Method Article

حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات

DOI:

10.3791/51762

⸱

October 17th, 2014

 , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا طريقة بسيطة وسريعة لتوصيف الخصائص اللاصقة الجوهرية لجزيئات التصاق الخلية المفترضة. يتم التقاط المجال الخارجي المفرز الذي يحمل علامة حاتمة لجزيء التصاق الخلية من وسط الاستزراع على حبات وظيفية صغيرة موحدة. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الخرزات على الفور في فحوصات تجميع الخرزات البسيطة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصاق خلية خلية هو الأساسي في الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من بروتينات سطح الخلية. ومع ذلك، يتم مفهومة التفاعلات لاصقة لكثير من هذه البروتينات. هنا نقدم طريقة بسيطة وسريعة لوصف خصائص لاصقة من المفترضة مقتصر على المطابق جزيئات التصاق الخلية. و transfected خلايا HEK293 مثقف مع بلازميد الحمض النووي ترميز يفرز،، حاتمة الموسومة ectodomain من بروتين سطح الخلية. باستخدام الخرز بين functionalized محددة للعلامة حاتمة، يتم التقاط القابلة للذوبان، انصهار بروتين يفرز من مستنبت. ويمكن بعد ذلك حبات المغلفة استخدامها مباشرة في حبة المقايسات التجميع أو في حبة الفلورسنت فرز فحوصات لاختبار التصاق مقتصر على المطابق. إذا رغبت، الطفرات يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتوضيح الأحماض الأمينية المحددة أو المجالات المطلوبة للالتصاق. هذا الاختبار يتطلب سوى كميات صغيرة من البروتين المعبر عنها، لا يتطلب إنتاج خطوط الخلايا مستقرة، ويمكن عكاmplished في 4 أيام.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصاق خلية خلية ضروري لتطوير وسلامة الكائنات متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من جزيئات سطح الخلية. وقد تم تحديد العديد من هذه جزيئات الالتصاق ويتميز، رغم أن الكثيرين لا يزال يتعين اكتشافها. وتستخدم عدة طرق لتحقيق خصائص خلية التصاق جزيئات (الحدب)، بما في ذلك الخلايا فرز فحوصات، فحوصات تجميع خلية 1-8 والأساليب الفيزيائية الحيوية، مثل مجهر القوة الذرية والسطحية قوة التحليل الطيفي 9-12.

تعقيد حتى مبسطة في أنظمة المختبر باستخدام خطوط الخلايا يجعل من الصعب تحديد خصائص لاصقة من المفترض CAM. عادة، يعتبر جزيء وCAM إذا كان يدفع تجميع الخلايا عندما transfected في خط خلية غير لاصقة. ومع ذلك، فمن الواضح أن هذا ليس دليل مباشر على النشاط اصقة. على سبيل المثال، وتسهيل إيصال سطح الخلية أو استقرارسوف CAM يؤدي أيضا إلى زيادة تجميع خلية 1،13. وعلاوة على ذلك، قد تفشل CAM صحيح للتوسط تجميع خلية إذا كان خط الخلية تفتقر العوامل المشتركة الأخرى المطلوبة للتسليم سطح الخلية أو الاستقرار.

لتجنب هذه العوامل المعقدة، والمزيد من المقايسات المباشرة يمكن استخدامها التي تستند على فكرة أن التفاعلات لاصقة يجب أن تكون خاصية البيوكيميائية الجوهرية المجال خارج الخلية. بينما الخرز المستخدمة في البداية لوصف NG-CAM 2، وقد تم تمديد هذه المقايسات من أجل التحقيق بوساطة كادهيرين التصاق 12،14،15. باستخدام الانصهار من C-كادهيرين اندماج ectodomain-FC، أظهر مختبر Gumbiner أن يكرر كادهيرين متعددة تساهم في التفاعلات مقتصر على المطابق 14. عن طريق مقارنة المقايسات حبة التجميع، E-كادهيرين وN-كادهيرين التصاق كما تم يتميز 12،15، وكذلك عدد من protocadherins 1،15-18 والإسوية Dscam من ذبابة الفاكهة 19. نحن هنا وصف مقايسة بسيطة نسبيا وسريع لوصف النشاط لاصقة من يفرز، ectodomains الموسومة حاتمة من الحدب مقتصر على المطابق المفترضة (الشكل 1). وقد استخدمنا هذا الاختبار في المقام الأول إلى تميز أعضاء الفصيلة كادهيرين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية إعداد (اليوم -2 إلى 0)

  1. انقسام خلايا HEK293 1: 5 باستخدام 0.05٪ التربسين-EDTA الحل واحتضان وسائل الإعلام في النمو عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 حتى 60-80٪ متموجة (2 - 3 أيام). لكل حالة، وخلايا الثقافة في 2 × 100 ملم الأطباق.

