مقالة منهجية

جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

DOI:

10.3791/51906

⸱

يوليو 6, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, University of Manitoba, 2Department of Community Health Sciences, University of Manitoba

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد استخدام أخذ عينات الفرشاة الخلوية لجمع الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة من باطن عنق الرحم تقنية طفيفة التوغل توفر عينات لتحليل مناعة الجهاز التناسلي الأنثوي. في هذا البروتوكول ، نصف جمع عينات الفرشاة الخلوية وعزل الخلايا المناعية لمقايسات قياس التدفق الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أهمية الصحة العامة لمسببات الأمراض المخاطية (بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية) ، لا يعرف سوى القليل نسبيا عن المناعة المخاطية ، خاصة في الجهاز التناسلي الأنثوي (FGT). نظرا لأن انتقال العدوى بين الجنسين يمثل الآن الآلية المهيمنة لانتقال فيروس نقص المناعة البشرية ، وبالنظر إلى الانتشار المستمر للأمراض المنقولة جنسيا (STIs) ، فمن الأهمية بمكان فهم التفاعل بين المضيف والممرض في الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية. ترجع الفجوات الكبيرة في المعرفة حول مناعة FGT جزئيا إلى صعوبة جمع عينات الغشاء المخاطي ومعالجتها بنجاح. من أجل تسهيل الدراسات ذات حجم العينة الكافي ، يجب أن تكون تقنيات التجميع طفيفة التوغل وفعالة. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تحسين بروتوكول لجمع عينات الفرشاة الخلوية لعنق الرحم والعزل اللاحق لخلايا عنق الرحم أحادية النواة (CMC). باستخدام التنميط المناعي القائم على قياس التدفق الخلوي خارج الجسم الحي ، من الممكن تحديد ترددات الخلايا الليمفاوية / الخلايا الوحيدة CMC وأنماطا ظاهرية بدقة وموثوقية. يمكن أن تقترن هذه التقنية بمجموعة غسل عنق الرحم المهبلي (CVL) ، والتي تحتوي على وسطاء مناعي قابل للذوبان بما في ذلك السيتوكينات والكيموكينات ومضادات البروتياز ، وكلها يمكن استخدامها لتحديد البيئة المضادة للالتهابات أو المؤيدة للالتهابات في المهبل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبية الإصابات الجديدة بفيروس نقص المناعة البشرية في جميع أنحاء العالم من خلال نقل تنشأ الغيرية، وتمثل النساء 47٪ من الإصابات الجديدة في عام 2011 (برنامج الأمم المتحدة المشترك 1). فهم المسالك التناسلية للإناث (FGT)، واحدة من بوابات الدخول الرئيسية لفيروس نقص المناعة البشرية وغيره من مسببات الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي، له أهمية كبيرة على طريق إيجاد استراتيجيات فعالة لمنع العدوى. الاستجابات المناعية في الغشاء المخاطي التناسلية بشكل واضح فريدة من نوعها وتختلف عن تلك التي قيست في الدم المحيطي 2. ومع ذلك، والمعرفة الحالية لديناميات المناعة في FGT يقتصر في أحسن الأحوال. حتى الآن، ركزت دراسات البيئة المناعة المخاطية إلى حد كبير على الأمعاء المرتبطة الأنسجة اللمفاوية (GALT)، حيث أصبح من الواضح أن الأحداث في وقت مبكر من الأنسجة المخاطية بعد الإصابة يكون لها تأثير قوي على تطور المرض لاحقا 3،4. جمع عينات من الغشاء المخاطي التناسلية يمثل تحديا كبيرا، وهي مسؤولة جزئيا على الأقل في أمريكا اللاتينية والكاريبيك من فهم علم المناعة من FGT. حل اللغز من ديناميكية المناعة بين المضيف والممرض في سياق البيئة المتميزة التي هو FGT يتطلب أساليب فعالة لجمع وتحليل عينات من هذه اللغة.

