نموذج الفأر لالتهاب الناجم عن مسببات الأمراض المزمنة في مواقع المحلية والجهازية

ملخص

لقد أثبتت النماذج الحيوانية لتكون أدوات لا تقدر بثمن في تحديد آليات المضيف والممرض المحددة التي تسهم في تطوير الالتهاب المزمن. نحن هنا وصف نموذج الفأر العدوى عن طريق الفم مع الممرض البشري Porphyromonas اللثوية ومنهجيات التفاصيل لتقييم تطور التهاب في المواقع المحلية والنظامية.

الملخص

الالتهاب المزمن هو المحرك الرئيسي للتلف الأنسجة المرضية وصفة توحيد العديد من الأمراض المزمنة في البشر بما في ذلك الأورام، أمراض المناعة الذاتية، والأمراض الالتهابية المزمنة. أدلة تورط الناشئة الناجمة عن مسببات المرض التهاب مزمن في تطور وتقدم من الأمراض المزمنة مع مجموعة واسعة من المظاهر السريرية. بسبب المسببات معقد ومتعدد العوامل من الأمراض المزمنة، وتصميم التجارب لإثبات العلاقة السببية وإنشاء الروابط الميكانيكية يكاد يكون من المستحيل في البشر. ميزة استخدام النماذج الحيوانية هي أن كل من العوامل الوراثية والبيئية التي قد تؤثر على مسار مرض معين يمكن التحكم. وهكذا، وتصميم النماذج الحيوانية ذات الصلة من العدوى يمثل خطوة رئيسية في تحديد آليات المضيف والممرض المحددة التي تساهم في الالتهاب المزمن.

نحن هنا وصف نموذج الفأر التي يسببها الممرض infla المزمنmmation في المواقع المحلية والنظامية بعد العدوى مع الممرض عن طريق الفم Porphyromonas اللثوية، بكتيريا المرتبطة بشكل وثيق مع أمراض اللثة البشري. العدوى عن طريق الفم من معين الممرض الفئران الحرة يؤدي الى الاستجابة الالتهابية المحلية مما أدى إلى تدمير الأسنان العظم السنخي الداعم، وهو السمة المميزة لمرض اللثة. في نموذج الفأر أنشئت من تصلب الشرايين، والإصابة بفيروس P. اللثوية تسارع ترسب البلاك التهابات الجيوب الأنفية داخل الأبهر والشريان اللامسماة، يرافقه تفعيل بطانة الأوعية الدموية، وزيادة ارتشاح الخلايا المناعية، والتعبير مرتفع من وسطاء التهابات داخل الآفات. نحن منهجيات التفاصيل لتقييم التهاب في المواقع المحلية والنظامية. استخدام الفئران المعدلة وراثيا والمسوخ البكتيرية المحددة يجعل هذا النموذج مناسبة خاصة لتحديد كل من المضيف والعوامل الميكروبية تشارك في بدء وتطور، ونتائج المرض. Additionallذ، فإن النموذج يمكن أن تستخدم لكشف عن استراتيجيات علاجية جديدة، بما في ذلك التطعيم والتدخل الدوائي.

المقدمة

الالتهاب المزمن هو المحرك الرئيسي للتلف الأنسجة المرضية وصفة توحيد العديد من الأمراض المزمنة في البشر. وتشمل هذه الأمراض الورمية، المناعة الذاتية والأمراض الالتهابية المزمنة ^1. مسببات العديد من الأمراض المزمنة غير واضح ولكن من المفهوم أن تكون معقدة ومتعددة العوامل، تشمل كلا من الاستعداد الوراثي وإدخال العوامل البيئية. في حين أن الدوام للالتهاب لا تزال بعيدة المنال، لمحات الخلوية والجزيئية لتنشيط جهاز المناعة تتداخل إلى حد كبير مع تلك الأنماط التي لوحظت في استجابات المضيف لمسببات الأمراض ^2.

أدلة متزايدة على تورط العدوى مع مسببات الأمراض الميكروبية في تطور وتقدم من التهاب مزمن ومظاهره السريرية المتنوعة ^2،3. يمكن أن تحفز مسببات الأمراض والحفاظ التهاب مزمن مباشرة من تخريب الجهاز المناعي المضيف ووضع العدوى المستمرة ^{4. في غياب استمرار الجراثيم، يمكن يعجل عدوى التهاب مزمن من ردود فعل المناعة الذاتية الناجمة عن المحاكاة الجزيئية لمستضدات الذات، والتغيرات في المستضدات الذاتية التي تجعلها مناعة، أو الضرر الذي يطلق مستضدات المضيف ملثمين سابقا. ولكن نادرا ما يكون تم تحديد مسببات محددة كسبب العالمي لمرض مزمن معين. بدلا من ذلك، فإن غالبية البيانات المتاحة تشير إلى أن مسببات الأمراض تستخدم آليات متميزة للحصول التهاب مزمن مع طيف واسع من المظاهر السريرية ونتائج المرض في المضيف عرضة وراثيا 3. وبالتالي، فهم مفصل من الآليات التي تحفز مسببات الأمراض المحددة التهاب مزمن قد يكون لها آثار كبيرة على الصحة العامة، فضلا عن العلاج والوقاية من العديد من الأمراض المزمنة.}

على الرغم من أن آليات المضيف والممرض محددة تساهم في تحريض وصيانة التهاب مزمن وغير مفهومة، بدأت التقدم في النمذجة التي يسببها الممرض التهاب مزمن إلى زيادة فهمنا لهذه العمليات. وP. اللثوية نموذج العدوى عن طريق الفم هو فريد من نوعه، يتميز نموذج الفأر جيدا من العوامل المسببة للأمراض التي يسببها الالتهاب المزمن الذي يسمح للتحليل آليات المضيف والممرض محددة تساهم في التهاب مزمن في المحلية (فقدان العظام عن طريق الفم) ومواقع النظامية (تصلب الشرايين) ^5،6.