2. ترنسفكأيشن الخلية (يوم 1)

  1. بالنقل خلايا HEK293 مع ترميز البلازميد FC-الانصهار باستخدام كاشف ترنسفكأيشن مثل Lipofectamine. كما يمكن استخدام طرق بديلة تؤدي إلى الكفاءة ترنسفكأيشن مماثلة.
  2. العودة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.

3. خلية الانتشار (اليوم 2)

  1. وسائط النمو سخن دون مصل بقري جنيني (-FBS) إلى 37 درجة مئوية.
  2. شطف الأطباق 2X مع 10 مل نمو وسائل الإعلام -FBS، والعودة الأطباق إلى الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. شطف الأطباق الثقافات واحد المزيد من الوقت مع 10 مل نمو وسائل الإعلام -FBS، أي ما مجموعه 3 يغسل.
  4. Incuباتي الخلايا HEK293 transfected عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أخرى دون FBS قبل جمع سائل الإعلام.

4. الخرزة تجميع (اليوم 4)

  1. لجمع وسائل الاعلام من الأطباق الثقافة، ونقل وسائل الاعلام من كل زوج من الأطباق إلى 50 مل أنابيب مخروطية وتدور في 500 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الحطام الخلوي.
  2. فلتر وسائل الاعلام من 50 مل أنبوب مخروطي إلى تصفية الطرد المركزي باستخدام حقنة 30 مل و 0.45 ميكرون فلتر حقنة.
  3. تدور مرشحات الطرد المركزي في 4000 x ج و 4 درجات مئوية حتى حجم سائل الإعلام والثقافة المركزة حوالي 500 ميكرولتر (حوالي 15 دقيقة). كرر حتى تمت إضافة كافة وسائل الإعلام والثقافة، وتتركز.
  4. إضافة 1.5 ميكرولتر من بروتين G حبات مغناطيسية إلى 1 مل من الجليد الباردة الاحتياطي ملزم في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لكل عينة، ومكان على المغناطيس وإزالة العازلة. على الفور إضافة وسائل الإعلام الثقافة المركزة للبروتين G حبات المغناطيسي.
  5. تدوير أنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  6. ررأنابيب الآس على المغناطيس وإزالة وسائل الإعلام. تغسل حبات بسرعة مرتين مع الجليد الباردة 1 مل الاحتياطي ملزم، وresuspend ثم الخرز في 300 ميكرولتر الاحتياطي ملزم.
  7. سبليت معلق حبات في 2 أنابيب، 150 ميكرولتر إلى كل أنبوب، ثم قم بإضافة 1.5 ميكرولتر من 200 مم CaCl 2 أو 200 ملي EDTA ل "الكالسيوم" والشروط "لا الكالسيوم"، على التوالي.
  8. نقل 100 ميكرولتر من كل حالة إلى الاكتئاب الشريحة بشكل جيد وجمع الميكروسكوب باستخدام مجهر الضوء المرسل (الشكل 2). جمع الصور من 5 حقول نظر لكل تجربة في كل نقطة زمنية المطلوب.

تحليل البيانات 5.