ينقسم FGT إلى قسمين: الجهاز التناسلي العلوي الذي يتضمن أنابيب فالوب، بطانة الرحم وباطن عنق الرحم، والجهاز الذي يحتوي على أقل الجزء المهبلي من العنق والمهبل (استعرضها Kaushic آخرون 5). فإنه لا يزال من غير الواضح ما المساهمة النسبية لهذه المواقع المختلفة للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، ولكن يعتقد أن كلا الموقعين يمكن أن تسهم في إدخال فيروس نقص المناعة البشرية 6. خلايا T تمثل 40-50٪ من كريات الدم البيضاء في مساحات الإنجابية العلوي والسفلي، في حين تضم ما يقرب من 10٪ الضامة (إعادة النظر في رودريغيز غارسيا، وآخرون 2). ويمكن الكشف عن خلايا T في المهبل وعنق الرحم وبطانة الرحم و. الضامة هي أكثر locali بقوةزد في بطانة الرحم والنسيج الضام عضلة الرحم من عنق الرحم، على الرغم من أنها يمكن أن يتم الكشف عن في كل الأنسجة. أخيرا، الخلايا الجذعية بلازماوية (pDCs) وخلايا لانغرهانس يمكن أيضا أن يتم الكشف عن FGT في الأنسجة. النمط الظاهري ونسب السكان المناعة، وقابليتها للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية قد تختلف الأهم وفقا لدورات الهرمونية، واستخدام وسائل منع الحمل الهرمونية، التهاب المهبل الجرثومي أو أنشطة جنسية 5،7-9.

وقد تم تطوير أساليب متنوعة لدراسة السكان والبيئة المناعي من FGT. خزعة عنق الرحم، وعنق الرحم وcytobrushes lavages العنقية المهبلية (CVL) 10-12 هي الأكثر استخداما عبر الأدب. جمع CVL بواسطة PBS غسل هو أبسط طريقة ويسمح دراسة البروتينات المناعية تغييري ولكن النتائج في العائد خلية منخفضة للغاية، وبالتالي فهي ليست مناسبة لدراسة السكان الخلايا المناعية من FGT 13. عينات CVL هي، من ناحية أخرى، والخامسريها مفيدة لتقييم البيئة المناعي للFGT عن طريق قياس التعبير عن مختلف السيتوكينات، كيموكينات أو عوامل مضادة للميكروبات باستخدام أساليب مثل ELISA، خلوى حبة مجموعة 14 أو قياس الطيف الكتلي 15،16. لا يمكن أن يتحقق توصيف الترددات الخلايا المناعية، والظواهر وظائف الخلايا وحيدات النوى من خلال جمع عنق الرحم (CMC) من خلال عنق الرحم cytobrush أو عنق الرحم أخذ عينات الخزعة.

عنق الرحم أخذ عينات الخزعة هو أسلوب الغازية التي تزيد من مشقة وخطر النزيف ويأخذ 2-11 أيام للشفاء بعد إجراء اعتمادا على الوضع المناعي للمرأة 12. من ناحية أخرى، cytobrushes عنق الرحم، على الرغم من انخفاض العائد من الخلايا التي تم جمعها، هو وسيلة أقل الغازية وأكثر ملاءمة لجمع الخلايا المناعية من FGT. كلتا الطريقتين يمكن الوصول إلى نفس العائد من كريات الدم البيضاء CD45 +، ولكن اثنين cytobrushes عنق الرحم متتابعة ضرورية للحصول على نفس الكمية من الخلايا الموجودة طن واحد خزعة 13. مع ذلك، وأخذ العينات cytobrush لا يزال يوفر عددا مقبولا من خلايا (CD45 + حوالي 5،000 خلية / cytobrush) لمزيد من فيفو السابقين phenotyping بواسطة التدفق الخلوي 14. أيضا، وتوصيف وظيفي يمكن القيام بها على هذه العينات، حيث تم تنفيذ التحفيز وتدفق الخلايا الخلوي أو باستخدام QPCR المجالس البلدية للأطفال المستمدة cytobrush لتحديد الاستجابات المناعية فيروس نقص المناعة البشرية محددة 17 أو الاستقطاب الخلية ال 18. قد توسع من السكان الخلايا التائية أيضا تسهيل الدراسات الفنية مع المجالس البلدية للأطفال 19.

