يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

هيدروجيل الجسيمات النانوية حصاد البلازما أو البول للكشف عن وفرة البروتينات منخفضة

13.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51789

⸱

أغسطس 7, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Center for Applied Proteomics and Molecular Medicine, George Mason University, 2Ceres Nanosciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

لا يمكن اكتشاف العديد من المؤشرات الحيوية المرضية بسهولة بواسطة التقنيات الحالية بسبب تركيزها المنخفض في السوائل البيولوجية ، ووجود الإنزيمات المهينة ، والكميات الكبيرة من البروتينات ذات الوزن الجزيئي المرتفع. يمكن لجزيئات الهيدروجيل النانوية الوظيفية كيميائيا حصاد البروتينات منخفضة الوفرة والحفاظ عليها وتركيزها مما يتيح اكتشاف المؤشرات الحيوية التي لم يكن من الممكن اكتشافها سابقا.

الملخص

اكتشاف العلامات البيولوجية رواية يلعب دورا حاسما في توفير أكثر حساسية ومحددة كشف المرض. للأسف كثير من المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة التي توجد في السوائل البيولوجية لا يمكن الكشف عنها بسهولة مع مطياف الكتلة أو المناعية لأنها موجودة في تركيز منخفض جدا، هي عطوب، وغالبا ما يخفيها وفرة البروتينات عالية مثل الألبومين أو المناعي. الطعم تحتوي على بولي (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) النانوية استنادا قادرة على التغلب على هذه الحواجز الفسيولوجية. في خطوة واحدة أنها قادرة على التقاط، والتركيز والحفاظ على المؤشرات الحيوية من سوائل الجسم. منخفضة الوزن الجزيئي التحاليل تدخل جوهر جسيمات متناهية الصغر وأسرت من قبل مختلف الأصباغ الكيميائية العضوية، والتي تكون بمثابة الطعم تقارب عالية البروتين. النانوية قادرة على تركيز البروتينات من الاهتمام من قبل عدة أوامر من حجمها. هذا العامل هو تركيز كاف لزيادة مستوى البروتين مثل أن البروتينات هي ضمنحد الكشف من الطيف الحالية الكتلة، النشاف الغربي، والمناعية. يمكن تحضين النانوية مع مجموعة كبيرة من السوائل البيولوجية وأنها قادرة على تخصيب كثيرا من تركيز البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي والببتيدات مع استبعاد الزلال وغيرها من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. تظهر بياناتنا أن 10،000 التضخيم أضعاف في تركيز الحليلة معين لا يمكن أن يتحقق، مما الطيفي والمناعية للكشف عن المؤشرات الحيوية لا يمكن الكشف عنها سابقا.

المقدمة

على الرغم من الانتهاء من تسلسل الجينوم البشري، لم يتم إحراز تقدم كبير في تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية المرض مرحلة مبكرة، أو التي ترتبط مع نتائج علاجية، أو التكهن 1. وأحد أسباب ذلك عدم إحراز تقدم هو أن العديد من المؤشرات الحيوية الهامة المحتملة توجد بتركيز أقل من حد الكشف عن مطياف الكتلة التقليدية وغيرها من منصات اكتشاف العلامات البيولوجية. مطياف الكتلة (MS) ومتعددة رصد رد الفعل (MRM) لديهم حساسية الكشف عادة أكبر من 50 نانوغرام / مل في حين أن الغالبية العظمى من التحاليل المناعية تقاس في سقوط المختبر السريري في نطاق بين 50 جزء من الغرام / مل و 10 نانوغرام / مل . وهذا يعني أن العديد من المؤشرات الحيوية، وخاصة في المرحلة المبكرة من المرض لا يمكن الكشف عنها بواسطة MS التقليدية وMRM 2. وبالإضافة إلى ذلك وجود وفرة عالية من البروتينات مثل الألبومين والغلوبولين المناعي في السوائل البيولوجية المعقدة غالبا ما تخفي من مليار أضعاف مريض بالحبوفاق سطيف منخفضة وفرة، منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات والببتيدات 3، 4، ولهذا السبب هناك حاجة العديد من الخطوات التحضيرية عينة قبل التسلسل الطيف الكتلي وتحديد الهوية. إحدى هذه خطوة تمهيدية توظف استنزاف البروتينات عالية فرة مع الأعمدة استنزاف المتاحة تجاريا 5-8. للأسف هذه الخطوة تؤدي إلى تخفيض العائد من المؤشرات الحيوية مرشح لأنها غالبا ما تكون مرتبطة تساهميا مع غير البروتينات الحاملة التي يتم إزالتها. ويمثل تحديا آخر من استقرار المؤشرات الحيوية مرشح فيفو السابقين مرة واحدة يتم جمع العينات. بروتينات قابلة للتحلل بواسطة البروتياز الذاتية أو الخارجية 9. يمكن النانوية هيدروجيل تجاوز هذه التحديات الحرجة عن طريق تضخيم تركيز العلامات البيولوجية المفترضة إلى مستوى ضمن نطاق الفحص، مع حماية البروتين من تدهور 10-13.

