يصف هذا البروتوكول إجراء لأخذ العينات التسلسلية لنخاع عظم الفخذ (BM) دون الحاجة إلى التضحية بالفئران. يسهل هذا الإجراء الدراسات الطولية لتكوين BM للفئران بمرور الوقت ويوفر وصولا تسلسليا إلى الخلايا داخل BM لدراسات خارج الجسم الحي والزرع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أخذ العينات التسلسلية للتركيب الخلوي لنخاع العظم (BM) هو إجراء روتيني بالغ الأهمية لأمراض الدم السريرية. يصف هذا البروتوكول إجراء تقنيا مفصلا خطوة بخطوة لإجراء مماثل في الفئران الحية يسمح بالتوصيف التسلسلي للخلايا الموجودة في BM. يسهل هذا الإجراء الدراسات التي تهدف إلى اكتشاف وجود خلايا تدار خارجيا داخل BM للفئران كما هو الحال في دراسات الطعم الغريب على سبيل المثال. علاوة على ذلك ، يسمح هذا الإجراء باسترجاع وتوصيف الخلايا المخصبة في BM مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs) دون التضحية بالفئران. بالنظر إلى أن التركيب الخلوي للدم المحيطي لا يعكس بالضرورة نسب وأنواع الخلايا الجذعية والسلفية الموجودة في النخاع ، فإن الإجراءات التي توفر الوصول إلى هذه الحجرة دون الحاجة إلى إنهاء الفئران مفيدة للغاية. يتم توضيح استخدام شفط نخاع عظم الفخذ هنا للتحليل الخلوي لخلايا النخاع ، وتوصيف التدفق الخلوي لحجرة الجذع / السلف المكونة للدم ، وثقافة HSPCs المصنفة التي تم الحصول عليها عن طريق شفط نخاع عظم الفخذ مقارنة بحصاد النخاع التقليدي.
المقدمة
< p class = 'jove_content'>جميع خلايا الدم مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). توفر الإجراءات التي تسمح بالوصول إلى نخاع العظم (BM) ، موقع الغالبية العظمى من HSC في الفئران والرجال ، دون الحاجة إلى التضحية بالحيوانات ، موردا لمراقبة مصدر تكون الدم بشكل متسلسل. الهدف العام من الإجراء الموصوف هنا هو توفير بروتوكول مفصل لأخذ عينات من خلايا BM من عظم الفخذ للفئران الحية والتي توفر مادة ممثلة للخلايا والتي سيتم استردادها عن طريق الحصاد التقليدي لخلايا BM من خلال التضحية بالفئران. تتمثل ميزة هذا الإجراء على الحصاد التقليدي لخلايا BM في أن هذا الإجراء لا يتطلب التضحية بالفئران وبالتالي يسمح بالدراسة الطولية لحجرة نخاع العظام للفئران بمرور الوقت.
< p class = 'jove_content'> على الرغم من أن إجراء شفط نخاع عظم الفئران قد تم استخدامه في عدد من الدراسات وتم وصفه سابقا (انظر Sundberg et al. لإجراء مراجعةتاريخية 1) ، لم يتم نشر الإجراءات الرسمية خطوة بخطوة التي توضح هذه التقنية من قبل. يتيح هذا البروتوكول أخذ عينات تسلسلية روتينية من BM لأغراض مثل تقييم النقش في BM للخلايا التي يتم إدخالها خارجيا في الفأر (كما هو الحال في دراسات الطعم الغريب على سبيل المثال2،3) ، وتحليل الخيميرية في BM للمقارنة مع الدم المحيطي (حيث لا تكون النتائج متطابقة بالضرورة) ، ومراقبة وفرة أنواع معينة من الخلايا المخصبة عادة في النخاع مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية ، واسترجاع خلايا BM للزراعة و / أو الزرع خارج الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون تقييم محتويات النخاع مفيدا جدا في نماذج الفئران لمرض الدم حيث أن الشفط مفيد في تقييم عبء مرض الدم في النقاط الزمنية التي قد لا يكون فيها المرض واضحا في الدم المحيطي3-5. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لتقييم استجابة مرض الدم في النخاع للأدوية التي تدار في الدراسات العلاجية. وبالتالي ، فإن الإجراء الموصوف هنا مثالي للباحثين الراغبين في الوصول إلى الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم من الفئران للتحليل الخلوي ، وتحليل قياس التدفق الخلوي ، والزراعة في المختبر ، و / أو دراسات الزرع في الجسم الحي دون الحاجة إلى التضحية أو الإضرار بالفئران.
