Method Article

و في المختبر نموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الخلوي في الخلية حثل المادة البيضاء الكروي

DOI:

10.3791/51903

⸱

October 21st, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Connecticut Health Center, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الكروية هي سمة مرضية مميزة لمرض كرابي ، وهو حثل بيضاء البيضاء: يفتقر حاليا إلى علاج فعال طويل الأمد. لقد طورنا نموذجا لزراعة الخلايا لدراسة البيولوجيا الفطرية والإمكانيات المسببة للأمراض للخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة وتحولها إلى خلايا كروية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وظيفة محددة من الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية، تسمى خلايا الكروي، التي هي وفيرة فريد في النظام العصبي المركزي من حثل المادة البيضاء الكروي الخلايا (GLD) غير واضحة. وقد أعاقت هذه الفجوة في المعرفة من خلال عدم وجود الاقتضاء في النموذج المختبر للدراسة. هنا، نحن تصف الفئران نظام الثقافة الدبقية الأساسي في العلاج مع النتائج التي سيكوزين في الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة تشبه الخلايا كروي الشكل المميزة وجدت في شعبة الشؤون القانونية العامة. باستخدام هذا النظام المبتكر، حددنا شروط وطرق التحليل للدراسة الخلايا الكروي. تم التحقق من صحة الاستخدام المحتمل لهذا النظام نموذجا في دراستنا السابقة، والتي حددت دور محتمل للمصفوفة الفلزي (MMP) -3 في شعبة الشؤون القانونية العامة. هذه الرواية في نظام المختبر قد تكون نموذجا مفيدا للدراسة تشكيل وظيفة، ولكن أيضا التلاعب العلاجية المحتملة، من هذه الخلايا الفريدة من نوعها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حثل المادة البيضاء الكروي الخلية (GLD)، المعروف أيضا باسم مرض كرابه، هو مرض قاتل المزيل الناتجة عن فقدان وظيفة الطفرات في galatocerebrosidase (galc) الجين 1. الشكل الأكثر شيوعا من GLD هو البديل الطفولي الذي تمثله في بداية مرحلة الطفولة المبكرة وتتميز نمطا سريريا من السيارات والتدهور المعرفي يؤدي إلى الوفاة المبكرة غالبا قبل سن الخامسة 2،3. وتستخدم الاختبارات الجينية للتحقق من تشخيص GLD 4. أمراض الأعصاب من GLD يكشف إزالة الميالين على نطاق واسع، وضمور الخلايا العصبية، دباق النجمي وجود محتقن الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية تسمى خلايا كروي الشكل 5-7. تحديد خلايا كروي الشكل، وغالبا ما تحتوي على شوائب نبيبي في السيتوبلازم بها، لقد كان السمة المميزة لشعبة الشؤون القانونية العامة على مدى السنوات 97 الماضية، على الرغم من أن ظلت وظيفة معينة من هذه الخلايا واضحة بعيد المنال.

مشاركة غير myel-منذ فترة طويلة تعتبر inating الدبقية (الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية) في التسبب في GLD استجابة الثانوية إلى إزالة الميالين عميق في هذا المرض 8. ومن المثير للاهتمام، وأول وصف لهذا المرض، الذي أدلى به كنود كرابه 5 في عام 1916، وتشكيل ذكرت من البالعات متعددة النوى التي تحتوي على الدهون الحطام التي تم اسمه 'الكروي الخلايا وهي السمة المميزة لهذا المرض.

