مقالة منهجية

عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية

DOI:

10.3791/51911

⸱

سبتمبر 23, 2014

 ,  , 
1McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 2New York-Presbyterian Hospital/Weill-Cornell Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إعاقة تحليل تعبير البروتين في صمامات الفأر الجنينية الصغيرة بسبب الأنسجة المحدودة المتاحة. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا لإعداد البروتين من تطوير مناطق صمام الفأر الجنيني لتحليل اللطخة الغربية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل اللطخة الغربية هو أسلوب شائع الاستخدام للكشف عن مستويات البروتين وقياسها. ومع ذلك ، بالنسبة لعينات الأنسجة الصغيرة ، قد لا تكون طريقة التحليل هذه حساسة بما يكفي للكشف عن البروتين ذي الأهمية. للتغلب على هذه الصعوبات ، قمنا بفحص بروتوكولات الحصول على البروتين من صمامات القلب البشرية البالغة وقمنا بتعديل هذه البروتوكولات لنظرائهم في الفئران الجنينية المبكرة. باختصار ، يتم جمع مناطق الصمام الأبهري الجنيني للفأر ، بما في ذلك الصمام الأبهري وجدار الأبهر المحيط به ، في أقل حجم ممكن من مخزن التحلل القائم على تريس مع مثبطات الإنزيم البروتيني. إذا لزم الأمر بناء على استراتيجية التكاثر ، يتم تنميط الأجنة جينيا قبل تجميع أربع مناطق للصمام الأبهري الجنيني للتجانس. بعد التجانس ، يتم استخدام مخزن مؤقت للعينة المستند إلى SDS لتغيير طبيعة العينة للتشغيل على هلام SDS-PAGE وتحليل اللطخة الغربية اللاحقة. على الرغم من أن تركيز البروتين لا يزال منخفضا جدا بحيث لا يمكن تحديده باستخدام فحوصات القياس الكمي للبروتين الطيفي ووجود عينة متبقية للتحليلات اللاحقة ، إلا أنه يمكن استخدام هذه التقنية لاكتشاف البروتينات المفسفرة وشبه كميتها بنجاح عبر اللطخة الغربية من عينات مجمعة لأربع مناطق جنينية للصمام الأبهري للفأر 13.5 ، ينتج كل منها ما يقرب من 1 ميكروغرام من البروتين. ستكون هذه التقنية مفيدة لدراسة تنشيط مسار إشارات الخلية ومستويات التعبير عن البروتين أثناء التطور المبكر لصمام الفأر الجنيني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أن تكون قادرة على تحديد وقياس مستويات البروتين التعبير هو أسلوب القياسية لالحيواني والتجارب القائمة على الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الفائدة في وقت مبكر الجنينية تطوير صمام القلب، وتقييم البروتين التعبير في هذا النسيج محددة خلال تطوير يقتصر حاليا على المناعية في كل من الفرخ والفأر 1،2 طويل الأمد. جزء من صعوبة تحديد كمية البروتين التعبير في صمامات تطوير معظم الكائنات نموذج (مثل الفرخ والفأر) هو صغر حجم الصمامات، مما يحد من كمية البروتين التي يمكن الحصول عليها. وهكذا، على التحليلات الكمية، يعتمد الباحثون عادة على استخراج الحمض النووي الريبي والتضخيم PCR الكمي لاحقة أو تحليل ميكروأري 2-5. ومع ذلك، RNA والبروتين مستويات التعبير ليست المترابطة 6 بالكامل، بحيث يمكن التركيز على التعبير RNA لا توفر حساب دقيق للتغيرات العديدة التي تحدث في أي إشارات معينةالمسار في أوقات مختلفة خلال التطورات. واستنادا إلى هذا الحد في المنهجية المتاحة حاليا، وكان الهدف من هذا الإجراء لوضع بروتوكول للحصول موثوق كميات كافية من البروتين من الفأر الجنينية المناطق صمام القلب النامية من أجل التحليل الكمي للتغيرات التي تحدث في مختلف مسارات الإشارات التي تعتبر مهمة في نضوج هذا النسيج.

وبالفعل تشريح الصمامات عادة من الفئران الجنينية لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل الجينات لاحق التعبير 2-5. ولكن هذه الدراسات اقتصرت على استخدام التعبير الجيني باعتبارها من قراءة إشارات من تفعيل المسار، والتي لا تسمح للكشف عن الكشف عن تعديلات البروتين بعد متعدية التي قد تؤثر إشارات المصب. باستخدام تقنيات العزل RNA كنقطة انطلاق، بدأنا مع تشريح المناطق ذات الأهمية. لأن مصلحتنا تم الكشف عن البروتينات فسفرته التي كانت مؤشرا يدل باتالنشاط hway خلال فترة محددة من تطوير الصمام الأورطي (E13.5-14.5)، أجرينا كل تشريح خالية من الفوسفات في تريس العازلة وجمع الصمامات في تحلل العازلة على أساس تريس، مع الفوسفاتيز ومثبطات الأنزيم البروتيني. في حالتنا هذه، تم جمع المناطق صمام الأبهري فقط، ولكن يمكن بسهولة الحصول عليها المنطقة صمام رئوي في نفس الوقت. كانت المناطق صمام ثم متجانسة وجنبا إلى جنب مع عينة العازلة التي تستخدم حاليا لدراسة التعبير البروتين في صمامات القلب الكبار 7. باستخدام وحدات التخزين عينة صغيرة (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر) وتجميع صمام المناطق من أجنة بنفس النمط الجيني، تمكنا من الكشف عن بروتينات فسفرته وnonphosphorylated في اليوم الجنينية 13.5 8. لأن المناطق صمام يمكن تجميدها وتخزينها في المخزن تحلل، يمكن التنميط الجيني لأجنة إذا لزم الأمر قبل تجميع.