بروتوكول أخذ عينات BM الموصوف هنا مشابه تماما للتقنية المستخدمة في الحقن داخل الفخذ للمادة مباشرة في تجويف النخاع3،6. يتمثل الاختلاف الرئيسي في أن هذا البروتوكول يفصل إجراء إزالة الخلايا من النخاع بدلا من غرس المادة مباشرة في مساحة تجويف النخاع كما هو الحال مع الحقن داخل الفخذ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت كافة الإجراءات الحيوانية وصفها في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUCs كانت) في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان.
1. تطلع نخاع العظم (BM) خلايا من عظم الفخذ
- تخدير الماوس الذي سيخضع الفخذ تطلع نخاع العظام مع isoflurane و(1-4٪) تدار مع المرذاذ الدقة. عمق التخدير وينبغي رصد كل 5-10 دقيقة في جميع أنحاء الداخلي من خلال مراقبة أنه لا يوجد تغيير في معدل التنفس المرتبطة التلاعب الجراحية و / أو الأذن، أخمص القدمين، وذيل قرصة. وبفعل التخدير مع isoflurane والمحافظة وأيضا في جميع أنحاء الإجراء مع isoflurane و. جرعة ما قبل إجرائية وقائية من البوبرينورفين بجرعة 0.05-0.1 ملغ / كغ تحت الجلد كل 6-12 ساعة يمكن استخدامها لمنع الألم الذي يصاحب الإجراء باعتباره صفةفريق الأمم المتحدة القطري إلى كاربروفين.
- تطبيق مرهم للعين للعيون من الماوس الحث التالية التخدير لمنع جفاف القرنية.
- يتم قص الفراء بعناية من مساحة الجلد ما يقرب من 150٪ أكبر من مساحة الموقع الطموح المنشود. تتم إزالة الفراء فضفاضة مع الشاش رطبة. يرجى الحفاظ على الماوس على لوحة تعميم الماء الدافئ أو غيرها من سطح يسيطر حراريا آمنة لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء العملية.
- تطهير الساق بأكملها التي تحتوي على عظم الفخذ الذي سيخضع الطموح مع ثلاث مجموعات من الدعك بالتناوب (بالتناوب إما مع بوفيدون اليود (بتدين) أو الكلورهيكسيدين (Nolvasan) فرك و 70٪ ايزوبروبيل أو الايثانول 70٪ غارقة الإسفنج الشاش).
- الرطب 0.5 مل حقنة السلين (حجم: 0.5 سم مكعب؛ قياس: 27.5 G) مع الفوسفات مخزنة المالحة عقيمة (PBS) قبل الشفط BM. ملء المحاقن مع 200-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وطرد على الفور برنامج تلفزيوني. كرر هذا الإجراء 2-3 روتتراوح.
- إبقاء عازمة الساق من عظم الفخذ عن طريق دفع الساق مع أي البنصر أو الإصبع الخامس. تأكيد ان طائرة مخدر مناسبة تم تحقيقه. يقام الحقنة باستخدام الإبهام والسبابة. وهذا يسمح للاللقم أن تتعرض ويسهل إدخال الإبرة.
- بعد ترطيب حقنة، أدخل الإبرة من خلال الوتر الرضفي بحيث يتم إيداع الإبرة بشكل آمن بين اثنين من اللقم من عظم الفخذ. من خلال عقد diaphysis بالقرب من الكردوس عظم الفخذ مع الإبهام والسبابة، يتم إدخال الإبرة إلى رمح من عظم الفخذ بسهولة.
- قطب الإبرة إلى الخارج وإلى أعلى بحيث يكون بالتوازي مع رمح من عظم الفخذ. هذا الإجراء يسهل استرجاع محتويات نخاع العظام من عظم الفخذ رمح.
- تحويل اتجاه عقارب الساعة وعكس عقارب الساعة إبرة بينما دفعت به ببطء في تجويف نخاع الفخذ. تأكيد الموضع الصحيح للإبرة عن طريق تحريك بلطف سيRINGE أفقيا.
- برفق على المكبس إبرة الظهر، وخلق الضغط السلبي، في حين تتحرك الإبرة ذهابا وإيابا داخل تجويف BM. ملاحظة: إن حجم BM يستنشق تكون حوالي 5 ميكرولتر الذي يتوافق عادة إلى 0.4-0.8 × 10 6 خلايا وحيدات النوى. وسوف يتم تأكيد الطموح الناجح بصريا من خلال ظهور الدم في الجزء العلوي من الإبرة في قاعدة الحقنة. إذا رأيت أي الدم في حقنة فمن المرجح أن العظم أو الأنسجة جزء صغير عالق في الإبرة. هذا يمكن إزالته من الإبرة عن طريق تحريك المكبس صعودا وهبوطا في برنامج تلفزيوني (وهذا هو أحد الأسباب التي تجعل ينبغي حقنة مملوءة مسبقا مع برنامج تلفزيوني قبل الشفط BM). إذا لا يمكن فكها الأنسجة من حقنة، واستخدام إبرة حقنة جديدة و(مرة أخرى تبلل المحاقن مع 200-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني).
- مرة واحدة ويستنشق BM بنجاح من عظم الفخذ، وإزالة الإبر والمحاقن من عظم الفخذ والفأرة.
- التحرك يستنشق BM إلى أنبوب microfuge العلاقات العامةefilled مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بالنسبة لمعظم التطبيقات، ثم ينبغي أن تبقى الخلايا BM على الجليد حتى مزيد من المعالجة إذا كان ذلك ممكنا.
- بعد الانتهاء من هذا الإجراء، وإدارة مسكن مع كاربروفين 5 ملغ / كغ تحت الجلد. ثم إزالة الماوس من التخدير ووضع على وسادة ساخنة حتى تعافى تماما. ملاحظة: يجب أن يكون هناك أي مضاعفات أو استغاثة من ذوي الخبرة باتباع الإجراء الطموح إذا فعلت بشكل صحيح.
- قبل أن تعود الفئران إلى منطقة السكن، وضمان أنها قادرة على تجول والوصول إلى الطعام والماء. مراقبة الفئران لعلامات الضائقة أو إجراء آخر العدوى في ساعة 24 المقبلة. وتشمل علامات: النزيف المستمر، وفقر الدم والخمول. إذا رأيت أي من هذه العلامات إجراء آخر، يجب أن يتم التخلص من الحيوانات (ق). ملاحظة: يمكن تكرار تطلع BM / أخذ العينات ولكن يجب أن يتم تنفيذ الإجراء تكرار على عظم الفخذ المعاكس لمنع الصدمات المتكررة لنفس الساق. هناك القليل من المعلومات المتاحة عن الابequency أن تطلع BM لا يمكن أن يؤديها. ويتكرر الفخذ تطلع نخاع العظام عموما لا أكثر من مرة كل 2 أسابيع.
2. تقييم المحتوى الخلوي في خلايا يستنشق BM
- بيليه الخلايا التي تم استردادها من BM الطموح ومكان في أنبوب microfuge بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية أو RT.
- نضح طاف ثم resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من الدم الحمراء ACK العازلة تحلل الخلية ("الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم" تحلل العازلة).