من المهم أن نلاحظ أن الخزعات وcytobrushes عينة أجزاء متميزة من FGT. وتستمد الخزعات من الجزء العلوي للظهارة وسدى من الجزء المهبلي من العنق 12،13، في حين cytobrushes عنق الرحم أخذ عينات من فوهة عنق الرحم، وجمع الخلايا المشتقة من ظهارة باطن عنق الرحم ويفترض أن منطقة التحول. لذا عينات عينة Cytobrush إعادةجيون تتألف من طبقة واحدة من ظهارة عمودية، في حين الخزعات، وتشمل منطقة مبطنة من قبل ظهارة الحرشفية الطبقية 5. ونتيجة لذلك، فإن طبيعة السكان الكرية البيضاء التي جمعتها خزعة عنق الرحم وcytobrush يختلف. الخزعات جمع نسبة أعلى من الخلايا CD3 + T، في حين cytobrushes يؤدي إلى مجموعة من نسبة أعلى من حيدات CD14 + / 13 الضامة.

وكانت دراسة علم المناعة من FGT مصلحة لسنوات عديدة 20-22 وتراكمت لدينا قدرا كبيرا من الخبرة مع دراسة المجالس البلدية للأطفال المستمدة cytobrush. تركز دراساتنا في الغالب على دراسة المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وغير مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية تتعرض سلبيين (الحصن) عاملات الجنس من نيروبي، كينيا. فيروس نقص المناعة البشرية يعيد تفضيلي في تنشيط خلايا تي 23 وانخفاض أعداد خلايا تنشيط التي يمكن أن تكون مستهدفة من قبل فيروس نقص المناعة البشرية في FGT يمكن أن تسهم في الحماية من فيروس نقص المناعة البشرية الاستحواذ. تمشيا مع هذه الفرضية، عدة ستوديوقد وصفت وفاق تنشيط جهاز المناعة أقل بين العاملات في تجارة الجنس الحصن الذين يتعرضون للغاية لفيروس نقص المناعة البشرية لا تزال حتى الآن غير مصاب 24،25، ويلاحظ هذا النمط الظاهري هادئة أيضا في FGT 14. هنا، نحن تصف منهجية لمعالجة وتقييم تفعيل الخلايا التائية في عينات CMC المستمدة من cytobrushes عنق الرحم بواسطة فيفو السابقين التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق: أخلاقيات البحوث لوحات كل من جامعة مانيتوبا ومستشفى كينياتا الوطني / جامعة نيروبي وافقت على هذه الدراسة وتم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من جميع المشاركين في الدراسة.

1. إعداد وسائل الإعلام وأنابيب جمع CMC

  1. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (137.93 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.67 ملي بوكل، 8.1 ملي نا 2 هبو 4، 1.47 ملي KH 2 PO 4). الأوتوكلاف للعقم. هذا ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
  2. قبل قسامة 5 مل PBS في أنبوب 50 مل الصقر (واحد لكل عينة التي سيتم جمعها) وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى وقت جمع العينة.
  3. تسمية 2-4 cryovials أو 1.5 مل أنابيب microcentrifuge لكل عينة لجمع غسيل للتخزين.
  4. إعداد الخلايا سائل الإعلام والثقافة: 1640 RPMI + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين / الأمفوتريسين B (تركيز النهائي 100 وحدة / مل، 100 ميكروغرام / مل و 250 نانوغرام / مل، respectivوأضاف اعل، مع عدم وجود FCS / FBS.

2. جمع عينات Cytobrush

جمع عينات cytobrush هو إجراء غير الغازية التي يجب تنفيذها من قبل MD المدربين أو طبيب نسائي.

  1. جمع الخلايا وحيدات النوى عنق الرحم (CMC) باستخدام كلا من cytobrush ومكشطة خشبية أو بلاستيكية. جمع CMC من المشارك تحت الفحص عن طريق إدخال منظار مكشطة وتدور حول فوهة عنق الرحم (الشكل 1). إدراج cytobrush في نظام التشغيل وباطن عنق الرحم، وتناوب 360 درجة، ووضع على الفور كلا من cytobrush ومكشطة في أنبوب 50 مل الصقر تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  2. الاحتفاظ بعينات على الجليد / في 4 º C حتى المعالجة. للحفاظ على بقاء الخلية، وعينات العملية في غضون 2 ساعة من جمعها.
  3. إذا كان ذلك ممكنا، وجمع عينات الدم المتطابقة باللون الأخضر أعلى vacutainers الهيبارين لالمحيطية وحيدات النوى الدم الخلية (PBMC) العزلة ليكون بمثابة مقارنة / تحكم لتحليل CMC.