هذه التقنية يوسع مجموعة من الأدوات المتوفرة لتقييم signalin خليةز مسارات خلال تطوير وتقدم مجاملة الكمية لالمناعية، وتحديدا لصمامات القلب النامية. وينبغي أن يكون هذا الأسلوب مفيدا ليس فقط لأطباء القلب التنموية ولكن أيضا لجميع علماء البيولوجيا التطورية الذين يعملون مع الأجنة مرحلة مبكرة يرغبون في المناطق التي تحتوي على الأنسجة محدودة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كارولينا الشمالية في تشابل هيل.

1. المكوس الصمام الأبهري

  1. باستخدام تقنية القتل الرحيم المعتمدة للمرحلة الجنينية من الفائدة، الموت ببطء ماوس حاملا مع الجراء في اليوم الجنينية المطلوب (E) للتنمية.
  2. استخدام الايثانول 70٪ لتعقيم البطن للإناث الحوامل. رفع الجلد وعضلات أسفل البطن وحتى بعيدا عن الأعضاء الداخلية، وتشريح تجويف أسفل البطن مفتوحة الأنثى للسماح بالوصول إلى قرن الرحم.
  3. لاسترداد قرن الرحم، عنق الرحم عقد مع ملقط وقطع بعناية الذيلية إلى ملقط. رفع قرن الرحم، وقطع أي نوع من الأنسجة الضامة التي تحافظ على القرن في مكان، وإتمام إزالة بقطع تقاطع قرن الرحم مع قناة البيض.
  4. وضع قرن الرحم تشريح في طبق بتري تحتوي على عمودد 0.1 M تريس العازلة (درجة الحموضة 7.6) وشطف حسب الحاجة. ثم، وقطع قرن الرحم مفتوح طول الحكمة لفضح الحويصلات الجنينية.
  5. للكشف عن الجنين، وقطع فتح الكيس الجنيني عند تقاطع المشيمة والجنين وقطع الأوعية الدموية السرية لتحرير الجنين. وضع الجنين تشريح في طبق بيتري الثاني مع بارد 0.1 M تريس العازلة. يعود أول طبق بيتري مع باقي الأجنة لundissected الجليد حتى جاهزة للجنين المقبل.
  6. لتحسين فرص الحصول جدار الصدر داخل الجنين، قطع رأس الجنين. إذا التنميط الجيني ضروري، وإزالة وحفظ قطعة النسيج إضافية في أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد.
  7. وضع الجنين على ظهرها، وقطع جدار الصدر عموديا على طول الجانب من القفص الصدري، بالقرب من forelimb، وأفقيا فوق الحجاب الحاجز لتصور القلب. ثم فتح جدار الصدر لفضح القلب.
  8. باستخدام ملقط لنرفع عاليا على طول الأوعية الدموية الكبرى، ورفع القلب باستخدام ملقط وقطع الأوعية أدناه. ون، وقطع فوق ملقط لتحرير القلب. إذا بقيت الأوعية الرئوية غير المصقول، قد تتم إزالة الرئتين مع القلب ويجب إزالتها قبل المتابعة.
  9. قطع وإزالة الشريان الرئوي فوق مستوى صمام. في المراحل الجنينية الموصوفة هنا، الشريان الرئوي هو معتم قليلا، والذي يساعد في تمييز لها من منطقة صمام. قطع أسفل صمام الرئوي، وتجنب عضلة القلب البطيني trabeculated وجمع كما هو موضح في الخطوة 1.10 إذا هذه المنطقة هي أيضا من الفائدة. وهنا في الخطوة التالية، استخدام العمل الشعري لرسم عازلة تريس الزائدة بعيدا عن منطقة الفائدة قبل جمع في تحلل العازلة.
  10. إزالة بعناية الأبهر القاصي إلى الصمام الأبهري، وذلك فوق مستوى صمام. مثل الشريان الرئوي، لا يزال الشريان الأورطي مبهمة قليلا في هذه المراحل الجنينية، والمساعدة في زواله. مجرد قطع تحت الصمام الأبهري، ومرة ​​أخرى تجنب عضلة القلب البطيني trabeculated، ونقلصمام باستخدام ملقط لأنبوب إيبندورف مع 2 ميكرولتر تحلل العازلة (موضح في الجدول المواد) التي تحتوي على الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز مثبطات على الجليد.
  11. كرر الخطوات 1،6-1،10 حتى يتم رفعه الصمامات من جميع الأجنة، وجمع كل صمام في أنبوب إيبندورف منفصل. إذا كان كل الأجنة لديها نفس التركيب الوراثي، يمكن جمع جميع الصمامات في أنبوب إيبندورف واحد.
  12. إذا التنميط الجيني التي يتعين القيام بها لتحديد الصمامات لتجميع، ضع على الفور العينات في تحلل العازلة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. ويمكن بعد ذلك يتم تجميع العينات بعد التنميط الجيني (الخطوة 2.1.1).