P. اللثوية هو، الممرض عن طريق الفم اللاهوائية سلبية الغرام المتورطين في أمراض اللثة البشري، وهو مرض التهابي مزمن يحركها العدوى يتميز تدمير الأنسجة الداعمة الأسنان ^7. بالإضافة إلى أمراض في الموقع الأولي للعدوى، تراكم الأدلة تورط P. اللثوية يسببها التهاب مزمن في تطور وتقدم من الأمراض الجهازية بما في ذلك تصلب الشرايين ^5، وهو مرض يتميز التهاب مزمنن من جدار الوعاء الدموي الشرياني. العدوى عن طريق الفم من معين الممرض الفئران الحرة مع P. اللثوية يؤدي الى الاستجابة المحلية للالتهابات التي تؤدي إلى تدمير الأسنان العظم السنخي الداعم ^8. P. اللثوية يمكن استردادها من أفواه الفئران المصابة تصل إلى 42 أيام بعد الإصابة ⁸ والفئران تطوير مستويات عالية من الممرض محددة التتر الأجسام المضادة في مصل الدم ^9. في نموذج الفأر أنشئت من تصلب الشرايين باستخدام ئي-E ^{- / -} الفئران (APOE ^{- / -)،} والعدوى عن طريق الفم مع P. اللثوية يحرض الالتهاب المزمن الذي يدفع ترسب البلاك التهابات الجيوب الأنفية داخل الأبهر والشريان ¹⁰ اللامسماة ^11. التهاب التدريجي داخل الشريان اللامسماة من P. -infected اللثوية يمكن رصد الفئران في الحيوانات الحية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي. تشريحيا، والآفات الشريانية من P. -infected اللثوية الفئران تظهر زيادة تراكم الدهون accompaNIED بواسطة تفعيل بطانة الأوعية الدموية، وزيادة ارتشاح الخلايا المناعية، والتعبير مرتفع من وسطاء التهابات ^12. استخدام هذا النموذج في الفئران خروج المغلوب وتوضيح دور مكونات الإشارات المضيفة وسطاء التهابات، وكذلك التفاعلات الخلية المحددة التي تدفع P. اللثوية يسببها الباثولوجيا المناعية ^12-14. وبالإضافة إلى ذلك، حددت تجارب استخدام طفرات بكتيرية محددة P. حرجة اللثوية الفوعة العوامل المساهمة في التهاب مزمن في المواقع المحلية والنظامية ^15.

تفاصيل هذه المقالة منهجيات لتقييم P. اللثوية يسببها التهاب مزمن في المواقع المحلية والنظامية. نحن نقدم بروتوكول مفصلة لتحليل فقدان العظم السنخي بواسطة microCT باستخدام برنامج أميرة. بالإضافة إلى ذلك، نحدد فائدة المسلسل في الجسم الحي MRI الحيوانات الحية لتقييم تقدمية فيflammation داخل الشريان اللامسماة. ندرج منهجيات التصور النوعي والكمي لوحة التهابات الآفات في الشرايين، ووصف توصيف لهم النسيجي. استخدام الفئران المعدلة وراثيا والمسوخ البكتيرية المحددة يجعل هذا النموذج مناسبة خاصة لتحديد كل من المضيف والعوامل الميكروبية تشارك في بدء وتطور، ونتائج المرض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام النموذج للكشف عن استراتيجيات علاجية جديدة، بما في ذلك التطعيم والتدخل الدوائي.

البروتوكول

1. النمو وزراعة البكتيريا

1. خط تجميد أسهم P. اللثوية 381 اللاهوائية على لوحات أجار الدم واحتضان لمدة 3 - 5 ايام في غرفة اللاهوائية (10٪ H _2/10٪ CO _2/80٪ N ₂₎ عند 37 درجة مئوية.
2. استخدام الكائنات الحية نمت لوحة لتطعيم 5 مل الثقافات السائل من الدماغ ضخ القلب مرق (BHI) تستكمل مع خلاصة الخميرة (0.5٪)، هيمن (10 ميكروغرام / مل)، وميناديون (1 ميكروغرام / مل). التالية O / N النمو، ونقل 5 مل الثقافات في 45 مل من BHI.
3. احتضان 50 مل الثقافات السائلة لا هوائيا لadditional18 - 24 ساعة والحصاد في منتصف إلى أواخر مرحلة السجل. ينبغي دائما التحقق ملاحظة الطهارة من الثقافة التي كتبها غرام وصمة عار قبل إدخال البكتيريا في الحيوانات.
4. حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة. نضح طاف و resuspend بدقة بيليه الخلية البكتيرية في 5 مل PBS باستخدام الماصة المصلية. إضافة مبلغ إضافي45 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين عن ما مجموعه ثلاثة يغسل.
5. بعد غسل الماضي، resuspend الكرية خلية في برنامج تلفزيوني بحيث 1:10 التخفيف من ثقافة لديه كثافة ضوئية من 1.0 في 660 نانومتر (وهو OD ₆₆₀ 1 ما يعادل 10 ⁹ خلية / مل). تزن ما يكفي من السليلوز كاربوكسيميثيل (viscocity المتوسط) لتحقيق 2٪ ث / ت حل (على سبيل المثال، 0.1 غرام لكل 5 مل من الثقافة). إضافة ببطء السليلوز كاربوكسيميثيل إلى تعليق البكتيرية في حين vortexing لمن أجل تجنب تراكمها.

2. العدوى عن طريق الفم

ملاحظة: كما هو موضح في الشكل رقم 1، وذلك باستخدام النموذج المناسب والماوس عن طريق الفم نظام العدوى، P. اللثوية يحرض الالتهاب المزمن والباثولوجيا المناعية في المحلي (تجويف الفم) ومواقع النظامية (الشرايين).

