لتحسين معرفتنا تشكيل neotissue الخلوية والجزيئية، تم تطوير نموذج الفئران من TEVG مؤخرا. تم زرع الطعوم كما infrarenal ترقيع الوريد الأجوف مداخلة في C57BL / 6 الفئران. هذا النموذج يحقق نتائج مماثلة لتلك التي تحققت في التحقيق السريرية لدينا، ولكن على مدى تقصير حتى الوقت بالطبع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع في نموذج الفأر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وغالبا ما تستخدم السقالات المصنفة قابلة للتحلل مع خلايا نخاع العظام وحيدات النوى (خلايا نخاع العظم) لجراحة لعلاج التشوهات الخلقية في القلب. أظهرت النتائج السريرية طويلة المدى في أسعار المباح ممتازة، ولكن، مع انتشار كبير لتضيق. للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue الأوعية الدموية ومنع التنمية تضيق في الأنسجة المهندسة وترقيع الأوعية الدموية (TEVGs)، قمنا بتطوير نموذج الفأر من الكسب غير المشروع مع ما يقرب من 1 مم القطر الداخلي. الأولى، تم تجميعها TEVGs من السقالات الأنبوبية القابلة للتحلل ملفقة من محبوكة حمض polyglycolic شعرت شبكة المغلفة مع ε-caprolactone وL-lactide من البوليمرات. والسقالات ثم توضع في مجفاد، بالمكنسة الكهربائية لمدة 24 ساعة، وتخزينها في مجفف حتى بذر الخلية. الثانية، وقد تم جمع نخاع العظم من فئران المانحة وتم عزل الخلايا وحيدات النوى من قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي. الثالث، كان ما يقرب من مليون خليةالمصنفة على السقالة وحضنت O / N. أخيرا، تم السقالات المصنف ثم زرعها كما infrarenal ترقيع الوريد الأجوف مداخلة في C57BL / 6 الفئران. أظهرت ترقيع مزروع المباح ممتاز (> 90٪) دون وجود أدلة حدوث مضاعفات الانسداد التجلطي أو تشكيل أمدمي. وهذا نموذج الفئران تساعدنا في فهم وقياس الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue في TEVG.
المقدمة
عيوب القلب الخلقية هي الظروف الخطيرة التي تؤثر على ما يقرب من 8٪ من الولادات الحية في الولايات المتحدة. ما يقرب من 25٪ من الرضع الذين يعانون من عيوب خلقية في القلب أو 2.4 لكل 1،000 ولادة حية، تتطلب العلاج الغازية في السنة الأولى من حياتهم 1. العلاج الأكثر فعالية لأمراض القلب الخلقية هو الجراحة الترميمية. للأسف، والمضاعفات الناجمة عن استخدام القنوات المتاحة حاليا الأوعية الدموية هي السبب الأكثر أهمية للمراضة والوفيات بعد الجراحة.
لمعالجة هذه المشكلة، قمنا بتطوير أول الأنسجة المهندسة وترقيع الأوعية الدموية (TEVGs) للاستخدام السريري 2. شيدت TEVGs من أنابيب البوليستر القابلة للتحلل المصنف مع نخاع العظم ذاتي الخلايا المستمدة من وحيدات النوى (BM-الشركات المتعددة الجنسيات) وزرع كقنوات الوريدي لجراحة القلب الخلقية. أظهرت النتائج معدلات ممتازة في المباح 1-3 سنوات من المتابعة، ولكن مع انتشار كبير من تضيق 3،4. كان من الواضح أن هناك حاجة إلى فهم أفضل لتشكيل neotissue الأوعية الدموية والآلية الكامنة وراء تطوير TEVG تضيق. من أجل فهم أفضل للتنمية TEVGs وآلية التنمية تضيق، تم إنشاء نموذج الأغنام 5،6. في هذا النموذج، وTEVGs تحولت بنجاح في السفن الذين يعيشون وكانت مشابهة في كل من التشكل وظيفة الأوردة الأصلية. كان هذا الاستخدام نموذج الحيوانات الكبيرة خطوة أولى جيدة في توفير معلومات ما قبل السريرية الهامة التي ساعدت الاستخدام السريري للTEVGs. ومع ذلك، فهم كامل من الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue الأوعية الدموية في TEVGs باستخدام نماذج حيوانية كبيرة محدودة بسبب القيود في التوصيف الجزيئي للخلية الظواهر الأوعية الدموية بسبب نقص أنواع الأدوات الجزيئية محددة. للتغلب على أوجه القصور هذه، تم تطوير نموذج الفئران من TEVGs بسبب التقدم السريع في علم الوراثة والبيولوجيا الماوس الخاصة بهم واسعةص توصيف مع ميزة إضافية تتمثل في مقياس زمني تقصير.
