بما في ذلك الكسور المقابلة للضوء (1-2)، (2-3) المتوسطة والثقيلة polysomes (> 3) سوف يكون من المفيد، ولكن هذه سوف تزيد عدد العينات بنسبة 2 أضعاف (4 ضد 2 في حالة) وبالتالي تكلفة التجربة. على الرغم من أن من المتوقع أن الانخفاض في تكلفة العميقة التسلسل والتحليل ميكروأري في المستقبل، ينبغي تفضيل النهج الأخير، فإنه ينصح بأن أثناء التحقق من الصحة، ويتم رصد توزيع mRNAs والفردية في كل جزء.

4. تحليل الجينوم على نطاق مرنا الترجمة

  1. تثبيت R، bioconductor وحزمة انوتا:
    1. تثبيت R (تنزيل من R-project.org) وبدء الدورة R.
      ملاحظة: R متاحة لجميع أنظمة التشغيل وسيتم تشغيل انوتا على كل منهم.
    2. تثبيت bioconductor (bioconductor.org). يتم تفسير رمز R من خلال (مثل وحدة التحكم R-R محطة في ويندوز - التي أطلقتها دوuble النقر فوق الاختصار R). يتم تثبيت Bioconductor عن طريق كتابة (في محطة-R):

      المصدر ("http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite ()
    3. تثبيت حزمة bioconductor انوتا (والحزمة qvalue يتطلب انوتا) عن طريق كتابة (في محطة-R):

      المصدر ("http://bioconductor.org/biocLite.R")

      biocLite (ج ("انوتا"، "qvalue"))
    4. الاختبار الذي تم تثبيت الحزمة بنجاح وفتح دليل انوتا عن طريق كتابة (في محطة-R):

      مكتبة ("انوتا")

      المصغر ("انوتا")
    5. ملاحظة: مساعدة إضافية لكافة الوظائف التي يتم استخدامها في حزمة انوتا يمكن العثور إما في انوتا صفحات الإنترنت (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) أو باستخدام وظيفة التعليمات داخل R. على سبيل المثال، للحصول على مساعدة في وظيفة anotaPerformQc انتقل إلى R-الشركة المصرية للاتصالاتrminal ونوع (لاحظ أن هذا يعمل فقط عندما تم تحميل حزمة انوتا):

      مكتبة ("انوتا") # بتحميل حزمة انوتا

      ؟ anotaPerformQc # يفتح مساعدة لهذه الوظيفة
  2. استيراد البيانات إلى اليمين:
    1. إعداد البيانات للتحليل التعبير. البيانات يجب قبل معالجة (مثل تطبيع والخاضعة لمراقبة الجودة) فيما يتعلق التقنية التي تم استخدامها لقياس مستويات مرنا. يجب تسجيل قيم الإدخال تحولت، الأكثر شيوعا هو log2. تجميع جدول واحد مع بيانات لجميع عينات الحمض النووي الريبي المرتبطة polysome واحدة لجميع عينات الحمض النووي الريبي عصاري خلوي. يجب أن يحتوي العمود الأول إلى معرفات الجينات تليها عمود بيانات واحدة لكل عينة؛ وينبغي أن تشمل الصف الأول أسماء للعينات. فمن الأهمية بمكان أن يكون الجداول مطابقة عينة من اجل والنظام الجينات متطابقة. حفظ الملفات كملفات نصية المفصول يسمى "myPolysomeData.txt" و "myCytosolicData.txt".
    2. في هذا المثال يتم استخدام فئتين العينة (السيطرة أو المريضة) مع 3 مكررات لكل فئة، وبالتالي توليد 6 عينات مع هذا النظام: C1، C2، C3، D1، D2، D3 في كل الملفات myCytosolicData.txt وmyPolysomeData.txt. يتطلب انوتا لا يقل عن 3 مكررات لكل حالة عندما تكون هناك فئتين العينة. وينبغي أن تكون هذه مكررات البيولوجية مستقلة.
    3. إنشاء الدليل الذي يحتوي على ملفات إدخال البيانات (myPolysomeData.txt وmyCytosolicData.txt). فتح R من هذا الدليل. في ويندوز / ماك يمكن القيام بذلك عن طريق نسخ وR-الاختصار في هذا الدليل وإطلاق R باستخدام هذا الاختصار (والتي تعمل مباشرة كما يمكن تغييرها باستخدام القوائم المنسدلة).
    4. إنشاء ملف يسمى myCode.R ضمن الدليل الذي تم إنشاؤه حديثا وفتحه باستخدام برامج تحرير النص. كتابة التعليمات البرمجية في هذا الملف.
    5. لتحميل البيانات إلى R كتابة التعليمات البرمجية التالية إلى ملف myCode.R (تذكر لإعادة حفظ هذا الملف بعد كل إضافة من التعليمات البرمجية). وفيما يلي ق بخطوةويمكن أيضا أن تكون مكتوبة التفسير TEP من قانون ولكن كل رمز في البداية وظيفة المصدر (الذي يمتد رمز، انظر أدناه) تستخدم مرة واحدة فقط:

      # # هذا بتحميل مكتبة انوتا

      مكتبة (انوتا)

      # # هذا بتحميل إدخال البيانات في R

      dataCyto <- as.matrix (read.table ("myCytosolicData.txt"، رأس = TRUE، row.names = 1، سبتمبر = " ر"))

      dataPoly <- as.matrix (read.table ("myPolysomeData.txt"، رأس = TRUE، row.names = 1، سبتمبر = " ر"))
    6. تشغيل التعليمات البرمجية في البحث عن طريق كتابة مباشرة في محطة R:

      المصدر ("myCode.R")
    7. تأكد من أن تم تحميل البيانات بنجاح عن طريق كتابة (في محطة-R):
      سوف الرأس (dataCyto) # تظهر أعلى جدول dataCyto
      رئيس (dataPoly)
  3. تحديد الجينات ترجمت بشكل مختلف:
    1. إنشاء ناقلات التي تصففئات العينة (ناقلات هو نوع من الكائن في R). هذه النواقل يجب أن تعكس عينة من اجل في myPolysomeData.txt وmyCytosolicData.txt حتى يتسنى لجميع الكائنات الثلاثة أمر مطابقة للعينات. سيتم استخدام ناقلات عند انوتا تعليمات حول أي عينات للمقارنة. إضافة ما يلي إلى ملف myCode.R:

      # # ملاحظة أن العينات تكرار ديك متطابقة فئة عينة

      # # أوصاف (أي "C" أو "D") في هذه النواقل.

      myPhenotypes <- ج ("C"، "C"، "C"، "D"، "D"، "D")
    2. أداء مراقبة الجودة من مجموعة البيانات. وهناك عدد من التدابير النوعية التي تحتاج إلى تقييم قبل انوتا يمكن استخدامها للتحليل. وتناقش هذه بالتفصيل في دليل انوتا. إضافة هذا الرمز إلى ملف myCode.R وحفظ:

      anotaQcOut <- anotaPerformQc (dataT = dataCyto، dataP = dataPoly،phenoVec = myPhenotypes)

      anotaResidOut <- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut)
    3. تشغيل التعليمات البرمجية عن طريق كتابة إلى R-محطة:

      المصدر ("myCode.R")

      وهذا يولد عدد من ملفات الإخراج، والتي يمكن أن تدرس وفقا للتعليمات في دليل انوتا.
    4. تحديد الجينات ترجمت بشكل مختلف. سيتم مقارنة العينات على أساس الترتيب الأبجدي لأسماء الموردة إلى "phenoVec" المعلمة (أي "myPhenotypes" ناقلات) ما لم يتم تحديد من قبل المستخدم (باستخدام "التناقضات" المعلمة). إضافة التعليمات البرمجية التالية إلى ملف myCode.R والانتهاء باستخدام "مصدر" القيادة داخل محطة-R كما هو موضح أعلاه:

      anotaSigOut <- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto، dataP = dataPoly، phenoVec = myPhenotypes، anotaQcObj = anotaQcOut)
    5. استخدام المساعدة لanotaGetSigGenes أن نفهم كيف سيتم تنسيق utput ومعرفة كيفية اختيار فئات عينة للمقارنة عن طريق كتابة (في محطة-R):