1. إدارة سلفاميثوكسازول (0.87 ملغ / مل) وسلفاميثوكسازول (0.17 ملغ / مل) (Sulfatrim) إلى ستة الى 8 أسبوع-Oدينار الفئران الذكور libitum الإعلانية في مياه الشرب لمدة 2 أسابيع للحد من الفلورا الطبيعية. يبقي الحل المضادات الحيوية في الزجاجات العنبر وحمايته من ضوء لمنع تدهور.
2. لتجنب الترسيب من محلول مضاد حيوي، يهز زجاجات مرة واحدة أو مرتين يوميا (أي في الصباح وبعد الظهر). استبدال مع حل الطازجة كل 3 - 5 ايام.
3. بعد أسبوعين، استبدل حل المضادات الحيوية مع مياه الشرب التقليدية. تسمح فترة بقية المضادات الحيوية 2 يوما قبل العدوى عن طريق الفم.
4. تحميل P. اللثوية تعليق / مركبة في السلين حقنة 1 مل مع إبرة التغذية المرفقة. كبح يدويا الماوس عن طريق الاستيلاء على القفا على الجزء الخلفي من الرقبة. ضمان قبضة حازمة بما يكفي لتقييد حركة رأس الفأر.
5. تصيب الفئران عن طريق التطبيق الموضعي للP. اللثوية على سطح الشدق للفك. ضع إبرة التغذية مثل هذا ثايتم محاذاة تي مع سطح الشدق من الأضراس العلوية اليمنى وإخراج 50 ماي من تعليق البكتيرية. تفريق حل بلطف على طول اللثة لمدة 1 دقيقة باستخدام الكرة من الإبرة التغذية.
6. السماح الماوس للراحة لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة قبل تكرار الإجراء على الفك العلوي الأيسر. السيطرة على الفئران تتلقى المعالجة بالمضادات الحيوية والتغذية الأنبوبية عن طريق الفم مع السيارة وحدها (2٪ السليلوز الميثيل كربوكسي في PBS).
7. لدراسة العوامل المسببة للأمراض التي يسببها التهاب مزمن في المواقع المحلية التي يسببها فقدان العظام السنخية عن طريق إصابة الفئران 3 مرات على فترات 2 يوما. التضحية الفئران بعد 6 أسابيع لتقييم فقدان العظام بواسطة microCT.
8. لدراسة العوامل المسببة للأمراض التي يسببها التهاب مزمن في المواقع المحلية والنظامية، عرضة للإصابة بتصلب الشرايين APOE ^{- / -} الفئران 5 مرات في الأسبوع لمدة 3 أسابيع.
   ملاحظة: تقدم مرض في الشريان اللامسماة يتم رصد المسلسل في الجسم الحي بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي. صورة الفئران عند نقاط زمنية مختلفة والتضحية 6-16 أسبوعا الراحلص. في وقت التضحية، وتقييم عبء تصلب الشرايين العالمي من خلال تحليل أون تحديد الوجه وفقدان العظم السنخي بواسطة microCT. تميز آفات تصلب الشرايين بواسطة الأنسجة والمناعية.

3. مايكرو-التصوير المقطعي (microCT)

