يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

12.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51669

⸱

أغسطس 6, 2014

 ,  , 
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

اندماجي 5 البروتينات الفلورية وضع علامات على الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تسمح في الجسم الحي تتبع النسيلي عبر مبائر واثنين من الفوتون المجهري، وتوفير نظرة ثاقبة العمارة المكونة للدم نخاع العظم خلال التجدد. هذا الأسلوب يسمح رسم الخرائط مصير غير الغازية مشفرة طيفيا من الخلايا المشتقة من HSPCs في أنسجة سليمة لفترات طويلة من الزمن بعد الزرع.

الملخص

قمنا بتطوير والتحقق من صحة العلامات الفلورية منهجية لتتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف (HSPCs) مع القرار المكانية والزمانية عالية لدراسة تكون الدم في الجسم الحي باستخدام الفئران زرع نخاع العظم نموذج تجريبي. اندماجي بمناسبة الجيني باستخدام ناقلات lentiviral ترميز البروتينات الفلورية (FPS) تمكين الخرائط مصير الخلية من خلال التصوير المجهري المتقدم. استخدمت فندق Cerulean، EGFP، الزهرة، tdTomato، وmCherry إلى تنبيغ بالتزامن HSPCs، وخلق لوحة متنوعة من خلايا اللون ملحوظ: ناقلات ترميز خمسة ضباط مختلفة. التصوير باستخدام متحد البؤر / ثنائي الفوتون المجهري الهجين تمكن في وقت واحد تقييم عالية الدقة للخلايا تميز فريد وذريتها بالتزامن مع المكونات الهيكلية للأنسجة. الحجمي يحلل على مساحات واسعة تكشف عن أن مشفرة طيفيا خلايا HSPC المشتقة يمكن الكشف غير جراحية في أنسجة سليمة المختلفة، بما في ذلك نخاع العظم (BM)، لفترات طويلة من الزمن بعد الزرع. دراسات حية تجمع بين multiphoton معدل الفيديو ومتحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير في 4D تثبت إمكانية تتبع الديناميكي الخلوي والنسيلي بطريقة كمية.

المقدمة

إنتاج خلايا الدم، تكون الدم يسمى، والتي تحتفظ بها عدد صغير من السكان من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف (HSPCs). هذه الخلايا الموجودة داخل نخاع العظم (BM) في محراب microenvironmental معقدة تتكون من بانيات، والخلايا اللحمية، الأنسجة الدهنية، وهياكل الأوعية الدموية، وجميع المتورطين في السيطرة على تجديد الذات والتمايز 1،2. كما كان حالها BM لا يمكن الوصول إليها تقليديا على الملاحظات المباشرة، والتفاعل بين HSPC والمكروية التي لا تزال uncharacterized إلى حد كبير في الجسم الحي. سابقا، أنشأنا منهجية لتصور العمارة 3D من BM سليمة باستخدام مضان المجهري متحد البؤر والتفكير 3. نحن تتميز توسيع HSPCs EGFP ملحوظ في BM، ولكن استخدام واحد فقط FP يمنع تحليل تجديد على مستوى النسيلي. مؤخرا جدا ونحن استغل Lentiviral جين الأنطولوجيا (ليغو) ناقلات التعبير جوهري فلوريداالبروتينات uorescent (FPS) لمارك خلايا 4،5 بكفاءة. شارك في تنبيغ HSPC مع 3 أو 5 ناقلات يولد لوحة متنوعة من الألوان اندماجي، مما يسمح تتبع متعددة استنساخ HSPC الفردية.

تميزت HSPC جنبا إلى جنب مع تكنولوجيا التصوير الجديدة يسمح لتتبع الأفراد صاروخ موجه HSPC وengraftment في BM من الفئران المعرضة للإشعاع. واستخدمت ناقلات ليغو للاحتفال HSPC مع 3 أو 5 ضباط مختلفة (من فندق Cerulean، EGFP، الزهرة، tdTomato، وmCherry) واتبع engraftment على مر الزمن في BM بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر و2 الفوتون، مما يسمح التصور الواضح من العظام وغيرها هياكل مصفوفة، والعلاقة من الحيوانات المستنسخة HSPC لمكونات المكروية بهم. تم تنقيته HSPC والخلايا السلبية النسب من C57BL / 6 الفئران BM، transduced مع ناقلات ليغو، وreinfused بواسطة ذيل حقن الوريد حيز ذاب myelo الفئران مسانج. من خلال رصد كميات كبيرة من الأنسجة القص BM نحن تصور engraftment عظمي تحدث في وقت مبكرBM التجدد. ظهرت مجموعات الخلايا مع لون الأطياف المتنوعة في البداية على مقربة من العظام وتقدما مركزيا مع مرور الوقت. ومن المثير للاهتمام، وبعد أكثر من 3 أسابيع يتكون نخاع مجموعات نسيلي العيانية، مما يشير إلى انتشار تكون الدم المستمدة من HSPCs فرد متاخم في نخاع، بدلا من نشرها على نطاق واسع من HSPCs عبر مجرى الدم. كان هناك أقل تنوع الألوان في نقاط زمنية متأخرة، مما يشير إلى صعوبة في transducing طويلة الأجل إعادة إسكانها الخلايا مع ناقلات متعددة.

بالإضافة إلى ذلك، شكلت مجموعات HSPCs في الطحال، جهازا مسؤولا أيضا عن تكون الدم في الفئران. يمكن أن تحل الخلايا الفردية المستمدة HPSC في الغدة الصعترية، والعقد اللمفاوية والطحال والكبد والرئة والقلب والجلد والعضلات والهيكل العظمي، الأنسجة الدهنية، والكلى أيضا. صور 3D يمكن تقييم نوعيا وكميا لتقدير توزيع الخلايا مع الاضطرابات الحد الأدنى من الأنسجة. وأخيرا، فإننا توضيحد جدوى دراسات ديناميكية حية في 4D من خلال الجمع بين الرنانة multiphoton المسح الضوئي ومتحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير. هذه المنهجية تمكن غير الغازية ارتفاع القرار، ومتعدد الأبعاد تتبع خلية من خلايا مصير السكان طيفيا تميز في الهندسة المعمارية 3D سليمة، وتوفير أداة قوية في دراسة تجديد الأنسجة وعلم الأمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتم إيواء جميع الفئران والتعامل معها وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة، والمسجلين في البروتوكول وافقت جنة رعاية واستخدام NHLBI الحيوانية. أنثى B6.SJL-Ptprc (د) Pep3 (ب) / BoyJ (B6.SJL) وC57BL / 6 الفئران، 6-12 أسابيع من العمر، استخدمت متبرع والمتلقي، على التوالي.

وترد قائمة المواد والكواشف والمعدات في الجدول 1.

1. ليغو تنبيغ من ماوس HSPCs وزرع النخاع

أداء الإجراءات الموضحة أدناه في مستوى شهادة السلامة الأحيائية 2 (BSL-2) مجلس الوزراء (زراعة الأنسجة هود).

  1. إنتاج ليغو ناقلات ترميز 5FPS
    1. استخدام lentiviral "جين علم الوجود" (ليغو) البلازميدات ناقلات، كل ترميز FP مختلفة من المروج SFFV التأسيسي قوي، بما في ذلك ليغو-Cer2 (فندق Cerulean)، ليغو-G2 (EGFP)، ليغو-V2 (فينوس)، ليغو-T2 (رdTomato)، ويغو-C2 (mCherry) التي تفضلت الدكتور بوريس Fehse (المركز الطبي بجامعة هامبورج إيبندورف، هامبورغ، ألمانيا). الآن متاح أيضا من Addgene 5-7.
    2. لإنتاج ناقلات ليغو، والبذور 5 × 10 6 293T الخلايا في أطباق 10 سم (12 استخدام أطباق لكل ناقلات) 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن في 8 مل من I10 وسائل الإعلام (IMDM تستكمل مع 10٪ FCS والجلوتامين / البنسلين / الستربتومايسين).
    3. بالنقل الخلايا مع فوسفات الكالسيوم باستخدام معدلة بشكل طفيف توصيات عدة CAPHOS:
      1. لكل لوحة مزيج 15 ميكروغرام متجه ليغو، 12 ميكروغرام pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE، 4 ميكروغرام السابق-TAT، و1 ميكروغرام البلازميدات pMD2.G VSV-G-بحضور 50 ميكرولتر 2.5 M CaCl 2، وإضافة الماء ل تسفر عن إجمالي حجم 500 ميكرولتر.
      2. البلازميدات راسب الحمض النووي مع 500 ميكرولتر من 2X أنواع البسكويت العالي الطاقة (HEPES مخزنة المالحة)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة إلى كل لوحة من الخلايا 293T.
      3. احتضان خلايا ل6 ساعة في 37 ° C 5٪ CO 2 الحاضنة. إزالة وسائل الإعلام والثقافة وسائل الإعلام إضافة العذبة آخر 6 ساعة ترنسفكأيشن.
    4. جمع supernatants الثقافة التي تحتوي على جزيئات lentiviral من كل لوحة، يوميا، لمدة 3 أيام. كل مجموعة طاف اليوم التالي اضف الوسائط I10 جديدة لكل لوحة.
      1. تصفية من خلال 0.22 ميكرون المسام وحوض سباحة والتركيز supernatants بواسطة تنبيذ فائق على الدوار SW28 لمدة 2 ساعة في 71،900 x ج و 4 درجات مئوية.
      2. Resuspend وsupernatants في 1 مل من StemSpan سائل الإعلام. قسامة الأسهم lentiviral في 200 ميكرولتر وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. Lentiviral المعايرة من الجسيمات
    تحديد عيار من ليغو الجسيمات ناقلات في supernatants يتم جمعها عن طريق تحديد الكميات من transducing وحدة / مل باستخدام خلايا NIH3T3. التتر تسمح حساب حجم كل طاف ناقلات اللازمة ليؤدي إلى تعدد النسبي المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) للهدف التجريبيالخلايا.
    1. لوحة 5 × 10 4 NIH3T3 خلايا لكل بئر (لوحة 12 أيضا) في 2 مل من وسائل الإعلام I10 قبل يوم واحد من المعايرة.
    2. إعداد التخفيفات التسلسلية 5 أضعاف من supernatants متجه في وسائل الإعلام I10 تستكمل مع بروتامين سلفات (4 ملغ / مل هو 1،000x).
    3. إزالة وسائل الإعلام من الخلايا، واستبدالها مع 500 ميكرولتر من التخفيفات طاف تحتوي على ما يعادل 2، 0.8، 0.32، 0.128 وميكرولتر من فيروس المركزة.
    4. تحديد عدد (لا) للخلايا الحالية لكل بئر في الوقت تنبيغ، عد عنصر تحكم واحد أيضا.
    5. 6 ساعة بعد تنبيغ، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام I10 واحتضان لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    6. حصاد الخلايا من كل بئر باستخدام التربسين-EDTA، وتحديد النسبة المئوية للخلايا الفلورسنت (٪ FP) عبر التدفق الخلوي.
    7. حساب عيار النحو التالي، حيث بلغ متوسطها التتر تم الحصول عليها لكل بئر (تمييع) مما أدى إلى FP بين 1٪ و 50٪: عيار (جزيئات ناقلات / مل) = لاس٪ FP / حجم طاف ناقلات (مل). متوسط ​​التتر تم الحصول عليها لكل التخفيف إذا كان FP٪ ما بين 1 و 50٪.
  3. الماوس مجموعة خلية، تنقية، تنبيغ، وزرع (كما هو موضح تخطيطي في الشكل 1A تكييفها من Malide وآخرون. 4).
    1. التضحية الفئران المانحة بواسطة إجراء المعتمدة. حصاد نخاع العظم من أطرافه الأمامية والخلفية: تشريح العضد، وعظام الفخذ tibias، وإزالة شاملة في جميع العضلات والأربطة والأنسجة الزائدة من العظام، تتقاطع مع نهاية كل العظام في أقرب وقت ممكن إلى المفاصل، وطرد نخاع العظام من العظم باستخدام إبرة G 27-0 على حقنة تحتوي على وسائل الاعلام I10.
    2. بيليه خلايا نخاع العظم بأكملها لمدة 10 دقيقة في 500 x ج، 4 ° C وليز خلايا الدم الحمراء مرتين مع 50 مل ACK العازلة. خلايا resuspend في 10 مل سائل الإعلام I10.
    3. تنقية نسب سلبية (Lin-) الخلايا الاصلية مع MACS عدة نضوب النسب وفقا لعدة protoco تعديلل:
      1. استخدام 30 ميكرولتر من بلي مكافحة البيوتين بدلا من 10 ميكرولتر / 10 7 خلايا. استكمال خطوات الغسيل مع وسائل الإعلام I2 (IMDM تستكمل مع 2٪ FCS) بدلا من العازلة.
      2. إدراج خطوة غسل واحد بين الحضانة مع كوكتيل البيوتين الأجسام المضادة والحضانة مع مكافحة البيوتين بلي. ويوازن العمود مع I10 بدلا من العازلة.
    4. ثقافة خلايا Lin- لمدة 48 ساعة في مناطق ذات كثافة الانطلاق من 5 × 10 5 خلية / مل في وسائل الإعلام StemSpan تستكمل مع 10 نانوغرام / مل IL-3 الفئران، و 100 نانوغرام / مل الفئران IL-11، 100 نانوغرام / مل البشري العميد بحري-3 يجند، و 50 نانوغرام / مل الفئران عامل الخلايا الجذعية.
    5. نقل 1-4 × 10 5 خلايا إلى 12 جيدا لوحات مغطاة RetroNectin وتنبيغ مع supernatants ليغو، كل في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 6-7 إلى تحقيق 50٪ كفاءة التعبير لكل FP، في حضور StemSpan وسائل الإعلام والسيتوكينات المفصلة أعلاه و 4 ميكروغرام / مل سلفات بروتامين.
    6. تنبيغ الخلايامع كل متجه ليغو بشكل فردي كما هو موضح في الخطوة 1.3.5 والخلايا مزيج التالية التنبيغ (وهو ما يسمى ميكس) أو زملاء تنبيغ الخلايا مع جميع supernatants 5 ناقلات ليغو في وقت واحد (وهو ما يسمى مجموعة). إزالة الخلايا بعد 24 ساعة، ويغسل مرة واحدة مع StemSpan سائل الإعلام دون السيتوكينات، و resuspend لهم في وسائل الإعلام StemSpan دون السيتوكينات للزرع، أو نقلها إلى وسائل الإعلام الطازجة مع السيتوكينات، والثقافة لمدة 96 ساعة إضافية قبل المجهري متحد البؤر والتدفق الخلوي.
      1. إجراء زرع نخاع العظم عن طريق غرس transduced Lin- HSPCs عبر الذيل حقن الوريد إلى 11 جرعة واحدة غراي المتلقين قبل المشع (6-18 ساعة قبل الزرع) المتلقين، في حجم 100 ميكرولتر، بجرعة خلية في الماوس الموافق 1 خلايا -4 × 10 5 Lin- مطلي أصلا لترنسدوكأيشن. في كل تجربة، وزرع فوج كامل من الحيوانات مع نفس السكان من الخلايا المانحة BM transduced.
      2. لتوصيف في المختبر من transduced Hالبلدان المشمولة بالبرمجة الاستراتيجية والثقافة الخلايا لمدة 4-5 أيام إضافية في StemSpan تستكمل مع السيتوكينات وتحليل التدفق الخلوي لكفاءة ترنسدوكأيشن، وبواسطة المجهر لتنوع الألوان.
        1. التضحية الفئران الفردية واسترداد الأنسجة والأعضاء التصوير، في وقت نقاط مختلفة تصل إلى 120 يوما بعد زرع.
          1. رذاذ مع الايثانول الفراء من الماوس وشق الجلد على الجانب البطني تجنب نشر الشعر.
          2. تشريح والمكوس وفقا للإجراءات القياسية الطحال، الغدد الليمفاوية المأبضية والرئة والقلب والجلد والأنسجة الدهنية والعضلات والهيكل العظمي والكلى والكبد، وكذلك الرأس إلى الوصول إلى calvaria.
          3. بدلا من ذلك، استخدم calvaria أو إنشاء نافذة العظام للتصوير الحي مرارا وتكرارا على مر الزمن 2،8،9 أو صورة أجهزة سطحية مثل الجلد والعقد الليمفاوية في الحيوانات الحية.
        2. وضع الأجهزة الفردية في 35 ملم الأطباق ثقافة الرقم 0 غطاء زجاجي في 50-10056؛ ل PBS لتصوير لهم على حالها دون باجتزاء، تثبيت أو مزيد من المعالجة كما هو موضح في الخطوة 2.5.
        3. للتصوير الحجمي، والحفاظ على الأجهزة في في برنامج تلفزيوني الباردة حتى الاستخدام. عن الوقت الفاصل بين التصوير الشروع فورا في أجهزة التصوير في DMEM، و 10٪ FBS تحتوي على 20 ملي HEPES في 37 ° C

2. متحد البؤر وثنائي الفوتون الميكروسكوب وتحليل الصور

  1. أداء التصوير المجهري باستخدام خمس قنوات متحد البؤر وmultiphoton نظام ايكا SP5 مجهزة متعدد الخطوط الأرجون وديود 561 نانومتر، 594 نانومتر الحنة، والحنة 633 نانومتر ليزر مرئية. استخدام في وضع 2 الفوتون، وهو الفيمتو ثانية نابض تي: الياقوت (تي سا) الليزر، والانضباطي لالإثارة من 680 إلى 1،080 نانومتر مع تصحيح التشتت. استخدام في التجارب التي تنطوي الأحمر تحول إطارا في الثانية (tdTomato وmCherry)، وهو مذبذب حدودي البصرية (OPO) الليزر لتوسيع نطاق الطول الموجي الناتج بقدر 1،030-1،300 نانومتر، أو بالتتابع في وقت واحد مع تيتي انه سا الليزر.
  2. صورة الأنسجة المختلفة باستخدام HCX IRAPO-L-25X / 0.95 NA الهدف غمس المياه (WD = 2.5 ملم)، وعلى PLAPO HC-CS 20X / 0.70 NA الهدف الجاف (WD = 0.6 ملم)، أو HC-PL-40X IRAPO /1.1 NA الهدف الغمر بالماء (WD = 0.6 ملم).
  3. الحصول متحد البؤر مضان أطياف جمع أكوام امدا (xyλ) من الضوء المنبعث في 5 نانومتر عرض الموجات من الطيف المرئي من خلايا BM transduced مع واحد FP يغو ناقلات فضلا عن السيطرة، وليس زرع-BM.
    1. صور عملية مع البرنامج v2.4.1 لايكا LAS-AF لخلق أطياف مرجعية من كل 5 ضباط، فضلا عن تألق ذاتي (الشكل 2A). باستخدام الأطياف FP الفردي والفرق في السطوع مضان (معبرا عنها كنسبة مئوية من EGFP) من فندق Cerulean (79٪)، والزهرة (156٪)، tdTomato (283٪) وmCherry (47٪) ضبط 5 قنوات التصوير متتابعة كما يلي: فندق Cerulean (458 / 468-482 نانومتر)، EGFP (488 / 496-514 نانومتر)، والزهرة (514 / 523-558 نانومتر)، tdTomato (561 / 579-597 نانومتر)، وmCherry (594 / 618-670 نانومتر) ( الشكل 2B).
    2. التحقق من صحة دقيق الفصل إطارا في الثانية، وخلايا transduced مع كل فرد FP مرئية فقط في القناة المقابلة وغائبة عن بقية (الشكل 2C). وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النهج المحددة متعدد القنوات يخلق فريدة 5 قنوات "colorprint" التي تمكن من تحليل اللون اللاحق وتتبع النسيلي وله ميزة خفض أوقات الاستحواذ مقارنة التصوير الطيفي.
  4. الانبعاثات مضان منفصل، في وضع 2 الفوتون، من خلال الكفاءة العالية المرايا مزدوج اللون مخصصة وجمع مع أربع قنوات غير descanned كاشف (NDD) على النحو التالي: مرآة مزدوج اللون في 568 نانومتر تليها مرآة مزدوج اللون في 465 نانومتر، تلتها و452/45 نانومتر تصفية الانبعاثات لمجموعات المساعدة الذاتية أو تألق ذاتي وفندق Cerulean، مرشح 525/40 نانومتر الانبعاثات لEGFP أو فينوس، و648 نانومتر مزدوج اللون المرآة و620/60 نانومتر تصفية الانبعاثات لtdTomato أو mCherry.
    1. تكشف المعلومات الهيكلية من قبل اثنين من الفوتون المجهري طالتصوير النقيض ntrinsic (كما هو موضح أعلاه) من تألق ذاتي الأنسجة من الإيلاستين، NADH، (متحمس في 780 نانومتر)، والثاني إنشاء إشارة التوافقي (SHG) من العظام والكولاجين لييفي (متحمس في 920 نانومتر أو 860 نانومتر التي تم جمعها في مبعثرة العودة الاتجاه) 10،11.
  5. لتقديم 3D حجم، سلسلة من الصور XYZ (عادة 1 × 1 × 4 ميكرون حجم فوكسل 3) جمع على طول محور ض في 5 ميكرون فترات خلال مجموعة من الأعماق (150-300 ميكرون) في جميع أنحاء نخاع العظام والأنسجة الأخرى، على مناطق واسعة باستخدام وظيفة البلاط من البرنامج لتوليد كميات مخيط تتألف من الحفرة بأكملها القص، ما يقرب من 2.5 × 1.2 مم 2 (س ص) و 300 ميكرومتر (ض) (أرقام 2D-2E) وفيلم 1 تلقائيا.
    1. صورة قبي النخاعية مباشرة من خلال الجمجمة دون باجتزاء 2، 8.
    2. قسم القص على طول المستوى السهمي (التنصيف) ثمعرضيا في المفصل بين 2 القصية الخندق والصورة من خلال خفض الوجه 3،4،12 (لمحة عامة في الشكل 1B مقتبس من ياكاكا وآخرون 3).
  6. ل4D الوقت الفاصل بين التصوير، ومكان رفعه حديثا المأبضية العقدة الليمفاوية والطحال والرئة، أو عينات العظام قبي مختصر على 35 ملم الأطباق ثقافة الرقم 0 ساترة، في 50-100 ميكرولتر DMEM، و 10٪ FBS تحتوي على 20 ملي HEPES في 37 ° C واستخدام 2 الفوتون تي سا الإثارة (860 نانومتر) جنبا إلى جنب مع الإثارة مبائر (458 نانومتر، 488 نانومتر، 514 نانومتر، 561 نانومتر، 594 نانومتر) والماسح الضوئي لايكا الرنانة (8000 هرتز / ثانية)، مع ض مداخن (~ 80 ميكرون) في 20 ثانية فترات لمدة تصل إلى 1 ساعة.
    1. لفي وقت واحد ثلاثة ألوان استخدام التصوير 2P تي سا ضبطها في 860 نانومتر في وقت واحد مع ليزر OPO (ضبطها في 1،130 نانومتر لtdTomato، أو 1،140 نانومتر mCherry) (فيلم 2).
  7. إعادة الإعمار وتحليل وحدات التخزين 3D و 4D متواليات الوقت
    1. استخدام Imaris إلى x64 تحديثات برامج المزودالبيانات هي الخلايا الفلورسنت داخل نخاع العظام والأنسجة المختلفة وتصديرها كما أفلام 3D-تناوب النسخة 7.6، أو حزم البرامج البديلة لتحويل أكوام المغطى من الصور الخام حيز حجم المقدمة (3D)، كما هو موضح سابقا 3،4 (فيلم 1) خطوة بخطوة سبيل المثال:
      1. في Imaris، افتح الصورة ض المكدس. حدد "تفوق" من أجل عرض حجم التصور 3D.
      2. استخدام "تنقل" لتحويل الصوت لنحو 360 درجة.
      3. حدد "الرسوم المتحركة" لخلق الرسوم المتحركة. استخدام الأطر الرئيسية لإضافة وجهات محددة، والتكبير، والتناوب من الحجم؛ معاينة الفيلم، تحرير الضرورة وحفظ الملف في شكل فيلم المطلوب (مثلا: AVI، MOV).
    2. عن التقييم الكمي للخلية واستنساخ تردد 3D، مواقف والأحجام والتوزيع، المزيد من عملية ض المداخن باستخدام وحدات Imaris XT التي تدمج تطبيقات MATLAB أداء الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المسافةurements (باستخدام خوارزمية تحول بعد) ومجموعات التحليل، كما هو موضح سابقا 3،4. تحويل سلاسل من مداخن صورة مع مرور الوقت إلى أربع الأبعاد (4D) الأفلام المقدمة مع حجم Imaris البرمجيات إلى x64، واستخدام بقعة وتحليل السطح لتتبع semiautomated من حركية خلية في ثلاثة أبعاد باستخدام خوارزميات الحركة الانحدار الذاتي.
    3. إجراء تحليل متعدد الأطياف من الخلايا كما يلي: استخراج متعددة الألوان البقع المسمى بإضافة جميع القنوات من 5 إلى قناة الحساب من Imaris XT إلى قناة جديدة؛ تحديد لجميع البقع (خلايا) كثافة مضان يعني في كل من قنوات مكون 5. تصدير القيم في برنامج إكسل لرسم الرسوم البيانية عرض "colorprint" فريدة أي٪ النسبية لكل FP في الخلية الفردية (الشكل 2E الرسم البياني). تصحيح البيانات المحددة للالانجراف الأنسجة، وحساب سرعة الخلية والتشريد على مر الزمن، طول المسار، والمسارات، والمسافات. قيمة الصادرات في Excel البرمجtware لرسم الرسوم البيانية. تجميع الأرقام المركبة مع أدوبي فوتوشوب CSS 5 البرمجيات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وكشف كامل جبل 3D متحد البؤر / 2 الفوتون المجهري إعادة البناء من نخاع العظام دوام القصية وengraftment والتوسع في زرع المشارك 5FPS في نمط ذات الخصائص الرائعة: استنساخ بدا محددة بوضوح، وتميز متجانس مع لوحة واسعة من الألوان في البداية والتقدم على مر الزمن لاحتواء تفضيلي خلايا الغالب لون واحد. موضحة متحد البؤر المجهر الإعداد والأمثلة النموذجية على بعلامات 5FPS التصوير HSPC في نخاع العظم القصي في الشكل 2 و أفلام 1 و 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصفنا هنا تفاصيل منهجية قوية وضعت مؤخرا لتتبع خلية نسيلي، والجمع بين التنوع الكبير التي تولدها بمناسبة اندماجي مع ترميز 5FP ناقلات ليغو والتصوير مع متحد البؤر جنبا إلى جنب و 2 الفوتون المجهري لتحقيق الحجمي والتصوير الديناميكي في الأنسجة الحية. هذا مدد استخدام الألوان استنادا FP علامات الهوية عن طريق تسجيل متحد البؤر الطيفية في 5 "متميزة" قنوات 8 بت. وبالتالي فإن نسبة النسبية للفندق Cerulean، EGFP، الزهرة، tdTomato، mCherry داخل كل خلية يخلق "colorprint" فريدة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة. نشكر بوريس فيس (المركز الطبي الجامعي هامبورغ-إيبندورف ، هامبورغ ، ألمانيا) على توفير البلازميدات الخمسة الناقلة LeGO ؛ كريستيان أ. كومبس ونيل إس يونغ (NHLBI ، المعاهد الوطنية للصحة) للمناقشات والدعم والتشجيع طوال هذه الدراسة ، وأندريه لاروشيل (NHLBI ، المعاهد الوطنية للصحة) للمساعدة في حقن وريد الذيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكالسيوم mCherry طبق زراعة الأنسجة أغطية برنامج
<قوي>إنتاج الفيروسات< / strong>
LeGO-Cer2Addgene27338التعبير عن Cerulean
LeGO-G2Addgene25917التعبير عن eGFP
LeGO-V2Addgene27340التعبير عن Venus
LeGO-T2Addgene27342التعبير عن tdTomato
LeGO-C2Addgene27339التعبير عن
مجموعة تعداء فوسفاتSigmaCAPHOS-1KT
BD Falcon353003
IMDMGibco ، Life Technology12440-053
مصل الأبقار الجنيني المعطل الحرارةSigmaF4135-500ML
القلم Strep GlutamineGibco ، Life التكنولوجيا10378-016
أنابيب الطرد المركزيبيكمان كولتر326823
SW28 أجهزة الطرد المركزيالفائقة بيكمان كولترL60
ميليكس حقنة مدفوعة بالفلتر المتحدة (0.22 & micro; م)MilliporeSLGS033SS
< قوي > جمع خلايا الفأر ، والتنقية ، والتنبيغ ، والزرع < / قوي >
ACK عازلة للتحللQuality Biologicals Inc.118-156-101
طقم استنفاد خلايا النسب (الماوس)Miltenyi Biotec Inc. الولايات المتحدة الأمريكية130-090-858
أعمدة LS + أنابيبMiltenyi Biotec Inc. الولايات المتحدة الأمريكية130-041-306
مرشحات ما قبل الفصل (30 & micro; م)Miltenyi Biotec Inc. الولايات المتحدة الأمريكية130-041-407
StemSpan SFEM وسيط خال من المصل لزراعة وتوسيع الخلايا المكونة للدم (500 مل)StemCell Technologies Inc 9650
الفئران IL-11 CFR & شركة D SystemsInc 418-ML-025 / CF100 & micro ؛ جم / مل هو 1,000x
المؤتلف الفئران SCFRDI قسم Fitzgerald Industries Intl RDI-2503100 ومايكرو ؛ جم / مل هو 2,000x
الفئران المؤتلف IL-3R & شركة D SystemsInc 403-ML-05020 & micro; جم / مل هو 2,000x
FLT-3 LigandMiltenyi Biotec Inc. الولايات المتحدة الأمريكية130-096-480100 & micro ؛ جم / مل هو 1,000 ×
12 بئر من الأطباق ، CostarCorning Inc.3527
RetronectinTakara Bio IncT100A / BRepense عند 50 & micro; جم / مل
كبريتات البروتامينسيجماP-40204 & مايكرو ؛ جم / مل هو 1،000x
<قوي> متحد البؤر وثنائي الفوتون المجهر< / قوي>
DMEMLonza12-614F
1 M HepesCellgro ، Mediatech Inc.25-060-CI
طبق ثقافة القاع الزجاجي P35G-0-20-CMatTek CorporationP35G-0-20-C
طبق ثقافة القاع الزجاجي P35G-0-14-CMatTek CorporationP35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass # 1 غطاء البورسليكات ؛ 4 آبار155383علمية حرارية
22 مم رقم 2توماس سيانتيفيك6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS خمس قنوات مجهر متحد البؤر ومتعدد الفوتونLeica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph نطاق الليزر 680-1،080 نانومترمتماسكة
حرباء مدمجة نطاق ليزر OPO 1،030-1،350 نانومترمتماسك
HCX-IRAPO-L 25X / 0.95 NA هدف غمس الماء (WD = 2.5 مم)Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA الهدف الجاف (WD = 0.6 مم)Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA هدف الغمر في الماء (WD = 0.6 مم)Leica Microsystems
Imaris الإصدار 7.6Bitplane

المراجع

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
  6. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
  7. Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
  8. Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
  9. Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
  10. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
  11. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
  12. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

This was corrected in the discussion from:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

to:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

الوسوم

lentiviral
في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.