في الفئران IVC نموذج مداخلة لخص بإخلاص عملية neovessel التشكيلة التي تحدث في الحيوانات الكبيرة والبشر، ولكن مع مرور دورة زمنية أقصر بكثير 6-9. هنا، بروتوكول مفصلة لتصنيع الكسب غير المشروع على نطاق ضيق باستخدام السقالات القابلة للتحلل، وصفت حصاد BM-MNC والعزلة، BM-MNC البذر على السقالة، وزرع الفساد في نموذج الفئران.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة مستشفى المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام البلاد للطفولة.
1. الكسب غير المشروع تصنيع
- جعل الحل ε-caprolactone وL-lactide كوبوليمر P (LA / CL) وذلك بإضافة 100MG P (LA / CL) في 2 مل ديوكسان تحت غطاء الدخان. وضع الحل على دوامة وخلط مستمر لمدة 1-1.5 ساعة لتذوب تماما.
- في هذه الأثناء، وإزالة ورقة من حمض polyglycolic (PGA) ورأى من الفريزر وقطع العديد 5 × 8 أقسام ملم. أيضا بقطع غيض من ماصة ميكرولتر ،1-10 فقط فوق تصفية.
- إدراج 19 G إبرة (1.5 طول) في نهاية البعيدة من طرف الماصة والتفاف شعر PGA حول إبرة باستخدام ملقط الجزئي.
- دفع بعناية اللباد إلى نهاية البعيدة للطرف الماصة، حيث التجويف هو استقامة من الجزء القريب، وذلك باستخدام إبرة حادة 18 G، في حين يتم إدخال إبرة G 19 في ذلك.
- ماصة40 ميكرولتر P (CL / LA) حل في تلميح ماصة من أعلى. تشبع PGA شعرت مع الحل. ثم دفع فقاعات الهواء خارج باستخدام موزع ماصة. تكرار هذه العملية إذا لزم الأمر.
- المكان الطعوم في أنبوب 50 مل ووضعه في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تأكد من أن رئيس الإبر مواجهة الهبوط.
- نقل أنبوب إلى مجفاد وفراغ لمدة 24 ساعة. تأكد من فتح غطاء أنبوب أن يكون تدفق الهواء.
- اخراج الطعوم وإزالتها من الإبر. قطع طرفي الكسب غير المشروع ترك ملم القسم ~ 5 ووضعها مرة أخرى على الإبر للحفاظ على شكلها. إبقاء الطعوم في مجفف.
- وضع السقالة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجال السلامة الأحيائية هود O / N قبل البذر الخلية.
2. نخاع العظم وحيدات النوى حصاد الخليوي والعزلة
- الموت ببطء الفئران مع جرعة زائدة من الكيتامين / زيلازين (الكيتامين، 200 ملغ / كغ وزيلازين، 20 ملغ / كلغ).
- إزالة العظام (عظام الفخذ ود tibias) من 3 الفئران لمدة 10 زرع الكسب غير المشروع ووضعه في طبق بتري مع 10 سم مكعب RPMI. قطع طرفي العظام ونخاع العظام دافق باستخدام حقنة مع إبرة G 25 في طبق بتري جديدة مع 3 سم مكعب RPMI. جمع نخاع العظام وحل RPMI في 15 سم مكعب وأنبوب غسل طبق بتري مع إضافية RPMI 2 سم مكعب لجمع ما تبقى من BM.
- تأخذ عينة (5-10 ميكرولتر) وعدد الخلايا باستخدام خلية مكافحة الآلي أو عدادة الكريات. سجل النتيجة.
- وضع 5 سم مكعب Ficoll في أنبوب الطرد المركزي 15 سم مكعب وإضافة نخاع العظم وحل RPMI. إضافة الحل بلطف شديد لمنعها من الاختلاط مع Ficoll.
- أجهزة الطرد المركزي في 528 x ج لمدة 30 دقيقة مع "NO الفرامل" في 24 درجة مئوية.
- إزالة الطبقة العليا وردي. جمع الوسط واضحة طبقة الشكل 1، والتي هي طبقة MNC، وتمييع مع PBS 1:1.
- أجهزة الطرد المركزي في محلول مخفف MNC في 528 x ج لمدة 10 دقيقة في 24 درجة مئوية.
- إزالة طاف وديالعود بيليه مع 5 مل PBS.
- أجهزة الطرد المركزي في حل بيليه في 528 x ج لمدة 10 دقيقة في 24 درجة مئوية.
- إزالة طاف. تمييع بيليه مع حجم مناسب من RPMI (~ 200 ميكرولتر).
- أخذ عينة ميكرولتر 5-10 وتعول الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي أو عدادة الكريات. سجل النتيجة. تكرار الخلية عد واحد مزيد من الوقت وحساب متوسط عدد الخلايا.