1. تحضير العينة
   1. التضحية الفئران في نقطة الوقت المطلوب بعد الإصابة. الموت ببطء الفئران عن طريق CO ₂ asphyxation أو طريقة أخرى وافق عليها منشأة الحيوان المؤسسة.
      ملاحظة: جمع الدم عن طريق ثقب في القلب، مصل منفصل، وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحليل مكافحة P.gingivalis مفتش كما هو موضح في مكان آخر ^9.
   2. استخدام زوج من مقص كبير لقطع الرأس الحاد رئيس الماوس في قاعدة الجمجمة. إزالة اللحم مع زوج من ملقط ووضع الجمجمة في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 30 مل من 4٪ بارافورمالدهيد مخزنة. إصلاح العينة ل24 - 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
   3. بعد التثبيت، rinsالبريد العينة بدقة مع برنامج تلفزيوني.
   4. خلق الخزعات كتلة العلوية.
   5. تخزين نصفي الفك العلوي في الصف النسيجي ETOH 70٪ في 4 درجات مئوية حتى التقييم من قبل microCT.
2. الحصول على الصور
   1. أداء عمليات الاستحواذ الصورة باستخدام ماسح ضوئي microCT سطح المكتب. تعيين مصدر الأشعة السينية إلى تيار 114 أمبير وجهد 70 كيلو فولت. تحميل الفردية نصفي للفك في الإناء التصوير والمسح الضوئي على قرار من 12 ميكرون في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة.
      ملاحظة: قم بتحميل عدة نصفي للفك في وقت واحد داخل سفينة التصوير.
   2. إجراء منخفضة الدقة المسح الأولي التي تسمح للمستخدم لترسم حدود لاقتناء الصورة وتقييد المسح إلى المنطقة ذات الاهتمام (ROI) باستخدام النظام.
      ملاحظة: كثافة المينا يجعل تاج الأضراس العلوية تمييزها بسهولة. باستخدام الأضراس كدليل الغروب فضفاضة حدود التصوير لتشمل ثلاثة الأضراس وبون السنخية المحيطةه. يتم استخدام هذه الدالة أيضا للتمييز بين الأفراد نصفي للفك عند مسح عينات متعددة داخل السفينة نفسها.
   3. عندما تكتمل عملية المسح الضوئي، وتحويل ملفات الصور الخام (.ISQ) في dicoms عالية الجودة (.DCM).
3. تحليل صورة
   في هذا البروتوكول، يتم إجراء تحليل الصور باستخدام التصور البيانات وتجهيزها، وبرامج التحليل. أولا، استخدام المعالم المورفولوجية لخلق الطائرة من الأنسب للتقاطع ملاطي (CEJ). ثم استخدم لتحويل نصفي الفك العلوي إلى التوجه معيار للقياس لاحقا من حجم العظم السنخي.
   1. افتح البرنامج وانقر على أيقونة "البيانات المفتوحة" الموجود في الزاوية العلوية اليسرى من بركة. بدلا من ذلك، استخدم ملف> البيانات المفتوحة.
   2. حدد DICOM صورة المكدس وانقر فوق تحميل. يظهر إطار DICOM لودر. انقر فوق موافق.
   3. مراقبة مجموعة البيانات كرمز الأخضر في حوض السباحة. لاحظ أن النقر على كائن بيانات يسبب إضافية ولكنطن ليتم عرضها في منطقة زر في الجزء العلوي من حوض السباحة. اختيار رمز يسبب أيضا بعض المعلومات عن سجل البيانات ليتم عرضها في خصائص المنطقة.
   4. كل رمز في بركة يوفر القائمة المنبثقة التي يمكن اختيار وحدات مختلفة. تنشيط القائمة المنبثقة بالنقر على السهم الأبيض في الزاوية اليمنى من رمز البيانات. تحت وحدة العرض، حدد Isosurface (عرض> Isosurface). سوف تظهر أيقونة Isosurface في منطقة حمام السباحة. عند تحديده، تظهر إعدادات إضافية في خصائص المنطقة.
   5. تعيين نمط رسم للشفافية وعتبة إلى 2،000. ويتم اختيار تأكد من compactify وباختزال تحت أزرار الخيارات. تحت متوسط، وضمان س، يتم تعيين كافة ص، و z إلى 2. انقر فوق تطبيق لتوليد isosurface.
      ملاحظة: لاحظ إعادة الإعمار 3D شفاف للنصفي الفك العلوي في العارض 3D. صالح باستخدام أسلوب السحب شفافة لإعادة الإعمار الصورة أن جذور الأضراس يمكنيمكن التعرف عليها بسهولة. هذا وسوف يكون من المهم عند وضع العينة في التوجه القياسية.
   6. حدد رمز البيانات والأخضر في منطقة خصائص حدد الرمز المحاصيل. مراقبة نافذة عرض أبعاد وإحداثيات البيانات. وضع هذا جانبا في الوقت الراهن. لاحظ أن يظهر المربع المحيط في العارض 3D مع علامات التبويب الخضراء في كل زاوية.
   7. حدد زر في شريط الأدوات التفاعل المشاهد. تعديل حجم المربع المحيط بالنقر والسحب على زوايا الخضراء. تأكد يشمل مربع في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) ويلغي الفضاء الميت قدر والحطام ممكن. هذا سوف يقلل من الطلب الحسابية على الكمبيوتر.
   8. استخدام كرة التتبع زر في شريط الأدوات المشاهد لتدوير الكائن ضمن المشاهد 3D ضمان العائد على الاستثمار وشمل تماما من المربع المحيط. عندما نشعر بالارتياح، انقر فوق موافق في نافذة المحاصيل جانبا في الخطوة 8.
   9. حدد رمز البيانات وتحت وحدة العرض تحديد شريحة المائل (OBS). (عرض> OBS)
   10. حدد OBS. وفي مجال الخصائص، تعيين نوع رسم الخرائط لخطي، ومجموعة نافذة البيانات من -200 إلى 10،000، وأخذ العينات لخيرة. الآن حدد تدوير تحت الخيارات. مراقبة تبديل تدوير في وسط OBS.
   11. حدد زر في شريط الأدوات التفاعل المشاهد واستخدام مقابض تبديل لضبط الطائرة قطع شريحة. إنشاء المستوى السهمي الذي يمتد موازيا لجذور الأسنان وعمودي على سطح الإطباق الأسنان. الطائرة يجب شطر الأضراس الثلاثة (M1-M3)، كما هو موضح في الشكل 2.
   12. إيقاف تدوير وتكرار OBS (الكائن> كائن مكرر). ويبدو OBS جديدة باسم OBS 2. تشغيل تناوب على لOBS 2.