3. عزل المجالس البلدية للأطفال

أداء تجهيز العينات في المختبر مستوى السلامة الأحيائية 2، في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة مع قفازات مزدوج.

  1. خلال جمع ويمكن عينات CMC تصبح ملوثة بالدماء. استبعاد العينات مع تلوث الدم مرئية من الدراسة من أجل منع إدراج الخلط بين PBMC في العينة النهائية. ويرجع ذلك إلى انخفاض عدد الخلايا الليمفاوية المعزولة من عينات CMC، يمكن أن تلوث الدم الطفيفة تطغى بسهولة المكون اللمفاويات CMC.
  2. أنابيب دوامة الصقر تحتوي على كلا من cytobrush ومكشطة لمدة 45 ثانية لفصل الخلايا من الفرش. قد تصبح عينات رغوي خلال هذه العملية؛ هذا أمر طبيعي.
  3. استخدام cytobrush لتتخلص من أي المواد المتبقية قبالة مكشطة، وتجاهل مكشطة في محلول التبييض. لجمع أي الخلايا المتبقية تعلق على فرشاة / مكشطة، واستخدام القفازات جديدة للضغط على مكشطة بين الإبهام والسبابة.تنزلق الفرشاة، والسماح للخلايا وPBS التي سيتم جمعها في نفس أنبوب 50 مل. تجاهل cytobrush في محلول التبييض، وتجاهل القفازات.
    هام: استخدم قفاز جديد لكل عينة.
  4. تناسب 100 ميكرومتر مصفاة الخلية النايلون لالطازجة أنبوب 50 مل الصقر. باستخدام ماصة نقل، وجمع تعليق PBS خلية من أنبوب العينة وتصفية من خلال مصفاة في أنبوب جديد.
  5. إضافة 5 مل من 1640 RPMI إلى أنبوب العينة الأصلية. باستخدام ماصة نقل، وغسل الجانبين من أنبوب عينة مع RPMI، ونقل من خلال فلتر لأنبوب المجموعة الجديدة. غسل الجزء السفلي من مرشح من النايلون مع RPMI كذلك.
  6. الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 514 ز س. فمن الأهمية بمكان أن يترك الفرامل الطرد المركزي من خلال هذه الخطوة، من أجل منع بإزاحة بيليه CMC.
  7. بلطف إزالة طاف من الأنبوب، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. سوف حجم بيليه تكون متغيرة بصورة كبيرة؛ في ذلكلي العينات، بيليه هو كبير جدا بسبب وجود أعداد كبيرة من الخلايا الظهارية، بينما في حالات أخرى، بيليه هو بالكاد مرئية وشفافة للغاية.
  8. resuspend الكرية التي كتبها الإثارة لطيف من الأنبوب الصقر. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني لغسل العينة.
  9. الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 514 x ج مع عدم وجود الفرامل الطرد المركزي.
  10. تجاهل بعناية طاف واعادة تعليق بيليه على النحو الوارد أعلاه. الخلايا مستعدون لأي الحفظ بالتبريد (باستخدام بروتوكول الحفظ بالتبريد PBMC)، والتحفيز أو التدفق الخلوي phenotyping.