خلايا الكروي هي سمة مميزة لGLD علم الأمراض، على الرغم منذ فترة طويلة تجاهل دورها في GLD. ومن المثير للاهتمام، وهذه الخلايا هي من بين أولى التغييرات المميزة في أنسجة الجهاز العصبي المركزي GLD. هذا النقص في المعرفة قد يكون بسبب افتراض أن تشكيل البالعات متعددة النوى، تسمى الخلايا العملاقة في أمراض أخرى، تعتبر عادة نتيجة للأمراض المسببة للأمراض بدلا من القوة الدافعة الأولية 9. ولذلك، كانت هناك دراسات قليلة للتحقق من الآلية التي كتبها مبادرة الخوذ البيضاءتتشكل خلايا الكروي CH من البالعات، وخاصة في الجهاز العصبي المركزي من GLD. الإجراء الموضح في هذا التقرير يركز على أهمية تشكيل الكروي الخلايا في الجهاز العصبي المركزي ومظاهرة لدينا السابقة التي يسببها سيكوزين الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، وعرضت هذه الخلايا مستويات أعلى من النشاط البلعمة. واتساقا مع هذه الملاحظات، والخلايا في أدمغة الكروي twitcher كثيرا ما تحتوي-PAS إيجابي الحطام، مما يشير إلى ارتفاع مستويات نشاط البلعمة. تم العثور على خلايا كروي الشكل أيضا أن يكون immunopositive لالفيريتين (علامة الخلايا الدبقية الصغيرة) 10، KP-1 / CD68 (علامة الوحيدات)، وبعضها أيضا إيجابية لvimentin (بروتين خيوط وسيطة وعلامة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها) 11، HLA-DRA (وهي مستقبلات سطح MHCII)، و TNF-α 7، وإيبا-1 (بروتين ملزمة الكالسيوم المستخدمة لتحديد الخلايا الدبقية الصغيرة) 12. وبناء على هذه المجموعة من علامات، وخلايا الكروي تنشأ من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنميالنمط الظاهري فريدة من نوعها.

على الرغم من طابعها الفريد، تم التغاضي عن وظيفة محددة ومساهمة GCS إلى GLD المرضية إلى حد كبير. كان يظن خلايا الكروي لتكون نتيجة ثانوية للإزالة الميالين المزمن. ومع ذلك، فقد حددت دراسات سابقة دراسة جمعية الزمنية للخلايا الكروي لعلم الأمراض المسألة الأبيض من GLD وجود خلايا الكروي في أواخر الجنينية لفترة ما بعد الولادة في وقت مبكر؛ الأوقات التي سبقت موت الخلايا المبرمج دبقية قليلة التغصن وإزالة الميالين العلني 13. وهكذا، فإن التسلسل الزمني لتطور أمراض الأعصاب في GLD تشير إلى أن الخلايا الكروي تتشكل في وقت مبكر من إزالة الميالين في هذا المرض 14. وأدى ذلك إلى فرضيتنا أن تشكيل المبكر للخلايا الكروي في GLD قد تمثل حدثا الممرضة تحديد بدلا من الثانوية، والاستجابة التفاعلية للتلف دبقية قليلة التغصن 15. بالإضافة إلى ذلك، فقد اعتبر ديسريغولاتيون النشاط دبقية في GLD والواقعص تحد من فعالية على المدى الطويل hematopeotic العلاج بالخلايا الجذعية لعلاج هذا المرض 16. وهكذا، والتحقيق في الوظائف الخلوية وتنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا الكروي، ردا على سيكوزين من المتوقع أن توفر رؤى جديدة في التسبب في GLD.

حتى وقت قريب، كان عدم وجود نموذج مناسب للدراسة تشكيل خلية الكروي محدودة فهم وظيفة محددة ومساهمة هذه الخلايا للأمراض من GLD. في الدراسات الحديثة، تقرر أن الخلايا الكروي مثل يمكن تشكيلها في استجابة مباشرة لسيكوزين، وهو توكسين الدهون التي تتراكم العدوى في GLD. وجدنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة، ولكن ليس الضامة، يتم تنشيط وتحويلها إلى خلايا الكروي في الثقافات الدبقية الأولية ردا على سيكوزين 15. تم العثور على هذا التحول إلى خلايا الكروي أن بوساطة البروتيني خارج الخلية، الفلزي مصفوفة (MMP) -3 15. وفي الآونة الأخيرة، فإنناقمنا بمد هذه النتائج وقرر أن الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيط خلايا الكروي سيكوزين المتقدمة في هذا المختبر في نظام نموذجي هي أكثر قدرة سامة للخلايا والخلايا قليلة التغصن دبقية قليلة التغصن السلف. وبالتالي، عندما اعتبر في سياق GLD، وتراكم في وقت مبكر من سيكوزين وتشكيل خلايا الكروي قبل إزالة الميالين ستدعم دورا الابتدائي وربما العدوى الناشئة عن الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا المرض.