   13. استخدام مقبض تدوير لإعادة توجيه OBS 2 بحيث يكون عمودي مع OBS 1 (انظر الشكل 2).
   14. بدوره تدوير قبالة لOBS 2 و 3 شرائح خلق مكررة. سيتم تسمية هذه OBS 3 و 4 و 5.
4. اختيار نقاط لطائرة من الاحتواء الأفضل
   ملاحظة: خطوات 3.4.1-3.4.5 وصف الموقع من 8 نقاط على طول CEJ يخلق طائرة من أفضل مناسبا. اختيار أربع نقاط من شرائح السهمي وأربعة آخرين من شرائح الاكليلية (انظر الشكل 3). عند اختيار نقطة تقع على شرائح السهمي في 3.4.6، قد يكون من الضروري تعديل OBS 1.
   1. محاذاة OBS 1 مع مركز جذور معظم إنسي من M1 في المستوى السهمي. محاذاة OBS 2 مع مركز الجذر أكثر من إنسي M1 في الطائرة الاكليلية.
   2. محاذاة OBS 3 مع مركز الجذر أوسو البعيدة من M1 في الطائرة الاكليلية. إذا لزم الأمر، وضبط OBS 1 بحيث يتركز تقريبا مع الجذر أوسو البعيدة من M1 في الطائرة saggital عند اختيار نقطة في الخطوة 20.
   3. محاذاة OBS 4 مع منفرق من جذور الشدق من M2. OBS 4 يجب أن تتركز بين جذور أوسو-إنسية وأوسو-M2 البعيدة. إذا لزم الأمر، وضبط الطرافة OBS 1 بحيث يتم توسيط تقريباح الجذر أوسو البعيدة من M2 في المستوى السهمي عند اختيار نقطة في الخطوة 20
   4. ضبط 5 OBS بحيث يتم تشغيله أسفل وسط M3 في الطائرة الاكليلية. إذا لزم الأمر، وضبط OBS 1 بحيث يتركز تقريبا مع جذور معظم البعيدة من M3 في المستوى السهمي عند اختيار نقطة في الخطوة 20.
   5. تكرار أي من OBSs (OBS 6) ويصلح لتحديد نقطة في نافذة الخصائص. ويصلح لنقاط تبديل يسمح الباحث لاختيار 3 أو أكثر من نقطة في 2D أو 3D الكائنات ضمن المشاهد وثم يحسب طائرة من أفضل مناسبا. في هذه الحالة، يتم استخدام OBSs 2D موضح في الخطوات السابقة لتحديد 8 نقاط على طول CEJ.
   6. إخفاء OBS 6 من المشاهد 3D من خلال النقر على المربع البرتقالي في الزاوية اليمنى من رمز البيانات. إخفاء isosurface من المشاهد 3D لجعل CEJ مرئية على جميع شرائح 2D. تحويل الأيمن فوق وحدد 8 نقاط على طول CEJ كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: إذا كان مفتاح التحول لا يتم الاحتفاظ باستمرار عند اختيارالنقاط، سيتم تلقائيا احتساب طائرة بعد أول ثلاث نقاط.
   7. بعد اختيار كل 8 نقاط، وجعل OBS 6 مرئية. لاحظ أن هذا هو شريحة المحوري الذي يمتد موازيا تقريبا لطائرة الإطباق.
5. وتستخدم الطائرة من الأنسب لتحويل البيانات إلى التوجه القياسي لقياسات حجم اللاحقة: التحول وإعادة توجيه ملاحظة.
   1. انقر أيقونة البيانات> حساب> ApplyTransform. يظهر رمز ApplyTransform في منطقة حمام السباحة. انقر على مربع أبيض في الزاوية من رمز ApplyTransform، إشارة مختارة، وانقر على OBS 6.
   2. في خصائص المنطقة، حدد معيار لأسلوب الاستيفاء وتمديد للوضع. تطبيق التحول.
   3. إنشاء isosurface وOBS الاكليلية لملف بيانات جديد. تدوير OBS في الاتجاه المحوري بحيث ما يقرب من عمودي مع M1 (كما هو موضح في الشكل 2). استخدام الشرفات من الضرس والإطباق جurvatures كدليل.
   4. تستخدم هذه الطائرة لتحويل البيانات كما في خطوات 3.5.1 و 3.5.2. حفظ ملف البيانات المحولة.
6. تجزئة وحجم العظام القياس
   ملاحظة: تصف الخطوات التالية تجزئة وقياس العظم السنخي. شريحة المقابلة لطائرة من الأنسب لCEJ يتم تحديد واختيار طائرة مرجعية. ومجزأة العظم السنخي بين CEJ والطائرة إشارة على وجهه الشدق من الأضراس وقياسها. جذور معظم إنسي من M1، والجذر الأكثر البعيدة من M3 يخدم معالم نقطة النهاية و. وضع الطائرة إشارة 15-20 شرائح تحت CEJ تعطي أفضل النتائج. إدراج شرائح إضافية يقدم التقلبات التي أقنعة الاختلافات في حجم العظام بين مجموعات العلاج.
   1. فتح محرر الإنقسام وإنشاء تسمية جديدة لتحويل البيانات.
   2. خلق مواد جديدة وتسميته العظم السنخي.
   3. تحت التكبير والبيانات النافذة، تعيين مجموعة البيانات جيئة وذهابام -200 إلى 10،000.
   4. تحت عرض وإخفاء اختيار التقاطع 2D، 3D MPR، وتقديم 3D حجم الرموز. تعيين نطاق البيانات من 2،500 إلى 8،000. تمكين اخفاء البيانات.
   5. حدد عرض أربعة المشاهدين تحديد المشاهد من شريط الأدوات. يتم تقسيم الشاشة إلى أربعة أجزاء والسماح للفحص في وقت واحد saggital، الاكليلية، ومداخن صورة المحوري، فضلا عن حجم 3D المقدمة.
   6. استخدام كل الأرباع الأربعة لتحديد شريحة مشاركة حيث المينا واضح على وجوه الشدق من M1 و M3. هذا الموقع يتوافق مع الطائرة من الأنسب لCEJ. تسجيل عدد شريحة المحوري.
   7. في الطائرة المحورية، ومواصلة 15-20 شرائح نحو قمة العظم السنخي. هذا يمثل إشارة الطائرة.
   8. استخدام أي تركيبة من الأدوات تجزئة لتحديد العظم السنخي على الوجه الشدق من الأضراس بين CEJ والطائرة المرجعية. استخدام الجذر أكثر من إنسي M1 ومعظم الجذر البعيد من M3 ومعالم نقطة النهاية.
   9. عندما راض، إضافة التحديد إلى السنخية العظام تحت قائمة المواد.
   10. العودة إلى تجمع الكائن. يجب إلحاق أيقونة جديدة مع التمديد ".Labels" إلى أيقونة بيانات الصورة. حدد رمز تسميات وفي القائمة المنسدلة تحديد المواد> MaterialStatistics.
   11. في المنطقة خصائص، حدد المواد وضرب تطبيق. يظهر الجدول عرض العديد من المعلمات لكل مادة على لائحة المواد. تسجيل حجم العظام السنخية.

