عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية

Summary

تم إعاقة تحليل تعبير البروتين في صمامات الفأر الجنينية الصغيرة بسبب الأنسجة المحدودة المتاحة. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا لإعداد البروتين من تطوير مناطق صمام الفأر الجنيني لتحليل اللطخة الغربية.

Abstract

تحليل اللطخة الغربية هو أسلوب شائع الاستخدام للكشف عن مستويات البروتين وقياسها. ومع ذلك ، بالنسبة لعينات الأنسجة الصغيرة ، قد لا تكون طريقة التحليل هذه حساسة بما يكفي للكشف عن البروتين ذي الأهمية. للتغلب على هذه الصعوبات ، قمنا بفحص بروتوكولات الحصول على البروتين من صمامات القلب البشرية البالغة وقمنا بتعديل هذه البروتوكولات لنظرائهم في الفئران الجنينية المبكرة. باختصار ، يتم جمع مناطق الصمام الأبهري الجنيني للفأر ، بما في ذلك الصمام الأبهري وجدار الأبهر المحيط به ، في أقل حجم ممكن من مخزن التحلل القائم على تريس مع مثبطات الإنزيم البروتيني. إذا لزم الأمر بناء على استراتيجية التكاثر ، يتم تنميط الأجنة جينيا قبل تجميع أربع مناطق للصمام الأبهري الجنيني للتجانس. بعد التجانس ، يتم استخدام مخزن مؤقت للعينة المستند إلى SDS لتغيير طبيعة العينة للتشغيل على هلام SDS-PAGE وتحليل اللطخة الغربية اللاحقة. على الرغم من أن تركيز البروتين لا يزال منخفضا جدا بحيث لا يمكن تحديده باستخدام فحوصات القياس الكمي للبروتين الطيفي ووجود عينة متبقية للتحليلات اللاحقة ، إلا أنه يمكن استخدام هذه التقنية لاكتشاف البروتينات المفسفرة وشبه كميتها بنجاح عبر اللطخة الغربية من عينات مجمعة لأربع مناطق جنينية للصمام الأبهري للفأر 13.5 ، ينتج كل منها ما يقرب من 1 ميكروغرام من البروتين. ستكون هذه التقنية مفيدة لدراسة تنشيط مسار إشارات الخلية ومستويات التعبير عن البروتين أثناء التطور المبكر لصمام الفأر الجنيني.

Introduction

أن تكون قادرة على تحديد وقياس مستويات البروتين التعبير هو أسلوب القياسية لالحيواني والتجارب القائمة على الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الفائدة في وقت مبكر الجنينية تطوير صمام القلب، وتقييم البروتين التعبير في هذا النسيج محددة خلال تطوير يقتصر حاليا على المناعية في كل من الفرخ والفأر ^1،2 طويل الأمد. جزء من صعوبة تحديد كمية البروتين التعبير في صمامات تطوير معظم الكائنات نموذج (مثل الفرخ والفأر) هو صغر حجم الصمامات، مما يحد من كمية البروتين التي يمكن الحصول عليها. وهكذا، على التحليلات الكمية، يعتمد الباحثون عادة على استخراج الحمض النووي الريبي والتضخيم PCR الكمي لاحقة أو تحليل ميكروأري ^2-5. ومع ذلك، R....

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كارولينا الشمالية في تشابل هيل.

1. المكوس الصمام الأبهري

1. باستخدام تقنية القتل الرحيم المعتمدة للمرحلة الجنينية من الفائدة، الموت ببطء ماوس حاملا مع الجراء في اليوم الجنينية المطلوب (E) للتنمية.
2. استخدام الايثانول 70٪ لتعقيم البطن للإناث الحوامل. رفع الجلد وعضلات أسفل البطن وحتى بعيدا عن الأعضاء الداخلية، وتشريح تجويف أسفل البطن مفتوحة....

Results

باستخدام هذه التقنية إعداد، تمكنا من كشف فسفرته لل Smad ^1،5،8 (pSmad) في مناطق الصمام الأورطي واحدة من E13.5 الأجنة. كما هو مبين في الشكل 1A، البروتين معزولة حتى من منطقة صمام واحدة كافية لكشف عصابة pSmad باهتة. كثافة إشارة تزيد نسبيا إلى عدد من المناطق صمام التي يتم تجميعها. الأهم من ذلك، لا تزال pSmad / β-أكتين نسبة ثابتة تقريبا في جميع أنحاء أحجام العينات المختلفة (الشكل 1C). نظرا لانخفاض مستويات البروتين المتاحة، نفس وصمة عار لا يمك.......

Discussion

القدرة على قياس مستويات البروتين في أوائل الفأر الجنينية وكتكوت المناطق صمام القلب توفر أداة إضافية لفهم الأحداث الإشارات الخلوية الحرجة للتنمية صمام. لدينا بروتوكول الموصوفة هنا لا تختلف كثيرا من إجراءات عزل بروتين القياسية. ومع ذلك، عن طريق تعديل بعض الخطوات الرئيسية، التي حصلنا عليها بنجاح البروتينات فسفرته من أحجام عينة صغيرة للغاية. لتحقيق هذه النتيجة، والخطوات التالية هي ذات أهمية خاصة. لضمان الحصول على جودة البروتين، من الأهمية بمكان للحفاظ على عينات مبردة، سواء على الجليد .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
فأر			ليتم تشريحه في المرحلة الجنينية من الاهتمام
المجهر المجهر المجسم	نيكون	SMZ645
0.1 M تريس ، درجة الحموضة 7.6
مقص	أدوات العلوم الدقيقة	15003-08
ملقط دقيق ، # 5	أدوات العلوم الدقيقة	11251-30
إبرة تشريح حاملي	شركة تيد بيلا	13560
تشريح الإبر	شركة تيد بيلا	13561-10
ماصة دقيقة, 20 & mu; ل ، مع نصائح
عازلة			50 ملي Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي EDTA ، 1٪ تريتون
فوسستوب	روش	4906845001	أضف 1 قرص إلى 10 مل عازلة التحلل
TissueLyser LT	Qiagen	85600
حبات الفولاذ المقاوم للصدأ	Qiagen	69989
الطرد