4. CMC تلطيخ السطح والتدفق الخلوي

  1. resuspend الكرية من الخطوة 3.10 في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل ونقل إما في لوحة 96 جيدا أو أنبوب FACS. عرقلة الحل (لمنع المستقبلات Fcγ) هو وصفة على النحو التالي: 1.8 ميكرولتر مفتش الماوس (تركيز النهائي 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر)، 5 ميكرولتر FBS و93.2 ميكرولتر FACS غسل (PBS +2٪ FBS).تلطيخ لا يمكن أن يؤديها في 96 لوحة جيدا إذا أحجام بيليه صغيرة بما فيه الكفاية، ولكن قد تحتاج إلى القيام بها في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية إذا الكريات كبيرة بشكل روتيني. من المهم أن يعاير الأجسام المضادة وفقا لذلك.
  2. منع عينات لمدة 10 دقيقة على الجليد / في 4 درجات مئوية.
  3. غسل الخلايا مع 100 ميكرولتر من FACS غسل (PBS +2٪ FBS) في لوحات 96 جيدا أو 500 ميكرولتر في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية مع الفرامل على انخفاض (أو إيقاف تشغيله، وإذا كان إعداد الفرامل منخفضة غير متوفرة).
  4. إزالة طاف واعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق التحريض. إضافة وصمة عار الجدوى (لايف الميت قابل للتثبيت الجدوى صبغة). إعداد الجدوى صبغ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. قد تحتاج إلى معاير للاستخدام في كل الإعداد مختبر / عداد الكريات. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
  5. غسل الخلايا μl/500 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (لمدة 96 لوحة جيدا أنابيب / نظام مراقبة الأصول الميدانية). أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة مع انخفاض / لا الفرامل. إزالة supernatanر وResuspend الخلايا.
  6. احتضان الخلايا مع مزيج من الأجسام المضادة علامة السطح، في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. هام: تحسين ويعاير كل التدفق الخلوي لوحة قبل عينة تلطيخ. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
  7. كرر الخطوة 4.5. إذا تلطيخ في 96 لوحة جيدا، وخلايا نقل إلى أنبوب FACS وتضعف إلى الحجم النهائي من 750 ميكرولتر من FACS غسل تحتوي على 1٪ بارافورمالدهيد (PFA) (أو CytoFix، المخفف في 1 4). انتقل إلى الحصول على البيانات على عداد الكريات التدفق.

5. جمع وإعداد عنق الرحم المهبلي الغسل (CVL)

  1. قبل cytobrush أخذ العينات، واستخدام حقنة لغسل باطن عنق الرحم مع 2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة ونضح غسيل من القبو الخلفي.
  2. جمع العينة غسيل يستنشق في أنبوب 15 مل الصقر والحفاظ على الجليد / في 4 º C حتى المعالجة.
  3. عينة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 7 دقائق لإزالة الحطام الخلوية.
  4. شاركllect طاف، قسامة العينة في 1 مل أو 500 ميكرولتر مأخوذة، وتخزينها في -70 درجة مئوية. مأخوذة يمكن إذابة لELISA أو تحليل مجموعة من البروتينات حبة CVL، ولكن تجنب متعددة دورات تجميد / الذوبان.
  5. إذا رغبت في ذلك، resuspend الكرية من الحطام الخلوية في وقت لاحق لقياس الحمض النووي الريبي RNA التعبير باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

6. الحصول على البيانات

  1. إعداد مجموعة من أنابيب التعويض الذي يطابق لوحة الأجسام المضادة. تشغيل أنابيب تعويضات لضبط التداخل الطيفي. تشغيل العينات على أي تدفق عداد الكريات متعدد الألوان الذي تم تكوينه لاستخدام الأجسام المضادة مترافق تألقي في لوحة.
  2. الحصول على عينة PBMC الأولى لضبط الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الجهد من أجل الكشف عن السكان لمفاوية. محاولة الاحتفاظ بها في كل محور على 100 على نطاق والخطية. وسوف يعمل على التحكم PBMC جعله أسهل بكثير للعثور على السكان لمفاوية CMC.
  3. عتبة FSC لعينات CMC قد تحتاج إلى زيادة النسبي لعينات PBMC بسبب تشويه يصل محور SSC في القيم FSC منخفضة.
  4. دوامة كل أنبوب قبل الحصول. الحصول على أنبوب بأكمله إلى زيادة عدد الأحداث بوابة اللمفاويات التي تم جمعها. رصد الجهاز بعناية لتجنب انسداد.
  5. تصدير البيانات إلى برنامج تحليل تدفق cytometric مثل FlowJo.