4. تقييم تصلب الشرايين

1. تشريح الأبهري
   1. تضحية الماوس بواسطة CO ₂ الاختناق في نقطة الوقت المطلوب بعد الإصابة.
   2. ضع الماوس على الجانب الظهري، والشريط أسفل ومسح الفأر مع ETOH 70٪. قطع الجلد على الجانب البطني من منتصف البطن إلى ما فوق عملية سيفي الشكل.
   3. قطع الجلد في منطقة البطن حتى هي عملية سيفي الشكل مرئية. رفع عملية سيفي الشكل مع السلطة الفلسطينية الصغيرةالأشعة تحت الحمراء من الملقط، وجعل التخفيضات على جانبي القفص الصدري، وقطع الحجاب الحاجز. ثم جعل اثنين من التخفيضات أسفل جانبي القفص الصدري لكشف القلب.
   4. يستنزف الماوس باستخدام حقنة الأنسولين 27 G وضعت في قمة البطين الأيمن. خلال جمع الدم، وتناوب دوري إبرة لمنع حجب الافتتاح الجدار البطيني. عادة، 0،8-1 مل من الدم ويمكن الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب.
   5. سوب> ملاحظة: المصل منفصلة وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحليل مكافحة P.gingivalis مفتش كما وصفها في أماكن أخرى ⁹
   6. استخدام مقص لإزالة الأذين الأيمن.
   7. تحديد موقع البطين الأيسر على الجانب الخلفي للقلب. إدخال 21 G الإبرة في قمة البطين الأيسر، مع شطبة من الإبرة التي تواجه وسط الغرفة وتدفق الدورة الدموية ببطء مع 3-5 مل من تثبيتي الأنسجة.
   8. تقليم الدهون والغدة الصعترية المحيطة القلب.
   9. إزالة لوخ ع.
   10. تحديد موقع قوس الأبهر مع الفروع الثلاثة وازالة طبقات الدهون المحيطة التعرض للأفضل.
   11. مواصلة تشريح الشريان الأبهر من القوس إلى قاعدة الحجاب الحاجز.
   12. إزالة الكبد وتهجير الأنسجة المعوية لفضح الشريان الأورطي النازل. تشريح الشريان الأبهر القاصي وصولا الى فروع الشريان الكلوي.
   13. قطع الشرايين الكلوية ومواصلة تشريح وصولا الى التشعب اللفائفي.
   14. مرة واحدة في الشريان الأورطي خالية من معظم الأنسجة الضامة، والعودة إلى الجزء العلوي من الشريان الأورطي وقص الجزء العلوي جدا من الفروع الثلاثة من الشريان الأبهر فوق القلب.
   15. قشر القلب التصاعدي، والقص الكامنة الأنسجة الدهنية من أجل فصل القلب من الجسم.
   16. عقد القلب مع ملقط وسحب التصاعدي، وقطع الأنسجة الضامة التي قد تكون لا تزال المرفقة، ومواصلة السير إلى الكلى ومتابعة وصولا الى الساقين وقص عند أدنى نقطة ممكنة.
   17. إصلاح الشريان الأورطي في 10٪ فورمالين لمدة 1 ساعة مع subsequent PBS غسل ل1HR. بدلا من ذلك، مخزن الشريان الأورطي في 10٪ الفورمالين O / N، شطف في برنامج تلفزيوني في اليوم التالي وتستمر مع تشريح.
   18. مكان الشريان الأورطي إلى 10 سم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني.
   19. باستخدام نطاق تشريح، وإزالة بعناية الأنسجة الغلالة البرانية من الشريان الأورطي.
   20. عندما الشريان الأورطي هو خال من الدهون الزائدة والأنسجة، وقطع أسفل ثلثي القلب. بدء تقشير عضلة القلب بعيدا في نهاية العكس قلب قوس الأبهر. لمبة من الشريان الأورطي يجب أن تظهر ببطء، والتي سوف تكون بيضاء في التلون.
   21. مواصلة تشريح دقيق باستخدام اثنين ملقط حتى المصابيح الأبهري خالية من أنسجة عضلة القلب.
   22. وضع الشريان الأورطي تنظيفها في علبة تشريح السوداء وتغطي مع برنامج تلفزيوني.
2. تعلق من الشريان الأبهر
   1. إبقاء الشريان الأورطي المشمولة في برنامج تلفزيوني في جميع أنحاء تعلق.
   2. وضع الشريان الأورطي في موقف التشريحي مع المصابيح من الشريان الأبهر على يسار.
   3. وضع دبابيس minutien مؤقتة في 5 مواقع ابتداء من الساعة 1) أعلى من الشريان الأورطي، 2) أدناه ثلثفرع القوس، 3) في منتصف الطريق من الأبهر الهابط 4) قرب أدنى حد من الأبهر الهابط 5) أعلاه فرع من الشريان الفخذي.
   4. باستخدام مقص الربيع غرامة اضافية قطع، حتى الجانب الأيسر من الشريان الأورطي، بدءا من فرع الأيسر من الشريان الفخذي وصولا إلى الشريان الأبهر إلى ما دون أدنى فرع من فروع الشريان الأبهر الصاعد.
   5. قطع من الجانب اليساري من أدنى مبة الأبهري في شق ومواصلة خفض للوصول إلى تقاطع قطع على طول قطع رأسي من الشريان الأورطي.
   6. تتقاطع أفقيا الشريان الأورطي ليصل إلى أدنى نقطة من فرع من الشريان الأبهر الصاعد
   7. قطع ما يزيد على الجانب الأيمن إلى فوق أعلى فرع من فروع الشريان الأبهر.
   8. قطع كل فرع لفضح سطحه الداخلي.
   9. إزالة بعض دبابيس المؤقتة واستبدال مع دبابيس دائمة مع هدف تعلق أسفل كل الشريان الأورطي في موقع تشريحي دون للطي، وتمتد من الشريان الأورطي. الهدف هو فضح السطح الداخلي من الشريان الأورطي.
   10. مواصلة تعلق حتى يتعرض جميع السطح الداخلي للالشريان الأورطي واضحة للعيان من فوق وخالية من كثافة بصريةerference من الدبابيس.
3. الدهون تلطيخ والآفة الكمي
   1. يعد السودان IV حل تلطيخ (5 ملغ / مل في 70٪ الأيزوبروبانول). تخلط جيدا وتصفية لضمان عدم وجود بلورات موجودة.
   2. غطاء معلقة الشريان الأورطي في حل رابعا السودان لمدة 50 دقيقة.
   3. يغسل مع 70٪ الأيزوبروبانول ل1-5 دقيقة. شطف بلطف الشريان الأورطي مع ddH20 حتى المياه القادمة من الشريان الأورطي لم يعد أحمر.
   4. تغطية الشريان الأورطي مع برنامج تلفزيوني. التقاط الصور من الشريان الأورطي مع كاميرا عالية الدقة تعلق على مجهر تشريح وحفظ ملفات الصور الرقمية و(.TIFF). وضع الحاكم المقبل لكل صورة للمساعدة في المعايرة.
   5. استخدام البرمجيات يماغيج لتحديد مساحة البطانية ومنطقة من الآفات. يدويا تتبع سطح باطنة لتحديد المنطقة. ويمكن حساب منطقة الآفة باستخدام اللون الآلي العتبة. وهذا يتطلب تحديد عتبة لتحديد كثافة اللون الذي يميز الآفات من المناطق العادية.
   6. حساب النسبة المئوية للسطح باطنة من آفات تصلب الشرايين المغطاة.