استخراج البروتين 2.

  1. ذوبان الجليد الأنسجة التي تم جمعها على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 13،100 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع الأنسجة العازلة في تحلل في أسفل الأنبوب.
    1. إذا كانت مرمزة الأجنة، استخدم ماصة لجمع بلطف وتجمع المخزن المؤقت تحلل تحتوي على مناطق صمام من الأجنة مع الأنماط الجينية مماثلة. لضمان ب قويةو، وتجميع صمام 3-4 المناطق من أجنة E13.5 لكل يوصى العينة.
    2. إذا كانت جميع الأجنة من نفس النمط الجيني وجمعت جميع المناطق صمام معا في الخطوة 1.10، ليز العينة بأكملها، كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  2. تحقق من حجم العينة المجمعة الناتجة عنها، وإضافة العازلة تحلل إلى إجمالي حجم 40 ميكرولتر. ثم، وتعطيل والتجانس العينات باستخدام حبات الفولاذ المقاوم للصدأ 5 ملم في أنابيب إيبندورف. تشغيل ايزر لمدة 2-4 دقائق عند 50 هرتز، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تدور الأنابيب لفترة وجيزة، (~ 13،100 x ج لمدة 1 دقيقة)، ونقل العينات إلى أنابيب جديدة، مخلفين وراءهم حطام غير قابلة للذوبان.
  3. إعداد وعينات منفصلة للSDS-PAGE ونقل لاحقا تحليل لطخة الغربي، بعد بروتوكول مثل اسلامي وآخرون 9. النشاف لبروتين السيطرة تحميل ضروري لالبروتين الكمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذه التقنية إعداد، تمكنا من كشف فسفرته لل Smad 1،5،8 (pSmad) في مناطق الصمام الأورطي واحدة من E13.5 الأجنة. كما هو مبين في الشكل 1A، البروتين معزولة حتى من منطقة صمام واحدة كافية لكشف عصابة pSmad باهتة. كثافة إشارة تزيد نسبيا إلى عدد من المناطق صمام التي يتم تجميعها. الأهم من ذلك، لا تزال pSmad / β-أكتين نسبة ثابتة تقريبا في جميع أنحاء أحجام العينات المختلفة (الشكل 1C). نظرا لانخفاض مستويات البروتين المتاحة، نفس وصمة عار لا يمك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على قياس مستويات البروتين في أوائل الفأر الجنينية وكتكوت المناطق صمام القلب توفر أداة إضافية لفهم الأحداث الإشارات الخلوية الحرجة للتنمية صمام. لدينا بروتوكول الموصوفة هنا لا تختلف كثيرا من إجراءات عزل بروتين القياسية. ومع ذلك، عن طريق تعديل بعض الخطوات الرئيسية، التي حصلنا عليها بنجاح البروتينات فسفرته من أحجام عينة صغيرة للغاية. لتحقيق هذه النتيجة، والخطوات التالية هي ذات أهمية خاصة. لضمان الحصول على جودة البروتين، من الأهمية بمكان للحفاظ على عينات مبردة، سواء على الجليد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر أندريا بورتبري ودافين تاونلي تيلسون على القراءة النقدية للمخطوطة والمعاهد الوطنية للصحة (المنحة # R01HL061656) لتمويل الدعم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فأرليتم تشريحه في المرحلة الجنينية من الاهتمام
المجهر المجهر المجسمنيكونSMZ645
0.1 M تريس ، درجة الحموضة 7.6
مقصأدوات العلوم الدقيقة15003-08
ملقط دقيق ، # 5أدوات العلوم الدقيقة11251-30
إبرة تشريح حامليشركة تيد بيلا13560
تشريح الإبرشركة تيد بيلا13561-10
ماصة دقيقة, 20 & mu; ل ، مع نصائح
عازلة50 ملي Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي EDTA ، 1٪ تريتون
فوسستوبروش4906845001أضف 1 قرص إلى 10 مل عازلة التحلل
TissueLyser LTQiagen85600
حبات الفولاذ المقاوم للصدأQiagen69989
الطرد
حامل موقوت دقيق التحلل أجهزة المركزي الدقيقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
  2. Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
  3. Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
  4. Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
  5. Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
  6. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
  7. Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
  8. Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
  9. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  10. Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
  11. Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Development. 127, 1607-1616 (2000).
  12. Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
  13. Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS PAGE 13 5

مقالات ذات صلة