      ؟ anotaGetSigGenes
    6. مرشح ومؤامرة الجينات التي يتم ترجمتها بشكل مختلف. هناك عتبات المتعددة التي يمكن تطبيقها ضمن الدالة anotaPlotSigGenes وسوف تساعد على تبسيط استخدام مزيج مخصص لهذه العتبات. لتحديد الجينات لتحليل موثوق تطبيق minSlope (-0.5)، maxSlope (1.5) وslopeP (0.01) الإعدادات.
      ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، لتطبيق الإعدادات RVM 23،26،30 معدل اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت) (0.15) وأمثالها التغييرات (log2 [1.5]) يمكن أن تستخدم على سبيل المثال لتحديد الجينات ترجمت بشكل مختلف. الفلاتر الأخرى مثل "selDeltaPT" يمكن أن تكون مفيدة لتصفية أكثر صرامة (مثل وضع selDeltaPT لlog2 [1.5]). من الضروري أيضا لتحديد التي ينبغي تصفيتها المقارنة (باستخدام حجة selCont). تطبيق الإعدادات التي وصفها إضافة السطر التالي إلى myCode.Rملف:

      anotaSigFiltered <- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut، selContr = 1، minSlope = (-0.5)، maxSlope = 1.5، slopeP = 0.01، 0.15 = maxRvmPAdj، minEff = log2 (1.5)، selDeltaPT = log2 (1.5))
    7. إجراء تحليل باستخدام الدالة مصدر من محطة-R كما هو موضح أعلاه. وهذا أيضا توليد الناتج رسومية. دراسة هذا الإخراج هو نقطة انطلاق جيدة لتقييم أداء تحليل وتحديد أية تغييرات ضرورية على الإعدادات.
    8. إنشاء جدول الإخراج. إضافة التعليمات البرمجية التالية إلى ملف myCode.R:

      write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData، ملف = "MySignificantGenes.txt"، سبتمبر = " ر")
    9. تشغيل التعليمات البرمجية باستخدام وظيفة مصدر في محطة R-. وأوضح الأعمدة في الجدول الناتج في مساعدة لوظيفة anotaPlotSigGenes.

النتائج

mTOR هو العقدة الرئيسية في الشبكة الخلوية التي تنسق معدلات تخليق البروتين العالمية مع توافر المواد الغذائية 19. وينظم الترجمة مرنا بشكل رئيسي في بدء خطوة الحد من معدل 6. نسبة ريبوسوم تشارك في polysomes يرتبط بشكل إيجابي مع معدلات ترجمة الشروع 28. ويقدم مثالا على تطبيق طريقة polysome تجزئة للتحقيق في دور mTOR الإشارات في التوسط آثار الانسولين على ترجمة مرنا. تحقيقا لهذه الغاية، تم الحفاظ MCF7 خلايا سرطان الثدي البشرية في البلدان المنخفضة المصل ومن ثم حفز مع الانسولين وحدها أو بالاشتراك مع موقع نشط mTOR المانع Torin1. حفز الخلايا غير التي تم الاحتفاظ بها باستمرار في انخفاض مصل، وكان بمثابة السيطرة. تم فصل mRNPs، صبغي جنسي أحادي (80S) والكسور polysome باستخدام طريقة polysome تجزئة. نسبة إلى الخلايا السيطرة، بفعل الأنسولين زيادة في الامتصاصية في الكسور التدرج المقابلةلpolysomes، يقابله انخفاض مصاحبة في الامتصاصية في جزء صبغي جنسي أحادي (الشكل 1). تظهر هذه النتائج أن نسبة ريبوسوم تشارك في polysomes يتم زيادة الأنسولين في علاجها بالمقارنة مع الخلايا السيطرة، وبالتالي تشير إلى أن، كما هو متوقع، والانسولين يحفز معدلات ترجمة الشروع العالمية. عكس Torin1 آثار الانسولين على ملامح الامتصاصية (الشكل 1)، وبالتالي مؤيدة النتائج أن mTOR الإشارات يلعب دورا رئيسيا في التوسط آثار الانسولين على آلية ترجمة 19.