5. تقييم نسيجية من الآفات تصلب الشرايين

1. حصاد قوس الأبهر مع أنسجة القلب وتزج في أكتوبر في قالب قاعدة المتاح.
2. جمع 5 ميكرون cryosections المسلسل كل 50 ميكرون في الجيوب الأنفية الأبهر والشريان اللامسماة باستخدام ناظم البرد وضعت في -17 درجة مئوية، وتركيب أقسام الأنسجة على شرائح المجهر. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
3. لتقييم النسيجي، وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين باستخدام الإجراءات المناسبة.

6. المناعى توصيف آفات تصلب الشرايين.

الخطوات التالية مخطط بروتوكول قائم على الضد العام يعمل بشكل روتيني لتقييم آفات تصلب الشرايين في P. -infected اللثوية الفئران. هذا البروتوكول يتطلب الأمثل لكل الأجسام المضادة أو كاشف.

1. إزالة الشرائح من الفريزر وإصلاحلمدة 2 دقيقة في مثبت المثلج (الأسيتون أو مثبت أخرى).
2. تسمح الشرائح للمجيء إلى RT والتسمية مع قلم مقاومة المذيبات.
3. شطف الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني لإزالة مصفوفة تجميد الأنسجة
4. منع النشاط البيروكسيداز الذاتية التي يحتضنها الشرائح في 0.3٪ H ₂ O ₂ الحل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
5. شطف الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة في كل مرة.
6. منع غير محددة وملزمة التي تفرخ في عرقلة العازلة (10٪ مصل الأرنب في PBS) لمدة 30 دقيقة في RT.
7. تمييع الأجسام المضادة الأولية 1:50 في 10٪ مصل الأرنب.
8. تطبيق الأجسام المضادة المخفف إلى أقسام الأنسجة على الشريحة.
9. احتضان لمدة 1 ساعة على RT.
10. شطف الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
11. تمييع مكافحة الفئران المعقدة البيروكسيديز الضد الثانوية 1: 100 في 10٪ مصل الأرنب.
12. تنطبق على أقسام الأنسجة على الشريحة واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
13. شطف الشرائح 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
14. يعد حل الركيزة DAB بإضافة1 قطرة من مولد اللون DAB DAB عازلة على كل 1 مل.
15. استنزاف PBS من الشرائح وتطبيق حل DAB الركيزة. السماح لاحتضان الشرائح لمدة 5 دقائق أو حتى يتم الوصول إلى كثافة اللون المطلوب.
16. غسل 3X في الماء لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
17. مكافحة وصمة عار مع الهيماتوكسيلين.
18. يذوى من خلال 4 تغييرات من الكحول (95٪ 1 دقيقة، 95٪ 1 دقيقة، 1 دقيقة 100٪ و 100٪ 5 دقائق).
19. واضحة في 3 تغييرات الزيلين.
20. ساترة باستخدام حل تصاعد وتحليلها نوعيا بواسطة المجهر. للتحليل الكمي، الحصول على صور وحساب المجال تلطيخ مع يماغيج باستخدام عتبة الآلي.