  1. باستخدام يماغيج، أو يعادل برنامج تحليل الصور، وفتح واحدة من مجموعات البيانات باستخدام صورة خمس استيراد / صورة تسلسل ... من القائمة المنسدلة ملف. سيتم فتح هذه باعتبارها كومة الصورة.
  2. في الصور / ... خصائص مربع الحوار، تغيير طوحدات بركه إلى بكسل ووضع العرض بكسل والارتفاع إلى 1.0 بكسل.
  3. تحويل الصور إلى ثنائي باستخدام ضبط / عتبة ... الأمر في القائمة المنسدلة صورة. تعيين عتبة لتشمل بكسل التي تساهم في حبة الخرز أو المجاميع، ولكن تستبعد الخلفية والجسيمات الصغيرة. تنطبق على جميع الصور في المكدس.
  4. في مربع الحوار القياسات مجموعة، حدد المربعات منطقة والمكدس الموقع.
  5. تشغيل تحليل الجسيمات ... في تحليل القائمة المنسدلة. هذا سوف إنشاء قائمة من الجسيمات التي تم تحديدها، بما في ذلك حجمها (منطقة) والصورة التي تم تحديدها.
  6. كرر هذه العملية التي تجربة وحالة تجريبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتقدم تجربة سبيل المثال في الشكل 2، مما يدل تعتمد على الكالسيوم حبة تجميع من قبل ectodomain من N-كادهيرين تنصهر لجنة التيسير (NcadEC-FC). في غياب الكالسيوم، والخرز تظهر نزعة ضئيلة أو معدومة لتجميع وليس هناك زيادة في الحجم الكلي مع الزمن (الشكل 1A، C). في وجود الكالسيوم، وحبات مغلفة مع عرض NcadEC-FC تجميع قوية، مع الحجم الكلي يتزايد مع مرور الوقت (الشكل 1B، C). وتكررت هذه التجربة ثلاث مرات، مع كل حالة تتكون من الصور من خمسة حقول غي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصاق الخلية هو سمة أساسية من سمات الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة واسعة من بروتينات سطح الخلية. من هذه، وفهم الخصائص التفصيلية لاصقة سوى نسبة صغيرة نسبيا. هنا، التي وصفناها بروتوكول بسيطة وسريعة للتحقيق في قدرة لاصقة مقتصر على المطابق من ectodomains يفرز تنصهر علامة حاتمة مريحة. هذا النهج لديه عدد من المزايا الهامة. أولا، وخطوط الخلايا مستقرة غير مطلوب 14،20، كما يمكن توليد كميات كافية من البروتين عن طريق ترنسفكأيشن عابرة من 100 ملم الأطباق. وهذا يسمح للفحص أعداد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة NSF / ARRA (IOS 0920357) وجائزة من المعاهد الوطنية للصحة (5R21MH098463).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
pFc-N1 البلازميدAddgene<قوي>سيتم تقديمه< / strong>< / span>
خلايامجموعة الثقافة من النوع الأمريكيCRL-1573
DMEMMediatech - Corning10-013-CV
مصل الأبقار الجنينية (FBS)SigmaF2442
100x Pen-Strep (10,000 U / ml)Technologies15140-122
0.05٪ Trypsin-EDTALife Technologies25300054
Lipofectamine 2000Life Technologies11668030
Dynabeads & ndash ؛ بروتين GLife Technologies10003D
مصل الأبقار الألبومينSigmaA3294
شرائح الاكتئابعلوم المجهر الإلكتروني71878-06
Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزي مع غشاء Ultracel-10MilliporeUFC901024
0.45 مم مرشح حقنةSarstedt83.1826
برنامج تحليل الصور Dynamag-2 MagnetLife Technologies12321D
Fiji (ImageJ) http://fiji.sc/Fiji< / a >
وسائطالنمو DMEM + 10٪ FBS + مرشح Pen-Strepتعقيم وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
وسائل الإعلام النمو – FBSDMEM + Pen-StrepFilter يعقيم ويخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
مخزن مؤقت ملزم50 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 7.4 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.2٪ BSAدوامة حتى يذوب ، استمر في الثلج.
HEK293 Life < td colspan = "4" > جدول المخازن المؤقتة / الحلول

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
  2. Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
  3. Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
  4. Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
  5. Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
  6. Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
  7. Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
  8. Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
  9. Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
  10. Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
  11. Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
  12. Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
  13. Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
  14. Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
  15. Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
  16. Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
  17. Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
  18. Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
  19. Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
  20. Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bead Aggregation AssayCell Adhesion MoleculesHEK293 CellsProtein G Magnetic BeadsHomophilic AdhesionCalcium Dependent AdhesionImage AnalysisTransmitted Light MicroscopyEpitope tagged EctodomainFunctionalized Beads

Related Articles