وصفنا استخدام مراسل الفلورسنت فيروس اللقاحية التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من العدوى الفيروسية والتعبير الجيني من خلال التعبير مرحلة محددة من fluorophores مراسل متميزة طيفيا. نحن بالتفصيل طريقة القائمة على لوحة لتحديد بدقة المرحلة التي يتأثر تكاثر الفيروس ردا على تثبيط جزيء صغير.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فيروسات الجدري هي عائلة من الفيروسات الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل التي تشمل مسببات الأمراض البشرية النشطة مثل جدري القرود، المليساء contagiousum، وفيروس Contagalo. ويشمل الأسرة أيضا فيروس الجدري، الجدري. نظرا لتعقيد تكرار الفيروسة الجدرية، العديد من الأسئلة لا تزال قائمة بشأن استراتيجيتهم التعبير الجيني. في هذه المادة ونحن تصف وضع تصور واستخدام الفيروسات اللقاحية المؤتلف التي تمكن قياس الوقت الحقيقي من مراحل واحدة ومتعددة في التعبير الجيني الفيروسي في شكل عالية الإنتاجية. يتم تمكين هذا من خلال استخدام البروتينات الفلورية متميزة طيفيا كما صحفيين لكل من ثلاث مراحل من تكاثر الفيروس. توفر هذه الفيروسات على نسبة عالية إشارة إلى الضوضاء مع الحفاظ على أنماط محددة المرحلة التعبير، وتمكين المقايسات القائمة على لوحة والملاحظات المجهرية من انتشار الفيروسات والنسخ المتماثل. هذه الأدوات لها استخدامات لاكتشاف فيروسات، ودراسات للتفاعل الفيروس المضيف، والبيولوجية التطوريةبليد الحركة.
المقدمة
تقليديا، يتم درس التعبير الفيروس باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية (مثل النشاف الشمالية، النشاف الغربية، ميكروأري التهجين، الخ) 1. في حين أن هذه الأساليب هي قادرة على توفير معلومات مفصلة فيما يتعلق بتصنيف التغييرات التعبير عن mRNAs والفردية أو البروتينات، فإنها عادة ما تكون غير قابلة للعمليات في الوقت الحقيقي والإنتاجية العالية. وقد تم تطبيق النهج البديلة باستخدام صحفيين القائم على مضان سابقا عند العمل مع فيروسات الجدري؛ ومع ذلك، فقد كان الدافع تنميتها واستخدامها من قبل أهداف متنوعة. تم تصميم العديد من هذه الأساليب للاختيار من الفيروسات المؤتلف 2،3. هذه التقنيات التعبير عن EGFP عند التأ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خلايا بلايت
- فصل خلايا هيلا من لوحة وتمييع في وسائط النمو (DMEM، 2 مم L-تخمة، و 10٪ FBS) إلى ما يقرب من 2.0 × 10 5 خلية / مل. الاستغناء 100 ميكرولتر / جيد في وواضحة لوحة 96 جيدا مسطحة القاع الأسود الجدران (20،000 خلية / جيد).
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة حتى متكدسة في حاضنة 37 درجة مئوية + 5٪ CO 2.
2. تصيب الخلايا
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كمثال على استخدام نموذجي من هذه الفيروسات، وكان يستخدم الفيروس الثلاثي مضان مراسل لمقارنة وجهة تثبيط العديد من الفيروسة الجدرية مثبطات محددة جيدا.
كانت مطلية خلايا هيلا في زراعة الأنسجة المعالجة واضحة لوحات 96 جيدا مسطحة القاع الأسود الجدران وحضنت بين عشية وضحاها. أصيب الطبقات الوحيدة متكدسة في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10 باستخدام إما الثلاثي فيروس مراسل (TrpV؛ الجدول 1) أو المروج أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، لقد وصف الاستخدام العملي لمرحلة متعددة مراسل اللقاحية الفيروس (TrpV)، والذي يوفر، في الوقت الحقيقي التدابير ردود فعل استنساخه من تكاثر الفيروس. باستخدام الفيروسة الجدرية مثبطات محددة جيدا، وكنا قادرين على إظهار أن TrpV يستجيب بطريقة متسقة مع آلية عمل ليفهم كل مثبط. في حين يوفر الفيروس TrpV المعلومات الاكثر شمولا عن الفيروس مرحلة التقدم، على مرحلتين (IREV، LREV) ومرحلة واحدة (EV، والرابع، والوقف) فيروسات يمكن أن تستخدم أيضا على نحو مماثل، والاستفادة من البروتين للطي الأمثل وال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما تكشف ولا براءات الاختراع في انتظار بحثا عن الفيروسات أو أساليب الفحص.
شكر وتقدير
نشكر بشؤون تكنولوجيز (كورفاليس، OR) لتوفير ST-246. وأيد DKR من منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة في علم المناعة في جامعة بوسطن (5T32AI 7309). وأيد هذا العمل في جزء من P41 086180، المعاهد الوطنية للصحة RO1AI1096159-01، وRO3 (لJHC).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| مصل الأبقار الجنينية - Optima ، معطل بالحرارة (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 ملي مولار L-Glutamine ، (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-المعالجة Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 بئر مسطح واضح القاع البوليسترين الأسود معالج TC الصفائح الدقيقة | Corning | 3712 | |
| Trypsin ، 2X ، معقمة ، مشعة | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، ثقافة الخلية (DMSO) | AB03091 | التحليل الحيوي الأمريكي | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC) ، ميغاواط = 280 جم / مول | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| إيساتين وبيتا ؛ -ثيوسيميكاربازون (IBT) ، ميغاواط = 234 جم / مول | فيشر ساينتفيك | NC9075202 | |
| ريفامبيسين ، ميغاواط = 823 جم / مول | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246 ، ميغاواط = 376 جم / مول | مختبرات SIGA ، Corvallis ، أو | ||
| 8٪ محلول مائي بارافورمالديهايد (الفورمالديهايد) | المجهر الإلكتروني العلوم | 157-8 | |
| TempPlate RT فيلم شفاف بصريا | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 2978-2700 | |
| Opti-MEM مصل مخفض متوسط | جيبكو | 31985-070 |
المراجع
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-med....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