- تمييع تركيز الخلية إلى 1،000،000 cells/10 ميكرولتر باستخدام RPMI.
3. البذر الخليوي
- سقالة Prewet بإضافة 5 ميكرولتر RPMI luminally لمدة 5 دقائق، ثم إزالة RPMI.
- إضافة 10 ميكرولتر نخاع العظام المستمدة الخلايا أحادية النووية في RPMI من الخطوة 2.12 إلى التجويف السقالة والانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على السقالة.
- خفض إبرة 19 G إلى 1 سم طول ووضع الإبرة في التجويف من السقالة للحفاظ على شكل السقالة. وضع العينة في 24 لوحة جيدا.
- إضافة ميكرولتر 1،000 RPMI إلى كل بئر واحتضان O / N في حاضنة.
4. زرع الكسب غير المشروع
- الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة: 1x أخرى مقص غرامة، وملقط الدقيقة 3X، والمشابك الأوعية الدموية الصغيرة 2X، 1X المشبك ملقط تطبيق، 1x أداة حامل الإبرة الصغيرة، مقص الربيع 1X، 1X ضام.
- 6-8 أسابيع من العمر الإناث تستخدم C57BL / 6 كما الأنسجة المهندسة المتلقين الكسب غير المشروع الأوعية الدموية. إزالة الماوس من قفصه وتزن عليه، ثم تخدير عن طريق حقن داخل الصفاق في الربع السفلي الأيمن من البطن مع كوكتيل الكيتامين / زيلازين (الكيتامين، 100 ملغ / كغ وزيلازين، 10 ملغ / كلغ). يستخدم كيتوبروفين (5 ملغ / كغ، IP) كمسكن ما قبل التخدير.
- فحص مستوى التخدير بواسطة معسر حكاية، ثم مقطع الشعر في البطن. تليين العينين مع مرهم للعين معقمة، ووضع الماوس في وضع رقود ظهري على وسادة. تطهير البطن مع بتدين والكحول منصات. شاركVER الماوس مع ثنى العقيمة وفضح منطقة شق فقط.
- جعل خط الوسط شق البطن من تحت سيفي الشكل إلى منطقة فوق العانة، وإدراج ضام الذاتي الاحتفاظ. التفاف الأمعاء في المياه المالحة الشاش المبلل. تحدد بصراحة الشريان الأورطي infrarenal والوريد الأجوف.
- وضع اثنين من المشابك الأوعية الدموية الصغيرة على حد سواء القريبة والبعيدة الجانبين من الشريان الأبهر والوريد الأجوف ثم فصل بصراحة الشريان الأورطي من الوريد الأجوف إقطع الوريد الأجوف. إذا لزم الأمر، ligate فروع الأبهر البطني مع 10-0 الغرز حيدة على الإبر مدبب.
- زرع على الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع مع نهاية الداني القاصي وإنهاء anastomoses باستخدام العقيمة 10-0 خياطة. تقليم الكسب غير المشروع، عادة 1-2 مم، يعتمد على التشريح من الفأرة. تأمين الكسب غير المشروع مع غرزة واحدة على كلا طرفي القاصي والداني والبدء في خياطة باستمرار مع 4-5 غرز من الجانب الآخر من الكسب غير المشروع. بعد الانتهاء من الجانب الأمامي، والوجه المشابك والطعومإلى الجانب الآخر وخياطة الجانب الخلفي من الكسب غير المشروع. خلال زرع، تدفق الكسب غير المشروع مع الحل الهيبارين في كثير من الأحيان لمنع تجلط الدم الحاد.
- إزالة المشبك الداني والسيطرة على النزيف من خلال تطبيق موضعي للامتصاص وكيل مرقئ العقيمة. عندما يتوقف النزيف تماما، وإزالة المشبك القاصي والسيطرة على النزيف بنفس الطريقة. جعل تدفقات الدم تأكد من خلال الكسب غير المشروع.
- إغلاق عضلات البطن والجلد في طبقتين باستخدام مادة البولي أميد 6-0 سوداء خياطة حيدة مع إبرة شملت مترابطة.
- حقن 0.5 مل تحت الجلد المالحة ووضع الماوس في قفص الانتعاش على وسادة الاحترار حتى الماوس النقالة بشكل كامل. بعد شفائهم، والعودة الماوس لقفص جديد مع الفراش ورقة. إعطاء مسكنات للألم (ايبوبروفين، 30 مغ / كغ، ومياه الشرب) لمدة 48 ساعة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد التخطيطي TEVG غرس في الشكل 1. كان حصادها نخاع العظم من الماوس المانحة وتم عزل الخلايا أحادية النووي باستخدام كثافة الطرد المركزي ثم المصنف على سقالة قابلة للتحلل. حضنت السقالات المصنفة O / N وزرعها لماوس المتلقي باعتبارها الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع.