نقترح دراسة تشكيل خلية الكروي سوف تكشف معلومات جديدة عن التسبب في GLD من شأنها أن تسهم في فهمنا لهذا المرض. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج الخلوي الجديد من GLD قد توفر شكلا جديدا من النهج الذي علاجية جديدة لمعالجة يمكن اختبارها تغيرات مرضية في هذا المرض. وبالتالي، في هذا التقرير نقدم بروتوكول مفصلة لتطوير في المختبر من خلايا كروي الشكل الناجم عن سيكوزين من الثقافات الأولية من غير myelinating الدبقية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للسياسة على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية التي وضعها مكتب مختبر رعاية الحيوان (NIH) وفقط بموافقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة مركز الصحة كونيتيكت.

1. إعداد الثقافات المختلطة الدبقية

  1. تعقيم جميع الأدوات قبل استخدامها. إضافة 3 مل من محلول معقم الجليد الباردة هانك متوازن الملح (HBSS) التي لا تحتوي على الكاتيونات (المغنيسيوم أو الكالسيوم 2+ 2+) إلى ثلاثة العقيمة 60 ملم أطباق بتري الحفاظ على الجليد للحفاظ على برودة.
  2. عزل القشور من الجراء بعد الولادة الماوس P0-P2، 17،18 كما هو موضح سابقا.
    ملاحظة: هياكل تحت القشرية، مثل الحصين، ليست مدرجة في هذه الثقافات.
  3. إزالة بعناية السحايا ومن ثم نقل إلى عزل القشور HBSS الطازجة وفصل الأنسجة إنزيمي، وذلك باستخدام نيالاورال عدة تشريح الأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  4. لوحة الخلايا في العقيمة T-175 قوارير واحتضان بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام [Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) التي تحتوي على 1X البنسلين / الستربتومايسين].
  5. استبدال جميع وسائل الإعلام في اليوم التالي مع وسائل الإعلام الطازجة. الاستمرار في احتضان الثقافات، مع التغييرات الوسائط العادية، لحوالي 3 أسابيع أو حتى يتم تأسيس أحادي الطبقة الخلوية.
    ملاحظة: سيتم يتألف هذا أحادي الطبقة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة مع ما يقرب من 10: 1 نسبة 19.