استنادا إلى مبدأ أن عدم الاتساق في إعداد التدرج لا يمكن تجنبها، وقد أثيرت تساؤلات بشأن استنساخ البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التجزئة polysome 22. تجريبيا لاختبار هذه المسألة يحتمل أن تكون ضارة، عصاري خلوي والثقيلة المرتبطة polysome الحمض النووي الريبي (مرنا يرتبط مع 4 وأكثر ريبوسوم) كانت معزولة من خلايا MCF7 تعامل مع الانسولين وحدها أو بالاشتراك مع الأنسولين Torin1 من 4 مكررات البيولوجية المستقلة (الشكل 2). تم تحديد آثار الانسولين وTorin1 عن تكوين عصاري خلوي والثقيلة مرنا المرتبطة polysome في كل تكرار على نطاق الجينوم واسعة باستخدام نهج ميكروأري. لتحديد استنساخ الأسلوب polysome تجزئة تم تطبيق تحليل المكون الرئيسي (PCA). وأظهر هذا التحليل أن العينات تنتمي إلى كل حالة ووضع بإحكام داخل اثنين من المكونات الأولى في حين أن ظروف مختلفة تم فصل جيدا (الشكل 2). تظهر هذه النتائج أن طريقة polysome تجزئة كما هو موضح هنا هو تكرار للغاية، وبالتالي مناسبة لدراسة التغيرات الكمية والنوعية في الترجمة على مستوى الجينوم على نطاق.

ad/51455/51455fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg "/>
الشكل 1. محات Polysomal تظهر آثار المجاعة في الدم، والانسولين وmTOR يشير على الترجمة العالمية في الخلايا MCF7. حرمت الخلايا MCF7 من المواد الغذائية (0.1٪ في المحافظة FBS) لمدة 16 ساعة وتعامل مع 5 نانومتر الأنسولين (شهيق) وحدها أو في تركيبة مع 250 نيوتن متر Torin1 (شهيق + Torin1) لمدة 4 ساعات. واستخدمت الخلايا غير المعالجة والتي حرمت باستمرار من المواد الغذائية (0.1٪ FBS) كمجموعة تحكم. تم الرسوبية مقتطفات عصاري خلوي المقابلة بواسطة الطرد المركزي على 5-50٪ التدرجات السكروز. يشار إلى مفارز الريباسي الحرة (40S 60S و)، monosomes (80S) وعدد من الريبوسومات في الكسور polysome.

figure-results-1
الشكل 2. بيانات الجينوم على نطاق الحصول عليها باستخدام عolysome التنميط هو تكرار للغاية، وعولجوا خلايا MCF7 كما في الشكل 1 تم استخراج. عصاري خلوي والمرتبطة polysome الحمض النووي الريبي (> 3 ريبوسوم) من 4 مكررات البيولوجية مستقلة ومستوياتها مرنا على نطاق الجينوم كانوا مصممين باستخدام صفائف GeneTitan ([أفمتريإكس]). وقد استخدم PCA لتقييم استنساخ البيانات الناتجة. المعروضة هي أول عنصرين PCA لجميع العلاجات (T1 = 1 في Torin؛ السيطرة = السيطرة؛ شهيق = الأنسولين)، والأصل من الحمض النووي الريبي (C = عصاري خلوي؛ P = المرتبطة polysome) ويعيد. يتم وضع عينات من نفس حالة والأصل RNA عن كثب مشيرا إلى استنساخ عالية.

المناقشة

يصف هذا المقال بروتوكول polysome تجزئة راسخة تليها طريقة التحليل في المنزل وضعت لالتقاط التغيرات النوعية والكمية في النشاط متعدية على نطاق الجينوم واسعة في خلايا الثدييات. لوينبغي إيلاء الانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول اهتمام خاص ل1) الخلية confluency (حيث أن أسعار انتشار وتوافر المواد الغذائية ترتبط مع نشاط الترجمة مرنا ويمكن أن تؤثر على تكوين translatome، ينبغي أن تكون الخلية confluency متناسقة عبر مكررات والظروف التجريبية)، 2) تحلل الخلايا السريع (على الرغم من وجود سيكلوهيكسيميد ومثبطات ريبونوكلياز في مخازن، وينبغي أن يكون تحلل سريع، وينبغي مضافين مقتطفات الخلوية على التدرجات السكروز مباشرة بعد تحلل الحمض النووي الريبي لمنع تدهور وتفكك polysomes)، 3) إعداد التدرج (لضمان عالية استنساخ البيانات، ينبغي إعداد التدرجات السكروز باستخدام صانع التدرج وجمعية مهندسي البترولينبغي توخي الحذر عند التعامل معها االجتماعية).