7. MRI

1. إعداد الحيوان للتصوير بالرنين المغناطيسي
   1. تخدير الفئران التجارب قبل التصوير بالرنين المغناطيسي. أداء الاستقراء الأولي للتخدير باستخدام 4٪ isofluorane المتبخرة لمدة 2-3 دقيقة في غرفة الاستقراء. الحفاظ على التخدير أثناء فترة التصوير باستخدام التدفق المستمر لل0،5-2٪ تبخيرها delivere isofluoraneد من خلال الإعداد مخروط الأنف أو قناع.
   2. بعد بلوغ الطائرة الجراحية التخدير (أي لا استجابة قرصة أخمص القدمين)، ضع الماوس إلى صاحب الحيوان مع أنفها إدراجه ضمن مخروط الأنف. هناك عدة أنواع من أصحاب الحيوانات المتاحة تجاريا التي يمكن استخدامها للحد من حركة المحتملة أثناء التصوير. نستخدم حامل مصممة خصيصا مع شريط لدغة.
   3. مراقبة التنفس والقلب والدورة يتزامن مع الحصول على الصور باستخدام وسادة التنفس (توضع على بطن الفأر) مجهزة بنظام مراقبة الحيوانات والنابضة صغير.
   4. تأمين الماوس ونظام مراقبة على صاحب الحيوان مع فيلم المختبر.
2. الحصول على البيانات MRI
   1. وضع صاحب الحيوان مع رئيس الماوس لأول مرة في موقف ضعيف إلى 30 ملم المسبار الرأسي (مايكرو 2.5) الحفاظ على 23 درجة مئوية و في رأسي الجوف 11.7 T التصوير بالرنين المغناطيسي الماسح الضوئي.
   2. محاذاة حامل مع مركز رانه المهاجم الملف.
   3. إجراء عملية الملئ باستخدام تسلسل نبض واحد.
   4. باستخدام تسلسل نادر، والحصول على الصور الكشفية على ثلاثة اتجاهات متعامدة لخلق صور المحوري، الاكليلية والسهمي.
   5. إجراء دقة منخفضة الرنين المغناطيسي تصوير الأوعية الدموية (MRA) باستخدام تسلسل صدى ungated التدرج 3D مع المعلمات التالية: لوح سمك = 1.5 سم؛ زاوية الوجه = 45 درجة؛ الوقت التكرار = 20 مللي ثانية. صدى الوقت = 2.2 مللي. مجال الرؤية = 1.5 × 1.5 × 1.5 سم؛ مصفوفة = 64 × 64 × 64؛ عدد متوسط ​​= 1. مجموع الوقت المسح الضوئي: 2~3 دقيقة. والغرض من هذا الفحص هو التأكد من أن الصور يتم الحصول عليها في المنطقة المستهدفة (الشريان اللامسماة).
   6. أداء عالية الدقة MRA من الشريان اللامسماة مع ungated التدرج 3D صدى تسلسل باستخدام المعلمات التالية: لوح سمك = 1.5 سم؛ زاوية الوجه = 45 درجة؛ الوقت التكرار = 20 مللي ثانية. صدى الوقت = 2.2 مللي. مجال الرؤية = 1.5 × 1.5 × 1.5 سم؛ مصفوفة = 128 &# 215؛ 128 × 128. كان عدد من متوسط ​​مجموع الوقت = 4. مسح ~25 دقيقة.
   7. الحصول على صور المحوري المستمر لل0.5MM اللامسماة الشريان تحت الترقوة التشعب.
3. تحليل بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي
   1. إجراء إعادة الإعمار وتحليل الصور باستخدام برنامج التصوير المرتبطة الماسح الضوئي. تحقيق إعادة الإعمار 3D من الصور MRA من أقصى كثافة الإسقاط.
   2. استخدام التشعب تحت الترقوة باعتباره علامة تشريحية لمحاذاة البيانات التي حصل عليها من الفئران مختلفة أو نفس الماوس في نقاط زمنية مختلفة. اختيار القسم الهدف عبر الشريان اللامسماة في 0.3- إلى 0.5 ملم مسافة أقل من subclavianbifurcation.
   3. تحديد وحساب مساحة اللمعية من المقطع العرضي مع اختيار يماغيج. يجب أن يتم تنفيذ القياسات بشكل أعمى من قبل اثنين من المراقبين المستقلين. التحقق من قياس التكاثر عن طريق حساب معاملات الارتباط interclass.
   4. للدراسات طولية مع ايماج التسلسليجي، وتطبيع منطقة اللمعية إلى منطقة التجويف الحصول عليها في الأساس (العلبة الأولى في الدراسة) لكل الماوس. التعبير عن النتائج على النحو التغيير في منطقة اللمعية مع مرور الوقت.
   5. إجراء التحليلات الإحصائية المناسبة (أي طالب ر اختبار) لتحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات التجريبية.

النتائج

باستخدام نموذج الفأر المناسب عن طريق الفم ونظام العدوى، P. اللثوية يحرض الالتهاب المزمن والباثولوجيا المناعية في المحلي (تجويف الفم) ومواقع النظامية (الشرايين) (الشكل 1).

في الفئران، والعدوى عن طريق الفم مع P. اللثوية يؤدي الى الاستجابة الالتهابية المحلية التي تحرك تدمير الأسنان العظم السنخي الداعم ^8. P. -infected اللثوية الفئران تطوير استجابات الأجس...

المناقشة

وP. يوفر اللثوية نموذج العدوى عن طريق الفم أداة قيمة لدراسة مسببات الأمراض التي يسببها التهاب مزمن في المواقع المحلية والنظامية. يسمح هذا النموذج الفريد توصيف كل من المضيف والممرض آليات محددة تسهم في التهاب مزمن والباثولوجيا المناعية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النموذج يمكن أن تستخدم للكشف عن استراتيجيات علاجية جديدة، بما في ذلك التحصين والتدخل الدوائي. الخطوات المبينة في هذا البروتوكول تصف نجاح استخدام هذا النموذج والتفاصيل منهجيات لتقييم بدء، التقدم، ونتائج P. ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أميرة البرمجيات التحليلية	مجموعة علوم
التصور الغرفة اللاهوائية DW النموذج العلمي MG500	علم الأحياء الدقيقة الدولي
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	سيجما ألدريتش	51280-5G
Menadione (فيتامين K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
مستخلص الخميرة	Becton-Dickinson	212750
كربوكسي ميثيل السليلوز (اللزوجة المتوسطة)	سيجما ألدريتش	C-4888
سلفاميثوكسازول ومعلق ثلاثي ميثوبريم عن طريق الفم 200 مجم / 40 مجم لكل 5 مل	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
& mu ؛ CT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
السودان الرابع	سيجما ألدريتش	S4261-25G
مطياف Avance 11.7T عمودي التجويف	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
الفئران المضادة للفأر F4 / 80	Serotec	MCA497R
الفئران المضادة للفأر TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 نطاق	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm