مقالة منهجية

التركيز تشكيل: A الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين

DOI:

10.3791/51742

⸱

ديسمبر 31, 2014

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر الفحص التركيز تشكيل طريقة واضحة لتقييم إمكانات تحويل من الجين الورمي مرشح.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
عادة ما يرتبط التحول الخبيث للخلايا

بزيادة التكاثر ، وفقدان تثبيط الاتصال ، واكتساب إمكانات النمو المستقلة عن المرسى ، والقدرة على تكوين أورام فيالتجارب 1. في خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 ، من المعروف أن مسار نقل إشارة Ras يؤدي إلى العديد من هذه الأحداث ، وهو ما يعرف باسم تحويل Ras. قد يؤدي إدخال جين مفرط التعبير في خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 إلى تعزيز التحول المورفولوجي وفقدان تثبيط الاتصال ، مما قد يساعد في تحديد إمكانات الأورام لهذا الجين ذي الأهمية. الاختبار الذي يوفر طريقة مباشرة لتقييم جانب واحد من إمكانات التحويل للجين الورمي هو مقايسة تكوين التركيز (FFA) 2. عندما تنقسم خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 بشكل طبيعي في الثقافة ، فإنها تفعل ذلك حتى تصل إلى طبقة أحادية التقاء. ومع ذلك ، في وجود جين ورمي مفرط التعبير عنه ، يمكن أن تبدأ هذه الخلايا في النمو في بؤر1 كثيفة متعددة الطبقات يمكن تصورها وقياسها كميا عن طريق تلطيخ البنفسجي البلوري أو Hema 3. في هذه المقالة نصف بروتوكول FFA مع نقل الفيروسات القهقرية للجين محل الاهتمام إلى خلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 ، وكيفية تحديد عدد البؤر من خلال التلوين. يوفر نقل الفيروسات القهقرية طريقة أكثر كفاءة لتوصيل الجينات من التعدي ، ويوفر استخدام الفيروس القهقري للفئران الصديق للبيئة تحكما في السلامة البيولوجية عند العمل مع الجينات المسرطنة البشرية المحتملة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا السرطانية يمكن تمييزها عن نظيراتها العادية من قبل مجموعة واسعة من التعديلات، من أنماط التعبير الجيني لepigenomics إلى تغيرات شكلية والتكاثري. ومن بين هذه الأخيرة، وخفض الاعتماد على المصل، وفقدان الاتصال (الكثافة) تثبيط، واقتناء الانتشار مرسى مستقل، وفي نهاية المطاف، القدرة على تكوين الأورام عند حقنه في الحيوانات، مؤشرات قابلة للقياس مفيدة التحول الخبيث 3. عدة في المختبر والمقايسات فيفو تم وضعها من أجل التحول الخلوي. في المختبر فحوصات تهدف إلى تحديد وقياس التغيرات في التشكل الثقافة (التركيز تشكيل فحص)، وديناميات الثقافة (معدل النمو والكثافة التشبع)، وعامل النمو (النمو في انخفاض المصل) أو مرسى (النمو في أجار لينة) المتطلبات. لا يزال المعيار الذهبي لتحديد طبيعة الخبيثة من نوع الخلية تشكيل الورم (xenografts) في حيوانات التجارب. ومع ذلك، رانه يكلف وطول من الدراسات في الجسم الحي لا تجعل لهم دائما مبررا كخطوة أولى التحقق من صحة أو فحص الجينات المسرطنة مرشح. على الرغم من عدم الفحص في المختبر يوفر تقييم واضح للإمكانات أنكجنيك من الجين، فإنها توفر نظرة ثاقبة إمكانات أنكجنيك التي قد تضييق المستقبل في الدراسات المجراة. واحد من أكثر الأنظمة المستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانات أنكجنيك في المختبر هو التركيز تشكيل الفحص 2. ويعتمد هذا الأسلوب على استخدام NIH 3T3 الخلايا الليفية الماوس، خط خلية غير حولت الذي يظهر تثبيط اتصال قوية. overexpression من على النتائج الجين الورمي في فقدان النمو التي تعتمد على كثافة. الخلايا تحولت يمكن بعد ذلك تنمو في طبقات متعددة، وتشكيل "بؤر"، تصور بسهولة ضد أحادي الطبقة الخلفية للخلايا غير متحول. تشكيل التركيز الفحص، ثم، يقيس قدرة الجين الورمي مرشح للحث على التحول الخبيث، كما يتضح من فقدان الاتصال inhibition باعتباره النمط الظاهري للقياس. وقد استخدم FFA لتقييم التحول من overexpression من تحركات البروتينات (على سبيل المثال، SRC 4، BRAF 5)، عوامل النسخ (على سبيل المثال، N-MYC 6) مستقبلات، إلى جانب G-البروتين (على سبيل المثال، P2RY8 7) وGTPases (على سبيل المثال ورأس 1)، وغيرها. السهولة النسبية لهذا الاختبار يجعلها خيارا جيدا من شأنها أن توفر إجابة واضحة وسريعة بصريا ما إذا كان overexpression من الجينات يكفي لتحويل NIH 3T3 خلايا فأر الليفية في المختبر.

وFFA الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم بلات-E خط الخلية التعبئة والتغليف 8، والذي يوفر البروتينات الفيروسية التعبئة والتغليف، وفيروسات ناقلات pBABEpuro 9 (Addgene بلازميد 1764) لإنتاج الفيروس الارتجاعي. بعد ترنسفكأيشن مع بناء pBABEpuro التي تحتوي على الجينات في المصالح، فإن خط الخلية بلات-E تنتج الارتجاعي ecotropic التي يمكن استخدامها لتصيب خلايا NIH 3T3. تيطريقة الفيروسي له من توصيل الجينات هو أكثر فعالية من الأساليب ترنسفكأيشن الكيميائية التقليدية، وأنه يوفر وسيلة للتعبير عن هذا الجين على نحو مستدام 10. مرة واحدة دمجها في جينوم الخلايا NIH 3T3، والدافع overexpression من هذا الجين من الفائدة من جانب يكرر محطة الطويلة الفيروسية (LTR) المروج 11. ويمكن استخدام هذا التعبير المستمر لتحديد ما إذا كانت الجينات في المصالح والنشاط أنكجنيك، مقاسا تشكيل بؤر، على خلايا NIH 3T3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جعل النواقل الفيروسية

تسلسل الترميز لهذا الجين من الفائدة، فضلا عن الضوابط الإيجابية والسلبية، تندس في pBABEpuro بالطرق التقليدية الاستنساخ (PCR التضخيم، والهضم تقييد وربط). هناك أربعة مواقع قيود على ناقلات حيث يمكن إدخال DNA: إنزيم BamHI، SnaBI، EcoRI وسالي.

  1. إعداد ترنسفكأيشن الصف بلازميد DNA من خلايا المختصة باستخدام QIAGEN بلازميد ميدي عدة.
  2. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام معمل NanoDrop2000.

2. الارتجاعي الإنتاج

سيتم استخدام خط الخلية التعبئة والتغليف بلات-E لإنتاج الفيروس الارتجاعي ecotropic التي سيلقي [كدنا] التي تهم خلايا NIH 3T3.

  1. إنشاء الثقافات بلات-E من خلايا مجمدة
    1. ذوبان الجليد بسرعة خلايا بلات-E في 37 ° C حمام الماء ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة ببطء 9 مل من بلات-E المتوسطة (دوlbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) + البنسلين والستربتوميسين).
    2. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
    3. اعادة تعليق الخلايا مع 10 مل من بلات-E متوسطة ونقل إلى صحن ثقافة 10 سم.
    4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة حتى تكون 80-90٪ متموجة (حوالي 2 أيام).
  2. تقسيم الخلايا
    1. نضح المتوسطة ويغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة 2 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA واحتضان لمدة 1 دقيقة في RT.
    3. فصل الخلايا عن طريق الإصبع والتنصت، وإضافة 10 مل من بلات-E المتوسطة، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
    4. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
    5. resuspend الخلايا مع 10 مل من بلات-E المتوسطة والبذور منها في أطباق جديدة في 1: 4-1: 6 التخفيفات.
  3. بلات-E البذر وترنسفكأيشن
    1. البذور 2 × 10 6خلايا لكل 10 سم صحن الثقافة باستخدام بلات-E وسيط وبدون أي المضادات الحيوية.
    2. احتضان الخلايا O / N في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. اليوم التالي، ونقل 300 ميكرولتر من غروب-MEM إلى 1.5 مل microfuge أنبوب.
    4. إضافة 27 ميكرولتر من polyethylenimine (PEI)، وكاشف ترنسفكأيشن فعالة من حيث التكلفة 12، إلى أنبوب استعداد مع غروب-MEM. المزيج بلطف بواسطة الإصبع التنصت واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
    5. إضافة 9 ميكروغرام من DNA البلازميد ترنسفكأيشن الصف في أنبوب غروب-MEM / PEI، مزيج من قبل vortexing بلطف، واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
    6. إضافة DNA / PEI قطرة من الحكمة معقدة في طبق بلات-E، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
    7. اليوم التالي، نضح في المتوسط ​​تحتوي على كاشف ترنسفكأيشن وإضافة 10 مل من جديد بلات-E متوسطة (بدون المضادات الحيوية).
    8. عودة إلى الخلايا الحاضنة.

3. خلايا NIH 3T3 والعدوى

  1. إنشاء المعاهد الوطنية للصحة3T3 الثقافات والبذر
    1. ذوبان الجليد بسرعة خلايا NIH 3T3 في 37 ° C حمام الماء ونقل إلى أنبوب 15 مل. إضافة ببطء 9 مل من NIH 3T3 المتوسطة (DMEM + 10٪ FBS).
    2. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
    3. resuspend الخلايا مع 10 مل من NIH 3T3 المتوسطة ونقل إلى صحن ثقافة 10 سم.
    4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة. من المهم جدا أن الخلايا NIH 3T3 يتم الاحتفاظ دائما underconfluent (50-60٪)، كما تردد التحول التلقائي (وبالتالي مستويات القاعدية من تشكيل بؤر) يزيد مرة واحدة تصل إلى ثقافة confluency.
    5. البذور 3 × 10 5 خلايا لكل 10 سم طبق واحتضان O / N للعدوى في اليوم التالي.
  2. عدوى
    1. حصاد طاف فيروسات من الطبق بلات-E باستخدام 10 مل حقنة واحدة، وتصفية عليه من خلال 0.45 ميكرون حجم المسام النايلون مرشح غشاء، وتحويلها إلى 15 ملأنبوب.
    2. إضافة 10 مل من جديد بلات-E المتوسطة للخلايا (بدون المضادات الحيوية)، وإعادتها إلى الحاضنة.
    3. نضح المتوسطة من الطبق خلية NIH 3T3 للإصابة، وإضافة 5 مل من العادية المتوسطة NIH 3T3 و 5 مل من التي تحتوي على فيروس تصفيتها طاف.
    4. إضافة polybrene إلى الطبق بتركيز 6 ميكروغرام / مل.
    5. احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
    6. اليوم التالي، كرر الخطوات من 3.2.1 - 3.2.5 لجولة ثانية من العدوى.
    7. استبدال المتوسطة التي تحتوي على الفيروس مع منتظم المتوسطة NIH 3T3.
    8. السماح للخلايا NIH 3T3 لتنمو لمدة 2-3 أسابيع، لتحل محل المتوسطة حسب الضرورة. تحقق من التعبير عن بروتين الاهتمام من جانب التقليدي الكهربائي البروتين وطخة مناعية على لست] خلية كاملة من لوحات طبق الأصل.

4. تلطيخ والكمي

  1. الكريستال البنفسجي تلطيخ
    1. نضح المتوسطة NIH 3T3 ووضع الأطباقعلى الجليد.
    2. غسل الأطباق مرتين مع PBS الجليد الباردة.
    3. إصلاح الخلايا مع الميثانول الجليد الباردة لمدة 10 دقيقة.
    4. إزالة أطباق من الجليد، ونضح الميثانول، وإضافة 3 مل من 0.5٪ محلول الكريستال البنفسجي المحرز في 25٪ الميثانول (RT).
    5. احتضان الأطباق لمدة 5 دقائق على RT.
    6. نضح الحل الكريستال البنفسجي وشطف بعناية الطبق مع ميلي-Q H 2 O حتى يأتي لا لون ثماره في الشطف.
    7. السماح للأطباق لتجف O / N على الفوق (كشف).
  2. بؤر الكمي
    1. مرة واحدة الأطباق جافة، استخدام مسطرة لقياس مجموعات الملونة على نحو مظلم من الخلايا على طبق من ذهب. الاعتماد فقط تلك التي هي أكبر من 5 ملم في القطر بأنها "بؤر". سجل عدد من البؤر وحساب المتوسطات وأهمية مقارنة مع الضوابط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MXD3 هو عامل النسخ الأساسي سحاب الحلزون حلقة حلزون ليسين (bHLHZ) الذي هو عضو من MYC / MAX / شبكة MAD. وهي عضو غير نمطية للأسرة MAD 13-15، وأفيد أن تشارك في التسرطن 16،17. بالمقارنة مع pBABEpuro (المراقبة السلبية) وMYC (مراقبة إيجابية)، كانت أطباق NIH 3T3 حيث تم overexpressed MXD3 أقل بكثير البؤر (الشكل 1A). وقد تم جمع البيانات في الشكل 1B من تجارب متعددة لتحديد أهمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر FFA طريقة سريعة وسهلة لتقييم التحول الخبيث في المختبر. فمن قابلة للفحص عدد كبير نسبيا من الجينات المرشحة، والمتطلبات التقنية المتواضعة جعلها فعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، اثنين أو أكثر من الجينات يمكن coexpressed (يشار إليها أحيانا باسم "التعاون" فحص) لتقييم إمكانات مكون للأورام الدمج. مزايا هذا الاختبار تعتمد على تقنية لها مباشرة، وسهولة القياس الكمي والقصير نسبيا بدوره حول الوقت. ويجب التأكيد على ذلك، ومع ذلك، أنه لا تشكل القيود المفروضة على جميع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من خلال منحة من جديد مبتكر برنامج جائزة مدير المعاهد الوطنية للصحة في (ED). وأيد AA في جزء من الجوائز البكالوريوس من المعهد الوطني للسرطان ومؤسسة العلوم الوطنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
pBABE-puro vectorAddgenePlasmid 1764ناقلات الاستنساخ
Platinum-E خط خلايا التعبئة والتغليف الفيروسي القهقر ، EcotropicCell Biolabs، Inc.RV-101للإنتاج الفيروسي
NIH 3T3 Cell Line الفئرانSigma-Aldrich93061524خط الخلية لفحص تكوين التركيز
10 مل BD Luer-Lok طرف حقنةBD Biosciences309604كاشف الإنتاج الفيروسي
0.45 & mu ؛ م Puradisc حقنة مرشحWhatman6750-2504كاشف الإنتاج الفيروسي
Polyethylenimine (PEI)Polysciences، Inc.23966-2كاشف تعداء الخلية
عدوى البوليبرين / كاشف التعداءEMD MilliporeTR-1003-Gكاشف تعداء الخلية
كريستال البنفسجيفيشر العلميC581-25كاشف وصمة عار الخلية
بلازميد بلس ميدي كيتQIAGEN12945تنقية البلازميد
أطباق زراعة الأنسجة الصقرBiosciences353003مستلزمات زراعة الخلايا
النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)Gibco11995-065وسائط زراعة الخلايا
0.05٪ Trypsin-EDTAGibco25300-054مستلزمات زراعة الخلايا
Opti-MEM I مصل مخفض متوسطGibco31985-062وسائط زراعة الخلايا
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Gibco16000-044وسائط زراعة الخلايا
خط خلية BD وسط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
  2. Celis, J. E. Cell biology : a laboratory handbook. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).
  3. Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
  4. Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
  5. Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
  7. Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
  8. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
  9. Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  11. Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
  12. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
  13. Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
  14. Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
  15. Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
  16. Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
  17. Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508(2012).
  18. Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NIH 3T3 Pla E

مقالات ذات صلة