بالإضافة إلى دراسة التغيرات في النشاط متعدية، هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل المجمعات البروتين المرتبط الريبوسوم وإقامة وظائفها الفسيولوجية. تحقيقا لهذه الغاية، يمكن تحديد مستويات وحالة الفسفرة من مختلف البروتينات المرتبطة الريبوسوم بواسطة TCA هطول، تليها النشاف الغربية، في حين أن البروتين المجمعات المرتبطة الريبوسوم ويمكن immunoprecipitated من الكسور التدرج وتحليلها بواسطة النشاف الغربية أو مطياف الكتلة. والقصور من هذه التقنية هو أن التدرج البطيء طريقة الكسر يمكن أن يؤدي إلى تفكك البروتينات حتى بإحكام التي هي في السريع النقابية / تفارق حركية ملزمة. العوامل المرتبطة البروتينية حديثا توليفها أمثلة نموذجية. البروتينية حديثا توليفها الناشئة تشكل ريبوسوم يمكن أن يجمد على مجمعات البروتين المرتبطة باستخدام ريبوسوم عبر linkers الكيميائية مثل 3، 3'-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. وكشف هذا النهج أن مستقبلات لC المنشط كيناز 1 (RACK1) / ج يونيو كيناز N-محطة (JNK) / ترجمة حقيقية النواة عامل استطالة 1A2 (eEF1A2) معقدة ينظم تدهور البروتينية حديثا توليفها ردا على التأكيد 27. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام منهجية مماثلة في الدراسات التي تبين أن بروتين كيناز C BII (PKCbII) يتم تجنيدهم للريبوسوم بواسطة RACK1 32 وأن تفعيل mTOR معقدة 2 (mTORC2) يحدث على ريبوسوم حيث phosphorylates البروتينية AKT توليفها حديثا وينظم لهم الاستقرار 33،34.

القيود الرئيسية للأسلوب polysome تجزئة تليها تحليل انوتا هي: 1) شرط وجود عدد كبير نسبيا من الخلايا (~ 15 × 10 6 خلايا)، 2) عدم وجود معلومات بشأن الموضعية توطين الريبوسوم على جزيء الرنا معين، و 3 ) القضايا المتعلقة مغاير الخلوية والجزيئيةgeneity من الأنسجة الطبيعية والورم. القضايا المتعلقة عدد الخلايا المطلوبة يمكن حلها عن طريق مواءمة قمم أطياف الامتصاصية الموافق monosomes (80S) من الخلايا التي تحد مع تلك التي تم الحصول عليها من خلايا عالية فرة (مثل خلايا هيلا) 35 المبالغ. تقنية التنميط الريبوسوم (انظر أدناه) يمكن استخدامها لتحديد الموضع الدقيق من الريبوسوم على جزيء الرنا معين، في حين تتم مناقشة القضايا المتعلقة آثار الخلط من التجانس الأنسجة على تفسير التغيرات في التعبير الجيني تم الحصول عليها من الأنظمة المعقدة مثل الأنسجة البشرية بالتفصيل في منشور من قبل الكراث وستوري 36.