ويوضح الشكل (2) والمجهر الإلكتروني من PGA-P (CL / LA) السقالة. كان القطر الداخلي حوالي 1 ملم وكان سمك الجدار...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نموذج الفأر من TEVG هو أداة قيمة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لتشكيل neotissue وتطوير تضيق. وقد أظهرت المصنف BM-MNC في كل من الصور النسيجية ووزارة شؤون المرأة من الخلايا المصنفة على الكسب غير المشروع 11. وقد أظهرت كفاءة البذر الخلية أيضا باستخدام فحص الحمض النووي 7. باستخدام هذا النظام النموذج الذي أظهر أن البذر الخلية يقلل من حدوث تطور TEVG تضيق، والتي كانت الوسيلة الأساسية للفشل في تجربة سريرية لدينا الإنسان 3. الخلايا المصنفة اختفى بسرعة من ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل في جزء منها عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة (RO1 HL098228) لCKB.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حمض البولي جليكوليك (PGA) شعر | الهياكل | الحيوية حسب الطلب | |
| طرف ماصة ، 0.1-10 & mu ؛ l | فيشر Sientific | 02-707-456 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7070020 | |
| RPMI متوسط 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| طبق بتري | BD | 353003 | |
| لوحة 24 بئر | Corning | 3526 | |
| أنبوب 15 سم مكعب ؛ | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | يسمى أيضا "Histopaque" |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Littauer قاطع العظام 4.5 "Straight | Roboz | RS-8480 | لمقط حصاد BM |
| 4.5 " | Roboz | RS-8120 | لمقص حصاد BM |
| 4.5" | Roboz | RS-5912 | لمجهر حصاد BM |
| Leica | M80 | ||
| C57BL / 6J (H-2b) ، | مختبرات جاكسون | 664 | 8-12 أسبوعا |
| حقن هيدروكلوريد الكيتامين | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| محلول Xylazine المعقم | Akorn Inc. | NADA # 139-236 | |
| كيتوبروفين | فورت دودج لصحة | NDC 0856-4396-01 | |
| الإيبوبروفين | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| صيدلانيات هيبارين الصوديوم | الصيدلانية | NDC 25021-400 | |
| محلول ملحي (معقم 0.9٪ كلوريد الصوديوم) | شركة Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| مرهم الفازلين للعيون | Dechra المنتجات البيطرية | NDC 17033-211-38 | |
| منصات اليود الإعدادية | Triad Disposables، Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| منصات تحضير الكحول | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| أدوات تطبيق قطنية ذات رأس | فيشر Scientific | 23-400-118 | |
| مقص ناعم | FST | 14028-10 | |
| ملقط Micro-adson | FST | 11018-12 | |
| المشبك تطبيق ملقط | FST | 00072-14 | |
| S & T المشبك الوعائي | FST | 00396-01 | |
| مقص الربيع | FST | 15008-08 | |
| ضاغطات Colibri | FST | 17000-04 | |
| Dumont # 5 ملقط | FST | 11251-20 | |
| Dumont # 7 - ملقط ناعم | FST | 11274-20 | |
| Dumont # 5/45 ملقط | FST | 11251-35 | |
| حامل إبرة Tish / ملقط | Micrins | MI1540 | |
| خياطة أحادية حيدة من مادة البولي أميد السوداء ، 10-0 | شركة AROSurgical Instruments | Corporation TI638402 | لخياطة خياطة |
| أحادية البولي أميد الأسود ، 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | للعضلات وإغلاق الجلد |
| الإسفنج غير المنسوج | McKesson Corp. | 94442000 | |
| مرقئ قابل للامتصاص | إيثيكون | 1961 | |
| 1 مل حقنة | BD | 309659 | |
| 3 مل حقنة | BD | 309657 | |
| 10 مل حقنة | BD | 309604 | |
| 18 جم 1.5 بوصة ، إبرة | BD | 305190 | |
| 25 جم 1 بوصة ، إبرة | BD | 305125 | |
| 30 جم 1 بوصة ، إبرة | BD | 305106 | |
| جهاز تدوير الماء الدافئ | Gaymar | TP-700 | |
| وسادة الاحترار | Gaymar | TP-22G | |
| ماكينة تشذيب | Wahl | 9854-500 |
المراجع
- Heart Association, A. merican Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update. Circulation. 125, (2012).
- Shinoka, T., et al. Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).
- Hibino, N., et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).
- Shin'oka, T., et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).
- Brennan, M. P., et al. Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model. Ann Surg. 248, 370-377 (2008).
- Roh, J. D., et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).
- Hibino, N., et al. Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel. The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).
- Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).
- Naito, Y., et al. Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Eng. Part A. 20, (2013).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter. Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).
- Roh, J. D., et al. Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).
- Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice. Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
