نوضح هنا تقنية لنقل الخلايا العصبية على نطاق واسع عن طريق الحقن داخل البطين للفيروس المرتبط بالغدة في دماغ الفأر حديثي الولادة. توفر هذه الطريقة طريقة سريعة وسهلة لتحقيق التعبير مدى الحياة عن الجينات المعدلة وراثيا التي يتم تسليمها عن طريق الفيروس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مع وتيرة التقدم العلمي المتسارع، وهناك حاجة إلى أساليب جديدة لعلم الأعصاب التجريبي بسرعة وسهولة التلاعب التعبير الجيني في مخ الفأر. نحن هنا وصف تقنية لأول مرة من قبل Passini وولف للتسليم داخل الجمجمة المباشر من الجينات المحورة فيروسي-المشفرة في مخ الفأر حديثي الولادة. في أبسط أشكاله، فإن الإجراء يتطلب سوى دلو الجليد وحقنة ميكروليتر. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف بروتوكول للاستخدام مع إطارات التجسيمي لتحسين الاتساق للباحثين جديد لهذه التقنية. تعتمد هذه الطريقة على قدرة الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) للتحرك بحرية من البطينات الدماغية في لحمة الدماغ في حين بطانة البطانة العصبية لا تزال غير ناضجة خلال 12-24 ساعة الأولى بعد الولادة. الحقن داخل البطينات من AAV في هذه النتائج في سن التنبيغ على نطاق واسع من الخلايا العصبية في جميع أنحاء الدماغ. يبدأ التعبير في غضون أيام من الحقن ويستمر لlifetim(ه) من الحيوان. عيار الفيروسية يمكن تعديلها للتحكم في كثافة الخلايا العصبية transduced، في حين شارك في التعبير عن بروتين فلوري يوفر تسمية الحيوية للخلايا transduced. مع ارتفاع توافر المرافق الأساسية الفيروسية لتوفير الكواشف كلا قبالة الجاهزة للاستخدام، وتعبئتها مسبقا وإعداد الفيروسي العرف، وهذا النهج يوفر طريقة في الوقت المناسب لمعالجة التعبير الجيني في مخ الفأر التي هي سريعة وسهلة وأقل تكلفة بكثير من الهندسة التقليدية سلالة الجرثومية.
المقدمة
الطرق التقليدية لتعديل العصبي التعبير الجيني تتطلب وقتا طويلا والتلاعب سلالة الجرثومية باهظة الثمن. البديل دي نوفو يقترب مثل Electroporation للفي الرحم أو الحقن lentiviral التجسيمي تحقق نتائج أسرع وأقل تكلفة ولكن لديها عيب تتطلب التدخل الجراحي المعقد 1-3. وعلاوة على ذلك، التعبير التحوير لديها مجموعة والمكاني المحدود مع هذه الأساليب. هنا، نحن تصف طريقة سريعة وسهلة واقتصادية للتلاعب على نطاق واسع عن طريق حقن الخلايا العصبية داخل البطينات من الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) في مخ الفأر حديثي الولادة. وقد وصفت طريقة أول مرة من قبل جون وولف وماركو Passini في عام 2001، حيث اقترح حجم الجسيمات الصغيرة من سمح ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أداء جميع الإجراءات والبروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم استعراض الإجراءات الموضحة هنا والموافقة عليها من قبل كلية بايلور للطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
تمت الموافقة فيروس الغدة المرتبطة (AAV) ناقلات النسخ المتماثل غير كفء للتسليم التحوير في الدماغ القوارض للسلامة الأحيائية المستوى 1 استخدام. الرجوع إلى الموقع CDC لنشر حكومة الولايات المتحدة "السلامة الأحيائية في علم الأحياء الدقيقة والمختبرات الطبية الحيوية (BMBL)" الذي يفصل متطلبات محددة فيما يتعلق بإجراءات الحماية ومعال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عائدات حقن ناجحة الفيروسي داخل البطين على نطاق واسع وقوي التعبير العصبية. نحن هنا تقييم تنبيغ الفيروسية باستخدام YFP أو tdTomato الجينات الفلورية تحت سيطرة بيتا الدجاج الأكتين المروج (CBA المروج). تم تعبئتها هذه التركيبات في AAV8 وحقنه في البطينات الجانبية من الفئران حديثي الولادة (P0) ICR. أسفرت التتر الفيروسية عالية (10 10 جزيئات في نصف الكرة الأرضية) في وضع العلامات كثيفة من البصلة الشمية، المخطط، قشرة المخ، المخيخ والحصين (الشكل 1A، يسار). كان وضع ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصفناها إجراء تنوعا لمعالجة الخلايا العصبية التعبير الجيني باستخدام AAV كوسيلة للتسليم على نطاق واسع في مخ الفأر حديثي الولادة. بالمقارنة مع غيرها من أساليب نقل الجينات العصبية مثل في الرحم Electroporation لل1 أو التجسيمي الحقن داخل الجمجمة 2،3، حقن الفيروسي حديثي الولادة سهلة نسبيا وبسيطة. لا يمكن أن يؤديها الإجراء الأساسي في دقائق فقط مع دلو الجليد وحقنة ميكروليتر. بقاء الأمثل والتحوير التعبير يمكن أن يتحقق من خلال حضور لبعض التفاصيل التقنية، وأهمها نوعية ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة عائلة روبرت أ. ورينيه إي بيلفر ، و NIA R21 AG038856 (JLJ) ، و A2010097 منحة أبحاث مرض الزهايمر لمؤسسة BrightFocus Foundation (JLJ) ، ومنحة NIA لبيولوجيا التدريب على الشيخوخة T32 AG000183 (دعم أهداف التنمية المستدامة).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الفئران المتناثرة ICR | Harlan | Hsd: ICR (CD-1) | تعرف هذه السلالة أيضا باسم |
| الفئران الفطرية CD-1 FVB | مختبر جاكسون | 1800 | 5-6 أسابيع من |
| العمر Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| chow القوارض عالية الدهون | Purina Mills | PicoLab Mouse Diet 20 ، # 5058 | هذا هو مربي القياسية لدينا تشاو |
| القوارض عالية الدهون (بديل) | مختبرات هارلان | تيكلاد جلوبال 19٪ بروتين القوارض #2019S | إذا كان هناك حاجة إلى نظام غذائي قابل للتعقيم |
| حقنة | هاميلتون | 7653-01 | 10 مل حقنة |
| إبر حقن هاميلتون | 7803-04 ، RN 6PK PT4 ، 0.375 " | 32 جم ، لحقن P0 القياسية | |
| لوحة معدنية ل التخدير بالتبريد | McMaster Carr | 8975K439 | صفيحة الألمنيوم الخام ، 6 × 12 بوصة ، 0.25 بوصة ، ستحتاج إلى تقطيعها إلى 3 قطع وحواف متساوية من قبل متجر الآلات المحلي |
| جهاز تجسيمي للحيوانات الصغيرة مع قراءة رقمية | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| حامل حقنة عالمي مع قدم دعم إبرة | David Kopf Instruments | موديل 1772-F1 | |
| إطار حديثي الولادة | Stoelting | 51625 | يطلق عليه رسميا محول الفأر والفئران حديثي الولادة |
| أكياس التخلص من المخاطر البيولوجية مع مؤشر معقم | VWR | 14220-030 | هام! – تحقق مع الموظفين البيطريين المحليين والسلامة البيئية لمعرفة معهدك" بروتوكول S للتخلص من النفايات البيولوجية |
المراجع
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of g....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