2. الكروي التعريفي الخلايا الدبقية في الثقافات المختلطة

  1. إعداد لل coverslips المغلفة ECM.
    1. نقع coverslips دائرية مع معقم 1 N حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) في طبق بتري معقمة لمدة 30 دقيقة. غسل coverslips مع 3X المياه المعقمة ومن ثم نقع في ETOH 95٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل. ومن ثم السماح الهواء الجاف.
    2. مكان قطرات من MATR خارج الخلية المخففالمواد التاسع (ECM) البروتين طلاء على ورقة من parafilm (على سبيل المثال 150-250 ميكرولتر / قطرة من laminin 10 ميكروغرام / مل في حل عقيم حل العازلة الفوسفات [PBS]). توزيع قطرات بحيث coverslips لن تلمس عند وضعها على هذه القطرات. ضع بلطف كل ساترة المجففة على قطرات باستخدام ملقط.
    3. ترك لل coverslips على قطرات تقريبا. 4-6 ساعة داخل الثقافة هود مع وشاح مغلقة.
    4. وضع لل coverslips المغلفة ECM (ECM المغلفة الجانب متابعة) في كل من الآبار من 24 لوحة جيدا. غسل كل بئر مع برنامج تلفزيوني العقيمة 3X والحفاظ على 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.
  2. إعداد الخلايا الدبقية لطلاء على coverslips.
    1. نضح وسائل الإعلام من الثقافات الدبقية وغسل بلطف 3X أحادي الطبقة الدبقية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. المقبل، إضافة 8-10 مل التربسين-EDTA حل لT-175، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. عندما تم فصل أكثر من أحادي الطبقة، إضافة 20 مل من وسائل الإعلام كاملةإلى القارورة لوقف trypsinization. جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا منفصلة في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وتدور لمدة 10 دقيقة في 300 XG في درجة حرارة الغرفة.
    3. نضح طاف دون الإخلال بيليه، ومن ثم اعادة تعليق الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة من قبل pipetting بلطف الحل باستخدام الماصة P1000.
    4. تحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ثم اعادة تعليق الخلايا في المتوسط ​​كاملة في الكثافة المطلوبة (على سبيل المثال 10 5 خلية / مل). لوحة الخلايا على لل coverslips المغلفة ECM (على سبيل المثال 500 ميكرولتر في كل بئر من 24 لوحة جيدا). إضافة وسائط جديدة كاملة إضافية إلى كل بئر لمدة 3-5 أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، أو حتى تنمو الخلايا لالتقاء البصري المطلوب.
  3. العلاج مع سيكوزين.
    1. إعادة تشكيل سيكوزين إلى تركيز الأسهم (108.3 ملم) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). تمييع هذه الأسهم في ETOH 100٪ لجعل مخزون العمل التي يمكن للن أن يضاف إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا لتحقيق تركيز النهائي من 10 ميكرومتر.
    2. عند إضافة سيكوزين، دوامة بلطف لوحة الثقافة لخلط سيكوزين إلى وسائل الإعلام الثقافة. تكملة سيكوزين بإضافة ما يعادل 10 ميكرومتر كل يوم لمدة أسبوع واحد.
  4. بعد 7 أيام من العلاج سيكوزين، وجمع وسائل الإعلام والماصة 500 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لإصلاح الخلايا. ثم، وغسل كل 3X بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني ومن ثم الحفاظ وحات في 4 درجات مئوية حتى المجهزة للمناعية (انظر أدناه).
    ملاحظة: خلية الإعلام الثقافة يمكن جمع لالأنزيمية أو فحص ELISA في هذه المرحلة اذا شئت.

3. كيمياء سيتولوجية مناعية (ICC) لتصور خلايا الكروي

  1. استبدال برنامج تلفزيوني مع عرقلة العازلة [PBS + 0.3٪ توين 20 + 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع)]، واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. فيcubate الخلايا الثابتة في أمصال مضادة ضد الأساسي إيبا-1 [(1: 1،000) المخفف في برنامج تلفزيوني + 0.3٪ توين 20 + 2٪ NGS] لا يقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل جيدا مع كل برنامج تلفزيوني 3X 5 دقيقة / يغسل.
  3. إضافة مضان مترافق الضد الثانوية المناسب للتعرف على العلامات الأولية للأجسام المضادة ومكافحة وصمة عار مع 4 '، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي، 1: 1،000) لتحديد نوى. احتضان في حل الضد الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مع PBS 3X 5 دقائق.
  4. كل جبل ساترة لشرائح المجهر باستخدام المتوسطة المتزايدة. عرض الشرائح على المجهر الفلورسنت للتحليلات البصرية والكمية.