7. استراتيجية المحاصرة

  1. حدد إعادة توجيه الجانب مبعثر عالية (FSC-H) / الى الامام منطقة الجانب مبعثر (FSC-A) لتحديد السكان القميص.
  2. حدد التوقيت مقابل علامة نيون (كمثال FITC) للسيطرة على جودة عملية الاستحواذ. التغير في معدل التدفق قد يعرض القطع الأثرية في البيانات. استبعاد أي منطقة يظهر التباين في معدل التدفق.
  3. تحديد السكان اللمفاويات على SSC-A/FSC-A المؤامرة. استخدام عنصر تحكم PBMC لتسهيل تحديد الهوية. لاحظ أن السكان اللمفاويات CMC قد لا تكون واضحة مثل السيطرة PBMC
  4. البوابة على SSC-A/viability صبغ لاستبعاد الخلايا الميتة من خلايا حية. الخلايا الميتة يمكن أن تتضمن على وجه التحديد غير الأجسام المضادة، والتي سوف أعرض التحف.
  5. البوابة على SSC-A/CD3 لتحديد السكان الخلايا التائية. من هذه البوابة، وتحديد السكان CD4 + و CD8 +.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التدفق الخلوي Multiparameter هو أداة قوية لتشريح الظواهر وظائف فرعية الخلايا في الأنسجة uncharacterized سابقا. تحليل عينات CMC يمكن أن تسفر عن معلومات عن كل من اللمفاويات والوحيدات السكان مع استراتيجيات النابضة المناسبة.

ممثل استراتيجية النابضة CMC، مقارنة الشخصي PBMC المتطابقة، هو مبين في الشكل 2. وFSC-A مقابل FSC-H مؤامرة يسمح لاستبعاد الحلل الخلية، والتي تنتشر بشدة في عينات CMC مقارنة PBMC، حت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا للفجوات كبيرة في المعرفة فيما يتعلق بالحصانة في المسالك التناسلية للإناث (FGT)، ويمكن تحليل المظهري من المجالس البلدية للأطفال توفر مجموعة واسعة من نظرة ثاقبة السكان اللمفاويات متعددة في عنق الرحم. إلى جانب تحليل البروتين والقياسات الحمل الفيروسي في غسل عنق الرحم، والحصانة للإصابة بالأمراض المنقولة جنسيا (STI) ق ومسببات الأمراض الأخرى يمكن تشريح في مختلف السكان.

الاعتبارات التقنية - المجالس البلدية ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا جوشوا كيماني ، المدير السريري لبرنامج الأبحاث في جامعة نيروبي ، على مساعدته في دراسات المناعة المخاطية المتعلقة بهذا البروتوكول. يود المؤلفون الإقرار بالتمويل من منحة CHVI MOP 86721.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 مو ؛ مصفاة خلية m لأنبوب فالكون 50مل BD352360CMC معالجة
RPMI 1640معالجة HycloneSH30027.01CMC
مصل الأبقار الجنينيتقنية الحياة16000044معالجة CMC
تقنية FungizoneLife15290-018معالجة
CMC معالجة البنسلين / الستربتومايسينSigmaP4333-20mlCMC
50 مل أنبوب الصقرفيشر14-959-49ACMC معالجة
بنك الدم ماصة نقل يمكن التخلصمنها فيشر13-711-6MCMC معالجة
الفرشاة الخلوية بالإضافة إلىCooper الجراحيةC0121CMC
العينات مكشطة عنق الرحم التي يمكن التخلص منهاالطبيةالسريعة 2183CMC
أخذ العينات 15 مل أنبوب الصقرفيشر14-959-70cمعالجة CVL
1.5 مل أنبوب EppendorfFisher05-402-18تخزين CVL
LIVE / DEAD Fixable Cell StainKit Invitrogenكاشف قياس التدفقالخلوي
المختلف المخزن المؤقت للتثبيت (4٪ PFA)BD554655قياس التدفق الخلوي regeant
ماوس IgG ماوسSigmaI8765مقياس التدفق الخلوي regeant
أخذ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
  2. Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
  3. Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
  4. Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
  5. Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
  6. Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
  7. Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
  8. Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
  9. St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
  10. Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
  11. Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
  12. Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
  13. McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
  14. Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
  15. Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
  16. Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
  17. Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
  18. McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
  19. Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
  20. Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
  21. Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
  22. Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
  23. Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
  24. McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
  25. Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
  26. Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
  27. Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
  28. Oertelt-Prigione, S. Immunology and the menstrual cycle. Autoimmunity reviews. 11, (2012).
  29. Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cervical Mononuclear CellsFlow Cytometry AnalysisCytobrush Sample CollectionCervical Vaginal LavageCell Isolation ProtocolImmunophenotyping TechniqueLymphocyte Monocyte PopulationsHIV Susceptibility ResearchFemale Genital TractPeripheral Blood Controls

مقالات ذات صلة