- احتضان الخلايا في الحمراء العازلة تحلل الخلية لمدة 10 دقيقة ثم قم بإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني وتدور باستمرار الخليط مرة أخرى في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية أو RT. ملاحظة: يتكون هي lysed بيليه خلايا الدم الحمراء من خلايا وحيدات النوى الآن BM. هذه يمكن معلق لFACS تلطيخ، عد الخلايا، زراعة الأعضاء، تحليل cytospin و / أو أي استخدام آخر (تماما كما خلايا BM تحصد من الفئران ضحى ستستخدم).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد استخدمت الفخذ BM تطلع ماوس C57/B6 الحية للحصول على خلايا وحيدات النوى BM تليها الحصاد BM التقليدية من نفس الماوس بعد التضحية. الخلايا وحيدة النواة BM حصلت عليها طريقتين ثم تم تحليلها من قبل (1) التحليل الخلوي للخلايا BM، (2) تحديد التكرار النسبي للخلايا الجذعية / السلف المكونة للدم (HSPCs)، و (3) فيفو السابقين ثقافة HSPCs فرزها. في الأخير التجربة،-النسب السلبية Sca1 + ج-KIT تم فرز + (LSK) خلايا من خلايا وحيدات النوى التي حصل عليها تطلع BM وكذلك من الحصاد BM التقليدية....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المسلسل الطموح BM هو إجراء روتيني حاسمة لتحقيق السريرية للاضطرابات الدموية في البشر. القدرة على إجراء أخذ العينات المسلسل شابهه من BM في الفئران لتوصيف التركيب الخلوي ومكونات BM طوال التجارب المطولة هو بالمثل قيمة للغاية. هذا الإجراء مفيد لتوصيف وHSPC دون التضحية الماوس ولكن أيضا للكشف عن وجود أنواع الخلايا إضافية في BM في الحالات التي قد لا تكون محتويات الدم المحيطي عاكسة للخلايا المقيمين في BM. وقد استخدم المسلسل الطموح BM بشكل فعال جدا لهذا الغرض في وقت لاحق في رصد وجود خلايا ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
O.A.-W. مدعوم بجائزة المحقق السريري NIH K08 (1K08CA160647-01) ، وجائزة زميل ما بعد الدكتوراه من وزارة الدفاع الأمريكية في أبحاث فشل نخاع العظام (W81XWH-12-1-0041) ، وبرنامج المحققين Josie Roberston ، وجائزة Damon Runyon Clinical Investigator بدعم من مؤسسة إيفان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| ألبومين مصل الأبقار | PAA | K41-001 | |
| ACK المخزن المؤقت للتحلل | محلي الصنع | في 1 لتر ضبط الرقم الهيدروجيني 7.2 ~ 7.4 وتصفية معقمة مع 0.22 & mu ؛ م مرشح فراغ. | |
| 8.3 جم كلوريد الأمونيوم | فيشر Scientific | A661-500 | |
| 1 جم بيكربونات البوتاسيوم | فيشر Scientific | P184-500 | |
| 200 & ل 0.5 م EDTA درجة الحموضة 8 | جيبكو | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 مل حقنة توبركولين 27.5 جرام | بيكتون ديكنسون | 305620 | |
| مصفاة خلية معقمة 70 مو ؛ م | فيشر 22363548 | ||
| Isoflurane ، USP | Attane | NDC: 66794-014-25 | |
| الخلايا الجذعية | للإبرة | الحادة 28110 | |
| إبرة PrecisionGlide 23 جم | بيكتون ديكنسون | 305193 | |
| 3 مل حقنة طرف لور لوك | Becton Dickinson | 309657 | |
| لوحة معالجة غير مزرعة الأنسجة ، 6 بئر | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 × 75 مم 5 مل أنابيب | Becton Dickinson | 352054 | FACS تلطيخ |
| 12 × 75 مم 5 مل مع غطاء مصفاة الخلية | Becton Dickinson | 352235 | FACS تلطيخ |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G و Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A / E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16 / 32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4 & prime ؛ ، 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | لزراعة الميثوسليلوز |
| Carprofen | Crescent Chemical الشركة | C11045850 | 1 جرعة (5 ملغ / كجم) |
| مقياس التدفق الخلوي ، LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube مرهم بيطري (مرهم معقم للفازلين للعين) | Dechra-US | 17033-211-38 |
المراجع
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