من المهم أن نلاحظ عشرفي LMW البروتينات في الدم هي مزيج من البروتينات سليمة الصغيرة وكذلك أجزاء كبيرة من البروتينات. البروتينات المشتقة من الأنسجة أكبر من 60 كيلو دالتون كبيرة جدا للدخول بشكل سلبي مجرى الدم من خلال الغشاء القاعدي الأوعية الدموية، ولكنها يمكن أن تمثل في الدم والببتيدات أو شظايا البروتين 14. هدفنا هو قياس المؤشرات الحيوية تعميم الرواية التي يمكن أن تكون مرشحة للكشف المبكر عن المرض، والطبقية المريض للعلاج، ومراقبة الاستجابة للعلاج. يتم إنشاء النانوية جهدنا لاستبعاد انتقائي المناعية وفرة عالية والزلال، في وقت واحد أثناء التقاط البروتينات والببتيدات الصغيرة والتركيز عليها ما يصل إلى 100 أضعاف اعتمادا على حجم انطلاق.

حددت مجموعتنا مجموعة من الأصباغ العضوية الصغيرة التي يمكن أن تعمل بنجاح تقارب عالية والطعوم الجزيئية للبروتينات والببتيدات. ويعتقد ملزم البروتين صبغ أن يكون نتيجة لمزيج من التفاعل مسعور وكهرباءق. الحلقات العطرية على صبغ تعشيق مع البروتينات عبر جيوب مسعور على سطح البروتين 11.

الطعوم، اعتمادا على الكيمياء، وتظهر تقارب معين لفئات مختارة من التحاليل. الطعوم تتنافس مع البروتينات الحاملة، مثل الزلال، على البروتينات أو الببتيدات. منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات / الببتيدات تصبح المحاصرين في الجسيمات. يتم منع البروتينات عالية الوزن الجزيئي مثل الألبومين والغلوبولين المناعي من دخول الجسيمات بسبب القدرة النخل بسبب المسام تقييدا ​​من هيدروجيل 11 (الشكل 1).

وقد تم تجميع الجسيمات النانوية هيدروجيل من قبل هطول البلمرة التي بدأها بيرسلفات الأمونيوم 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm)، يسمح شارك أحادية من حمض الاكريليك (AAC) وآليلامين (AA) وعبر رابط N، N'-Methylenebisacrylamide (BIS) للرد على 70 درجة مئوية لمدة 6 ساعة في ظروف المخففة 11، 13، وتقارب نسبة عالية من البروتين ملزمة من بولي (N-isopropylacrylamide-CO-حمض الاكريليك) (بولي (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis من خلال دمج تساهميا الأصباغ التي تحتوي على الأمينية (أي.، والأصباغ sulfonatedanthraquinonetriazine) في الجسيمات النانوية من خلال تحقيق رد فعل amidation أجريت في المذيبات المائية أو العضوية تبعا ل/ خصائص ماء مسعور من 11 الأصباغ، يستخدم 13. استبدال أليف النواة للمجموعات الأمينات في جسيمات متناهية الصغر مع ذرة كلور لصبغ anthraquinonetriazine لخلق بولي تحتوي على صبغة (NIPAm -co-آليلامين) (AA) النانوية 11، 12. يتم استغلال عملية البلمرة من خطوتين لخلق الجسيمات النانوية هيدروجيل تحتوي على الغلاف الخارجي من حمض vinylsulfonic (VSA) 11، 13.

النانوية هيدروجيل يمكن تطبيقها على السوائل البيولوجية المختلفة، بما في ذلك الدم الكامل، والبلازما، المصل، السائل النخاعي، والعرق، والبول. في خطوة واحدة، في الحل، نanoparticles إجراء سريع (في غضون دقائق) عزل وتركيز منخفض الوزن الجزيئي التحاليل 10، 11، 13، 15-18. ومزال البروتينات في وقت لاحق من الجسيمات النانوية والكشف باستخدام ويسترن النشاف 19-21، مطياف 10، 11، 13، 15، 18، 22 كتلة (23 عاما) المناعية / ELISA 10، 11، 15، 18، أو مرحلة عكس البروتين ميكروأري 16، 24 المقايسات. النانوية بين functionalized مع الطعم الكيميائية، وتقديم الأساسية أو الأساسية قذيفة الهندسة المعمارية، والتقاط وتركز البروتينات على أساس الخصائص الفيزيائية الطعم / شل. لذا سوف الأصباغ المختلفة دمجها في التقاط الجسيمات النانوية مجموعات فرعية مختلفة من البروتينات مع اختلاف الكفاءة على أساس تقارب صبغ، ودرجة الحموضة من الحل، وحضور / غياب المنافسة بروتينات عالية وفيرة 13. وعلاوة على ذلك، فإن كمية الجسيمات النانوية فيما يتعلق حجم الحل يؤثر على العائد البروتين من الجسيمات النانوية. هذه الجوانب منوأظهرت هيدروجيل حصاد جسيمات متناهية الصغر باستخدام ثلاثة جسيمات متناهية الصغر الطعوم المختلفة للبروتينات الحصاد من عينات البلازما التي تحتوي على كميات عالية من البروتين، وعينات من البول والتي عادة لا تحتوي على كميات كبيرة من البروتين. في هذا البروتوكول نظهر الحصاد والتركيز عامل نخر الورم ألفا (TNFα) من عينات البلازما باستخدام بولي (NIPAm-CO-AAC)، بولي (NIPAm / صبغ)، وقذيفة النانوية الحدقة (بولي (NIPAm-CO-VSA)) . وتظهر بولي (NIPAm / صبغ) الجسيمات النانوية للتركيز المستضد الأنواع المتفطرة التي تم إضافتها إلى عينات البول الإنسان، لتقليد السل المتفطرة الأفراد المصابين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تم جمع البلازما البشرية والبول من المانحين المتطوعين صحية، مع الموافقة المسبقة الخطية، بعد الموافقة عليها جامعة جورج ميسون مجلس المراجعة المؤسسية البروتوكولات. تم توزيع المانحين بالتساوي بين الذكور والإناث القوقاز الذين تتراوح أعمارهم بين 25 و 42. عينات تم تحليلها بشكل فردي، ولم تجميع.

1. جسيمات متناهية الصغر تجهيز المصل أو البلازما عينات

يتم التقاط المؤشرات الحيوية المحتملة وفيرة منخفضة في البلازما، في الحل، مع الجسيمات النانوية هيدروجيل. تضاف الجزيئات إلى البلازما، والمحتضنة، مفصولة الطرد المركزي، وغسلها، ومزال البروتينات القبض عليه. يتم تجفيفها البروتينات مزال تحت تدفق النيتروجين لالمصب الشامل تسلسل الطيف وتحديد الهوية.

  1. تمييع 500 ميكرولتر من المصل 1: 2 مع 50 ملي TrisHCl درجة الحموضة 7 (500 ميكرولتر مصل + 500 ميكرولتر TrisHCl) في أنبوب microcentrifuge.
  2. إضافة 500 ميكرولتر من بولي (NIPAm / AAC) nanop الأساسيةالمقالات. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  3. تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مجهزة الدوار زاوية ثابتة. إزالة وتجاهل طاف.
  4. إضافة 500 ميكرولتر ثيوسيانات الصوديوم (25 ملم) لبيليه. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات.
  5. تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة. إزالة وتجاهل طاف.
  6. إضافة 500 ميكرولتر من المياه MilliQ إلى بيليه جسيمات متناهية الصغر. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات.
  7. تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة. إزالة وتجاهل طاف.
  8. إعداد شطف العازلة الطازجة: إضافة 700 ميكرولتر أسيتونتريل إلى 300 هيدروكسيد الأمونيوم ميكرولتر في أنبوب نظيفة. الحذر: هيدروكسيد الأمونيوم غير قابلة للتآكل. مع استخدام التهوية المناسبة. ملاحظة: يجب أن يكون شطف العازلة الإعداديةعرب كورب فورا قبل الاستخدام. لا تقم بتخزين شطف العازلة.
  9. إضافة 300 ميكرولتر من شطف العازلة لبيليه جسيمات متناهية الصغر. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  10. تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة. إزالة وحفظ شطافة في نظيفة، وصفت أنبوب microcentrifuge.
  11. كرر الخطوات 1،9 حتي 1،10. الجمع بين اثنين الى واحد eluates أنبوب microcentrifuge.
  12. تجفيف eluates تحت تدفق النيتروجين في مشعب المبخر النيتروجين في 42.1 درجة مئوية، مع وضع تدفق الهواء إلى 8 (الشكل 2F).
  13. تخزين شطافة المجففة في RT لO / N التخزين، أو في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل، وذلك قبل مطياف الكتلة، النشاف الغربي، أو فحوصات ELISA (اختياري).

2. تصنيع جسيمات متناهية الصغر من عينات البول

يحتوي البول الطبيعي أقل من 30 ملغ / ديسيلتر البروتين وأقل من 1+ الدم. ومع ذلك، كثير من الأمراض / الأحكام قد يغير مستويات طبيعية من بروتين البول والدم. للمساعدة في تحديد حجم الأمثل للالنانوية إضافة إلى عينة البول، ويتم إجراء تحليل البول قبل الحصاد جسيمات متناهية الصغر. قد توجد البول المؤشرات الحيوية في تركيزات منخفضة للغاية، والتي قد تتطلب تحسين نسبة الجسيمات النانوية إلى حجم البول. يصف هذا الإجراء تجميع جسيمات متناهية الصغر من عينات البول لتحليل لطخة المصب الغربي.

  1. جمع عينات البول في نظيفة، كوب من البلاستيك الجاف. مطلوب 22 مل حجم الحد الأدنى. عينات البول المخزن في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للتحليل.
  2. ذوبان الجليد البول المجمدة في RT أو عند 4 درجة CO / N. مزيج لفترة وجيزة على خلاط دوامة. صب لا يقل عن 22 مل من البول إلى قاع مخروطي 50 مل أنبوب البولي بروبلين.
  3. تدور البول في جهاز للطرد المركزي مع الدوار سوينغ التدريجي في 3،700 x ج لمدة 15 دقيقة. صب البول، من دون إزعاج بيليه، إلى أسفل نظيفة polypr 50 مل المخروطيةأنبوب opylene. تجاهل بيليه.
  4. إجراء تحليل البول باستخدام متعددة الحليلة "البول مقياس" الشريط الكاشف. ملاحظة: تخزين أشرطة الكاشف في حاوية مغلقة بإحكام بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة والرطوبة 17 و 18.
    1. وضع الشريط الكاشف، وجها حتى، على نظيفة، منشفة ورقية جافة.
    2. استخدام ماصة المتاح لنضح 1 مل من البول أعدت في الخطوة 2.3.
    3. تحديد توقيت لمدة 2 دقيقة ولكن لا تشغيله. الاستغناء بسرعة 1 - 2 قطرات من البول في كل لوحة اختبار الشريط الكاشف. بدء فورا في الموقت. ملاحظة: لا يغرق قطاع كاشف مباشرة في الحاوية البول. المؤشرات صبغ / الكيميائية في قطاع كاشف يحتمل أن يتسرب من قطاع كاشف في وعاء البول.
    4. في الوقت المشار إليه على الحاوية الشريط الكاشف، تسجيل النتائج النوعية للالتحاليل المختلفة على الشريط الكاشف بمقارنة لون الشرائط كاشف الفردية إلى مرمزة المقابل إنديكاالاختصاصات على الحاوية كاشف. نموذجية نتائج البول طبيعية هي: (عادي أو سلبية) للدماء، والبروتين، الكريات البيض، النتريت، والجلوكوز، كيتون، البيليروبين، ويوروبيلينوجين. درجة الحموضة البول (5،5-7،0). الثقل النوعي (1،001-1،020). ملاحظة: مستويات عالية من البروتين في عينة البول قد يتنافس مع البروتين من الفائدة للمواقع على الجسيمات النانوية ملزمة. لتعظيم حصاد بروتين مع الجسيمات النانوية، وحجم جسيمات متناهية الصغر / نسبة حجم البول يمكن تعديلها إما المنافسة الحد من وفرة البروتينات عالية، أو يمكن أن يكون الأمثل لحصاد البروتينات التي توجد في تركيزات منخفضة للغاية. إذا كانت قيمة بروتين البول هي 1+ أو أكثر، وإضافة وحدات 2X النانوية في الخطوة 2.5 أدناه. إذا الحليلة الاهتمام هو وفرة البروتين المنخفض جدا، قد يكون من الضروري زيادة حجم الجسيمات النانوية لتصل إلى 2 مل (الشكل 3).
  5. نقل 20 مل من البول أوضح من الخطوة 2.3 إلى تنظيف قاع مخروطي 50 مل أنبوب البولي بروبلين. لاتخل أي حطام / بيليه التي قد تكون في الجزء السفلي من أنبوب البول. إضافة 200 ميكرولتر من الجسيمات النانوية لعينة البول 20 مل. مزيج لفترة وجيزة على خلاط دوامة. ملاحظة: إذا كانت قيمة بروتين البول هي 1+ أو أكثر، إضافة 400 ميكرولتر من الجسيمات النانوية إلى 20 مل البول.
  6. احتضان الخليط البول / جسيمات متناهية الصغر لمدة 30 دقيقة في RT، دون هزاز / الاختلاط.
  7. تدور تعليق البول / جسيمات متناهية الصغر في جهاز للطرد المركزي مجهزة الدوار سوينغ التدريجي في 3،700 x ج لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: إذا كان بيليه هو غير مرئي الطرد المركزي يلي، وتدور في عينات لعدد إضافي من 2-7 دقيقة.
  8. إزالة وتجاهل طاف. إضافة الماء 500 ميكرولتر MilliQ إلى بيليه جسيمات متناهية الصغر.
  9. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل الحل إلى جسيمات متناهية الصغر نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  10. تدور الجسيمات النانوية في أجهزة الطرد المركزي مجهزة الدوار زاوية ثابتة في 16،100 x ج لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: إذا كان بيليه ليس فل مرئيةخوار الطرد المركزي، وتدور في عينات لعدد إضافي من 2-7 دقيقة.
  11. إزالة وتجاهل طاف.
  12. كرر الخطوات من 2.8 و 2.11 (مرتين) مع 200 ميكرولتر 18 MilliQ المياه لغسل النانوية.
  13. إعداد شطف العازلة الطازجة: إضافة 970 ميكرولتر أسيتونتريل إلى 30 هيدروكسيد الأمونيوم ميكرولتر في أنبوب نظيفة. الحذر: هيدروكسيد الأمونيوم غير قابلة للتآكل. مع استخدام التهوية المناسبة. ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا المخزن المؤقت شطف فورا قبل الاستخدام. لا تقم بتخزين شطف العازلة.
  14. إضافة 20 ميكرولتر شطف العازلة لبيليه جسيمات متناهية الصغر. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  15. تدور العينات جسيمات متناهية الصغر في 16،100 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة وحفظ طاف في نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. لا تعطيل بيليه جسيمات متناهية الصغر. تجاهل بيليه في سلة المهملات واقية.
  16. وضع العينات في رف في غطاء الدخان الكيميائي. فتح القبعات والمؤتمر الوطني العراقيأوباتي في RT لمدة 30 دقيقة. بدلا من ذلك، وضع العينات تحت تدفق النيتروجين عند 40 درجة مئوية حتى الجافة (1 - 2 ساعة).
  17. إضافة 15 ميكرولتر تريس، جليكاين العازلة عينة SDS (2X) للعينات. الحرارة عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة الجافة لمدة 5 دقائق مع قبعات مفتوحة أو حتى حجم اليسار في أنبوب ليس أكثر من 20 ميكرولتر. ملاحظة: عدم استخدام حمام الماء المغلي. فإن الرطوبة من حمام الماء يمنع تبخر المخزن المؤقت.
  18. وضع غطاء على الأنابيب. إزالة أنابيب من كتلة الحرارة. ويمكن تخزين العينة في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لالمصب تحليل لطخة الغربي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هيدروجيل الجسيمات النانوية الحجم والتوحيد

وقد تم إنتاج بولي (NIPAm-AAC) الجسيمات مع ارتفاع العائد للغاية والتكاثر بين وداخل دفعات. الجسيمات الغروية لها الاستقرار جيدة جدا في RT خلال الوقت اللازم لالتقاط وتخزين وشطف من البروتينات (لا يقل عن 48 ساعة)، ولم يلاحظ هطول جسيمات متناهية الصغر (الشكل 1) 11. قد يكون الاستقرار الغروية مهم جدا لسرعة امتصاص بروتين / الببتيد بواسطة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الصلة السريرية

ويعتقد أن المصل أو البلازما عينة لاحتواء منخفضة وفرة البروتينات والببتيدات المنتشرة التي يمكن أن توفر مصدرا غنيا للمعلومات عن حالة الكائن الحي ككل. على الرغم من الوعد البروتينات في الدم، وهناك ثلاثة حواجز الفسيولوجية الأساسية والخطيرة إحباط اكتشاف العلامات البيولوجية والترجمة لفائدة سريرية 10، 11، 16، 25.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

بنيامين إسبينا هو موظف في شركة Ceres Nanosciences، Inc. التي تنتج الكواشف المستخدمة في هذه المقالة. يمتلك كل من لانس ليوتا وأليساندرا لوتشيني وفيرجينيا إسبينا براءات اختراع (براءة اختراع أمريكية 7،935،518 و / أو 8،497،137) على تقنية الجسيمات النانوية المستخدمة في هذه المقالة. بصفتهم موظفين جامعيين ، يحق لهم الحصول على إتاوة من براءات الاختراع هذه وفقا لسياسة الجامعة. لانس ليوتا وأليساندرا لوتشيني مساهمان في Ceres Nanosciences ويعملان في المجلس الاستشاري العلمي.

شكر وتقدير

مايكل هنري، جامعة مدينة دبلن، يرجى المساعدة في جمع البيانات وتحليلها هو مبين في الشكل 5. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل (1) جامعة جورج ماسون، (2) الإيطالية IstitutoSuperiore دي سانيتا "في إطار ايطاليا / الولايات المتحدة الأمريكية اتفاقية تعاون بين وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، جامعة جورج ماسون، والوزارة الإيطالية للصحة العامة، (3) NIH، برنامج المنح IMAT 1R21CA137706-01 و1R33CA173359-01 إلى LAL، و (4) سيريس العلوم النانوية، وشركة .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جسيمات هيدروجيل نانويةCeres NanoscienceCS003NanoTrap ESP جزيئات
18 M & Omega ؛ - سم ماءنوع 1 كاشف درجة الماء
Tris HCl ، 50 ملي مولار درجة الحموضة 7.0VWRIC81611650 ملي مولار ، درجة الحموضة 7
أسيتونيتريلBDHBDH1103-4LPمتوفر من VWR
هيدروكسيد الأمونيوم NH4< / sub>OHBDHBDH3014متوفر من VWR ، تم فحصه عند 28-30٪ NH3< / sub>
ثيوسيانات الصوديوم 25 ملي مولارAcros Organics419675000لعينات المصل / البلازما
شرائط كاشف البول متعددة التحليلاتSiemens2161لعينات البول
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)Life TechnologiesLC2676استخدم في RT لمنع ترسيب SDS
حاضنة حمام جاف (100 o< / sup>C) مع كتلة تسخينBarnstead11-715-125DQلا تستبدل حمام الماء المغلي
مشعب مبخر النيتروجينOrganomation AssociatesMicrovap118لعينات المصل / البلازما
جهاز الطرد المركزي ، الدوار المتأرجحمن سلسلة SorvallLegendسعة الأنبوب 50 مل ، جهاز طرد مركزي RCF 3،700 × جم
، دوار بزاويةثابتة Eppendorf5424سعة أجهزة الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل ، RCF 16,000 × جم
50 مل من أجهزة الطرد المركزي المخروطية   ؛ أنابيبفيشر ساينتفيك14-432-22مع أغطية لولبية لعينات البول
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقةEppendorf22363204
خلاط دوامةفيشر Scientific50-949-755
مؤقتفيشر ScientificS04782ثانية / دقيقة

المراجع

  1. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  2. Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
  3. Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
  4. Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
  5. Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
  6. Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
  7. Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
  8. Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
  9. Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
  10. Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
  11. Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
  12. Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
  13. Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
  14. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
  15. Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
  16. Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763(2009).
  17. Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
  18. Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
  19. Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  20. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264(2007).
  22. Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
  23. Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
  24. Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
  25. Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
  26. Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
  27. Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
  28. Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
  29. Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
  30. Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
  31. Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
  32. Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
  33. Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
  34. Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
  35. Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

هيدروجيل الجسيمات النانوية حصاد البلازما أو البول للكشف عن وفرة البروتينات منخفضة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.