مؤخرا، تم تطوير تقنية التنميط الريبوسوم الرواية، حيث يتم إنشاء الريبوسوم المحمية شظايا (الإقليمي للأمن الغذائي) عن طريق العلاج ريبونوكلياز أنا وتحليلها بواسطة أعماق تسلسل 22. هذه التقنية تسمح بتحديد موقف الريبوسوم في قرار النوكليوتيدات واحد، وبالتالي توفير unpr حتى الآنرؤى ecedented في البيولوجيا الريبوسوم. على سبيل المثال، التنميط الريبوسوم يمكن أن تستخدم لتحديد الكثافة الريبوسوم على جزيء الرنا معين أو تحديد العناصر التي معدلات الترجمة النفوذ بدء مثل مواقع بديلة البدء، البدء في الكودونات غير AUG-والعناصر التنظيمية مثل uORFs. ومع ذلك، هناك العديد من القيود المنهجية التي تحد من قدرة التنميط الريبوسوم إلى تقدير دقيق كفاءة ترجمة مرنا. وتشمل هذه التحيزات مستقلة عرضته تجزئة عشوائية وأنا ريبونوكلياز الهضم، والتحيزات التي أدخلها مثبطات الترجمة (مثل مثبطات استطالة مثل إيميتين وسيكلوهيكسيميد من المرجح أن تحفز تراكم الريبوسوم في مواقع بدء الترجمة)، وعدد كبير من النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة المرتبطة مع عشرات TE فضلا عن عدم دقة في التنبؤ يقرأ التي تنشأ من البروتين الترميز mRNAs و37. ربما الأهم من ذلك، في حين أنالتنميط الريبوسوم يسمح التعرف المباشر على موقف الريبوسوم جزيء الرنا معين، ويقدر عدد ريبوسوم الذي يرتبط مع مرنا تعطى بشكل غير مباشر عن طريق تطبيع الترددات من يقرأ في الإقليمي للأمن الغذائي (المرتبطة الريبوسوم مرنا) أكثر من تلك التي لوحظت في mRNAs ومجزأة بشكل عشوائي (مجموع مرنا). على سبيل المثال، سوف في إعداد بسيطة حيث احتلت أربعة "B" جزيئات مرنا (با، ب ب، قبل الميلاد ودينار بحريني) من قبل أربعة ريبوسوم في المواقف 1 و 2 و 3 و 4، والقصور الكامنة في أسلوب التنميط الريبوسوم لا تسمح التمييز بين سيناريو حيث ربط جميع ريبوسوم 4 فقط مع با مرنا في المواقف 1، 2، 3، و 4 وسيناريو حيث با، ب ب، قبل الميلاد و BD مرنا والمحتلة من قبل كل واحد الريبوسوم في الموضع 1، 2 ، 3، و 4، على التوالي. في المقابل، خلال polysome تجزئة، هو الحفاظ على سلامة polysome، مما يسمح عزل برك من mRNAs ويرتبط مع عدد محدد من ريبوسوم (الشكل 1). هذا الاستيرادالتمييز بين النمل تجزئة polysome والتنميط الريبوسوم يوحي بأن في حين أن الأسلوب السابق يمكن استخدامها لمقارنة مباشرة في mRNAs وmRNP، وعلى ضوء polysome الثقيلة الكسور، ومن المرجح أن تفشل الأسلوب الأخير لالتقاط التغيرات في translatome التي تنتج عن mRNAs والتي تمر بمرحلة انتقالية من ضوء لpolysomes الثقيلة، في حين تبالغ في تقدير مساهمة تلك التي تنتقل من جزء mRNP لpolysomes الثقيلة. وشدد على الأهمية البيولوجية لهذه التناقضات بين الطرق المذكورة أعلاه من قبل مجموعة كبيرة من البيانات التي تبين أن تفعيل متعدية من مجموعة فرعية من mRNAs ومثل تلك التي هي حساسة للeIF4E، والانتقال من الضوء إلى polysomes الثقيلة، في حين أن آخرين، مثل تلك التي تؤوي عناصر 5'TOP، يتم تجنيدهم للpolysomes الثقيلة مباشرة من أحواض خالية من الريبوسوم مرنا 6. ومن المثير للاهتمام، وقد تبين مسار mTOR لتعديل متزامنة ترجمة "تراعي eIF4E" و5'TOP mRNAs و11. لذلك، والاختلافات المنهجية التي تمت مناقشتها أعلاه قد يفسر التعارض الواضح إبرام بين الدراسات باستخدام التنميط الريبوسوم 38،39 وpolysome تجزئة 24 إلى تقييم آثار mTOR تثبيط على translatome.

في الختام، تجزئة polysome والتنميط الريبوسوم طرق التكميلية التي تقدم في المقام الأول المعلومات فيما يتعلق بعدد من الريبوسومات المرتبطة مرنا وموقف الريبوسوم على مرنا، على التوالي. الأهم من ذلك، على الرغم من أوجه القصور ومزايا هذه الأساليب، يبقى من الضروري أن البيانات على نطاق الجينوم التي حصل عليها كل من الإجراءات ويتم تحليل كاف والتحقق من صحتها وظيفيا وكيميائيا.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة منحة (CIHR MOP-115195) وFRQ-S لتكنولوجيا المعلومات، وهو أيضا المستفيد من CIHR جائزة الباحث الشاب؛ ومجلس الأبحاث السويدي وجمعية السرطان السويدية لOL