4. تحليل وتوصيف الخلايا الكروي في الثقافة الأولية

  1. استخدام ثلاثة معايير المورفولوجية التالية لتحديد خلية الكروي في الثقافة:
    1. تحديد الخلايا الكروي باستخدام المجهر الفلورسنت من وضع العلامات immunopositive للعلامة دبقية صغيرة، إيبا-1 +.
    2. تحديدخلايا الكروي ومتعدد النوى (أي التي تحتوي على اثنين أو أكثر من نوى دابي إيجابية).
    3. تحديد الخلايا الكروي من قبل مورفولوجيا مستدير متميزة من مظهر تشعبت للغاية من خلايا يستريح دبيقي.
      ملاحظة: يمكن أيضا أن تجمع الخلايا لتحليل علامة سطح الخلية وتقدير التدفق الخلوي من هذه الثقافات.
  2. قياس تفعيل البلعمة من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الكروي
    1. لتقييم نشاط البلعمة من المعالجة سيكوزين الخلايا الدبقية الصغيرة، إضافة حبات اللاتكس FITC المسمى إلى الآبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إضافة حبات اللاتكس الفلورسنت مترافق 48 ساعة قبل تثبيت مع PFA. إصلاح الخلايا تعامل مع الخرز (كما هو مذكور في القسم 2.4)، وعملية مناعية (كما هو موضح في القسم 3).
    2. تحديد الأجسام المضادة الثانوية مترافق fluorophore بحيث لا تتداخل أطياف الانبعاث فلوري من fluorophore المسمى الخرز.
    3. يحلله لمحات من بلعمية إيبا-1 + الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تحديد تلك الخلايا التي تشارك في توطين مع حبات fluorescently المسمى.
      ملاحظة: سوف سيكوزين تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. وسيتم تحديد الخرز المبتلعة داخل mononucleated ومتعددة النوى إيبا-1 + الخلايا في هذا الإعداد الثقافة.

5. تحريض الخلايا الكروي من الثقافات تنقية دبقية

ملاحظة: نهج بديل فك الإشارات بين الخلايا بين نجمية والخلايا الدبقية الصغيرة هي ميزة أخرى لهذا في المختبر نموذج كروي الشكل الخلية. ويمكن تحقيق تنقية خلايا دبقية الأولية للreplating أو زملاء زراعة بانخفاض الملكية تمسكهم في الثقافة، كما هو موضح في الخطوات التالية (انظر القسم 5.2).

  1. جمع وسائل الإعلام من ثقافات مختلطة الدبقية متكدسة في أنبوب مخروطي 50 مل والحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
  2. عزل دبقية صغيرة من الثقافات المختلطة الدبقية الأولية.
    1. بعد إزالة وسائل الإعلام من متكدسة مختلطة الثقافة الدبقية T175 قارورة، إضافة وسائط اهتزاز الدافئة [تتألف من وسائل الإعلام كاملة + 25 ملي 4- (2 هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 ملي بيكربونات الصوديوم (سيغما)]. يهز قوارير لمدة 3-4 ساعة في شاكر المداري في 100 دورة في الدقيقة (37 ° C). جمع وسائل الإعلام من هذه قوارير اهتزت في 50 مل أنابيب مخروطية.
      ملاحظة: وسوف تشمل هذه الوسائط على الخلايا الدبقية الصغيرة ملتصقة أقل من قوارير.
    2. تدور في وسائل الإعلام في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف ثم اعادة تعليق الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام مكيفة نجمية (تم جمعها في الخطوة 5.1).
    3. تحديد عدد الخلايا المكتسبة باستخدام عدادة الكريات ثم لوحة الخلايا دبقية صغيرة على coverslips المغلفة الركيزة (انظر القسم 2.1) للمناعية، أو لوحة على لوحات فائقة الانخفاض تمسك جيدا لجمع الخلايا في المستقبل الكروي للثقافة مشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا قليلة التغصن (كما تنازلياribed في القسم التالي).
      ملاحظة: مطلي مرة واحدة يمكن التعامل مع الخلايا الدبقية الصغيرة مع سيكوزين (10 ميكرومتر) كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 2.3).
  3. شارك في الثقافة مع الخلايا قليلة التغصن الابتدائية للتحليل السمسة.
    ملاحظة: مجموعة من الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة سيكوزين من لوحات التقيد منخفضة لاحقة شارك في ثقافة على الثقافات الأولية من الخلايا قليلة التغصن، أو خلايا دبقية قليلة التغصن السلف، ويمكن استخدامها لدراسة وظيفة السامة المحتملة لمثل هذه الخلايا في المختبر كروي الشكل.
    1. تطوير ثقافات قليلة التغصن الأولية باستخدام أساليب أنشئت 18،20. لجمع الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة سيكوزين، الماصة بلطف لفصل الخلايا الملتصقة فضفاضة من أسفل الآبار. جمع الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة، وresuspend ثم بعناية في وسائل الإعلام دبقية قليلة التغصن التمايز [مكونة من Neurobasal وسائل الإعلام، L-الجلوتامين (1X)، B-27 ملحق (1X)، و triiodothyronine (T3، 10 نانوغرام / مل )].
    2. حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ثم بذر الخلايا الدبقية الصغيرة على ثقافة دبقية قليلة التغصن في 1 × 10 5 خلية / مل، مما أدى إلى تقارب 1: 2 الخلايا الدبقية الصغيرة / نسبة دبقية قليلة التغصن. احتضان باعتباره الثقافة المشتركة لمدة تصل إلى 3 أيام.
    3. إصلاح خلايا مناعية ل(انظر القسم 2.4). جمع وسائل الإعلام ثقافة الخلية لELISA أو التحاليل الكيميائية حسب الحاجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول، كما هو مكتوب، ومن المتوقع أن تستغرق نحو 36 يوما لاستكمال من البداية الى النهاية (انظر الشكل 1: مخطط سير العمل التجريبية). فقد كان من تجربتنا أن تطوير الخلايا مثل كروي الشكل 'في هذا النظام الأساسي الثقافة على حد سواء موثوقة وقابلة للتكرار: لوحظ تشكيل خلايا متعددة النوى ردا على سيكوزين باستمرار مع 7 أيام من العلاج.