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هيبسبيوباسيكHB0264
MgCl2< / sub>سيجماM8266
KClVWRCABDH4532
ديثيوثريتول (DTT) BiobasicDB0058
تريسبيوباسيكTB0196
GlycoblueAmbionAM9515ناقل ترسيب الحمض النووي الريبي
ديوكسي كولات الصوديوم سيجماD6750
تريتون X-100سيجماX100
سيكلوهيكسيميدسيجماC1988
كوكتيل مثبط البروتياز  روش04693132001(خالية من EDTA)
مثبط RNase بروميجاN2515
0.45 ومايكرو ؛ م نظام فلتر 150 ملكورنينج431155
سكروزسيجماS0389
RNeasy MinElute Cleanup kit  Qiagen74204طقم تنظيف الحمض النووي الريبي
أنابيب الطرد المركزي الفائق الجدار متعدد الجدران   ؛بيكمان كولتر331372
SW41Ti الدوار حزمة مع الملحقاتبيكمان كولتر331336
أوبتيما L100 XP الطرد المركزي الفائقبيكمان كولترDS-9340A
ISCO الكسر جامع  براندلFC-176-R1
من النوع الثاني مع مسجل الرسم البيانيكاشف الأشعة فوق البنفسجيةبراندلUA-6
أنبوب الثاقب مع خلية التدفق ومضخة الحقنةكابل كاشف براندلBR-A86-5
UA-6براندل60-1020-211
FC-176 كابل الاتصالاتبراندلFCC-176
قاعدة رئيسيةمتدرجة Biocomp108-1مرفقات تشكيل التدرج اللونية
Biocomp105-914A-1Rمرفق صانع التدرج
قياس الحوسبة 8 قنوات 50 كيلو هرتز جهاز الحصول على البياناتMicroDAQUSB-1208FSبرنامج التحليل
مرفق القياس الحوسبة الحصول على البياناتبرنامج MicroDAQTracerDAQ Proالتحليل (تنزيل فقط)
10x عازلة لتدرجات السكروز:
200 ملي مولار HEPES (pH7.6)
1 M KCl
50 mM MgCl2< / sub>
100 & micro ؛ جم / مل سيكلوهيكسيميد
1x كوكتيل مثبط للبروتياز (خالي من EDTA)
100 وحدة / مل مثبط
عازلة
5 ملي Tris-HCl (pH7.5)
2.5 ملي MgCl 2< / sub>
1.5 mM KCl & nbsp ؛
1x كوكتيل مثبط البروتياز (خالي من EDTA)]ثم
أضف سيكلوهيكسيميد (CHX) و DTT ومثبط RNAse و Triton و Sodium Deoxycholate كما هو موضح في النص
أقراص كاشف وحدة RNaseالتحلل الرئيسي

المراجع

  1. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).
  3. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  4. Komili, S., Silver, P. A. Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view. Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).
  5. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  6. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
  7. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).
  8. Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells. J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).
  9. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  10. De Benedetti, A., Graff, J. R. eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases. Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).
  11. Roux, P. P., Topisirovic, I. Regulation of mRNA translation by signaling pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  12. Ron, D., Harding, H. P. Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  13. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).
  14. Proud, C. G. mTOR Signalling in Health and Disease. Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).
  15. Topisirovic, I., Sonenberg, N. mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).
  16. Pavitt, G. D., Proud, C. G. Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease. Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).
  17. Abe, M., Bonini, N. M. MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact. Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).
  18. Kasinath, B. S., et al. Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).
  19. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
  23. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. Identification of differential translation in genome wide studies. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).
  24. Larsson, O., et al. Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).
  25. Colman, H., et al. Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection. J Virol. 87, 6668-6677 (2013).
  26. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).
  27. Gandin, V., et al. Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2. Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).
  28. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).
  29. Gierer, A. Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis. J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).
  30. Wright, G. W., Simon, R. M. A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments. Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).
  31. Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells. Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).
  32. Grosso, S., et al. PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1. Biochem J. 415, 77-85 (2008).
  33. Oh, W. J., et al. mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide. EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).
  34. Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. Activation of mTORC2 by association with the ribosome. Cell. 144, 757-768 (2011).
  35. Bjur, E., et al. Distinct translational control in CD4+ T cell subsets. PLoS Genet. 9, e13(2013).
  36. Leek, J. T., Storey, J. D. Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis. PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).
  37. Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins. Cell. 154, 240-251 (2013).
  38. Hsieh, A. C., et al. The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature. 485, 55-61 (2012).
  39. Thoreen, C. C., et al. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485, 109-113 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تدرج كثافة السكروزعزل الريبوسوماتتحليل ترجمة الحمض الريبي النووي المرسال (mRNA)المعالجة بالسيكلوهيكسيميدالطرد المركزي الفائقاستخلاص الحمض الريبي النووي (RNA)النشاط الترجميتوصيف الريبوسوم
Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.