تلطيخ Immunocytochemical من الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام إيبا-1 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول الموصوفة هنا يوفر النظام نموذج جديد للدراسة تطوير وتوصيف وظيفي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الكروي. العمل مسبق من ايم وآخرون. باستخدام خط الخلية HEK293 قدمت نموذجا لتطوير هذا البروتوكول لدراسة تشكيل خلية الكروي 21. ومن المهم أيضا أن نشير إلى أن الخلايا المشتقة الكروي في النموذج تختلف عن الخلايا الأم الكروي تحديدها في GLD. على سبيل المثال، لاحظنا بشكل روتيني quadranucleation من الخلايا الدبقية الصغيرة في الثقافات الفئران لدينا، في حين أن الخل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد (RG 5001-A-3 إلى S.J.C.) ، والمعاهد الوطنية للصحة (NS065808 إلى E.R.B. NS078392 إلى S.J.C.) ، وصناديق بدء التشغيل من مركز UConn الصحي (إلى SJC) وصندوق عائلة كيم (UCHC لدعم K.I.C).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
هانك محلول ملح متوازن (HBSS) لا يحتوي على كاتيونات (Mg2 + < / sup> و Ca2 + < / sup>).تقنيات الحياة14175-095
مجموعة تفكك الأنسجة العصبيةMiltenyi130-092-628
40 &# 956; مصفاة الخلاياm فيشربراند22363547
هانك محلول ملح متوازن (HBSS) يحتوي على كاتيونات (Mg2 + < / sup> و Ca2 + < / sup>).Gibco14025-092
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)Gibco11995-065
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
Penicilin / StreptomycinLife technologies15070-063
LamininSigmaL2020
Trypsin-EDTA solutionsLife technologies25299-056
سيكوسينسيجماP9256
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجماD2650
بارافورمالدهيد (PFA)علم المجهر الإلكتروني19208
مصل الماعز العادي (NGS)InvitrogenPCN5000
Iba-1WAKO019-19741
Alexa Fluor مترافق تقنيات antiseraLifeوسائط تركيب مختلفة
SouthernBiotechOB100-01
طقم فحص البلعمةكايمان للكيماويات500290
HEPESSigmaBP310-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
  2. Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).
  3. Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter's Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
  4. Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
  5. Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
  6. Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
  7. Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
  8. Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
  9. McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
  10. Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
  11. Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
  12. Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
  13. Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
  14. Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
  15. Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
  16. Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
  17. Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
  18. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
  19. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
  20. Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
  21. Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Globoid Cell LeukodystrophyPrimary Glial CultureCycline TreatmentMicroglia MultinucleationImmunofluorescent MicroscopyECM Coated Cover SlipsPhagocytic Activity AssessmentIO One Microglia MarkerFluorescent Microscopy AnalysisOligodendrocyte Progenitor Cells

Related Articles