السموم العصبية البوتولينوم هي واحدة من أقوى السموم بين عوامل التهديد البيولوجي من الفئة أ ، ومع ذلك لا يتوفر علاج ما بعد التعرض. يعد نهج التصوير عالي المحتوى منهجية قوية لتحديد مثبطات جديدة لأنه يتيح الفحص متعدد المعلمات باستخدام الخلايا العصبية الحركية ذات الصلة بيولوجيا ، وهو الهدف الأساسي لهذا السم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ارتفاع الفحص التصوير المحتوى لتحديد البوتولينوم السموم العصبية المانعون
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بروتين 25 المرتبط بالمشبكي 25 (SNAP-25) هو أحد مكونات مركب مستقبلات البروتين المرتبط ب NSF القابل للذوبان (SNARE) وهو ضروري لإطلاق الناقل العصبي المتشابك. النمط المصلي للسموم العصبية البوتولينوم A (BoNT / A) هو متاعز الزنك الذي يمنع إفراز الخلايا للناقل العصبي عن طريق شق مكون SNAP-25 لمركب SNARE. لا توجد حاليا أدوية مرخصة لعلاج التسمم ب BoNT / A بعد استيعاب السم بواسطة الخلايا العصبية الحركية. كان تطوير تدابير علاجية فعالة لمواجهة تسمم BoNT / A محدودا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود فحوصات قوية عالية الإنتاجية لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة. نصف هنا مقايسة التصوير عالي المحتوى (HCI) مع فائدة لتحديد مثبطات BoNT / A. ركزت جهود التحسين الأولية على تحسين قابلية استنساخ النتائج بين الألواح عبر تجارب متعددة ومستقلة. تم العثور على أتمتة التلوين المناعي والحصول على الصور وتحليل الصور لزيادة اتساق الفحص وتقليل التباين مع تمكين التقييم متعدد المعلمات للمركبات التجريبية في نظام الخلايا العصبية الحركية للفئران.
المقدمة
وبكتيريا كلوستريديوم البوتولينوم تنتج عصبي البوتولينوم، واحدة من السموم البيولوجية أقوى لرجل معروف 1. هناك 7 عترات متميزة بونت (بونت / AG). بونت / A-غال لحث الشلل في الوصل العصبي العضلي بسبب كمين التحلل البروتيني المعقد 2،3. فخ التحلل البروتيني يمنع العصبي-حويصلة الغشاء الانصهار، وبالتالي كتل العصبي إيماس 4. الهدف كمين محدد يعتمد على المصلي بونت معين المشاركة في عملية التسمم. بونت / A وبونت / E يلتصق SNAP-25 بينما يشق بونت / C كلا SNAP-25 و syntaxin 5. الأنماط المصلية المتبقية synaptobrevin يلتصق (وتسمى أيضا الحويصلة يرتبط البروتين غشاء (VAMP). وقد تم اختيار بونت / A للتنمية ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
لوحة الماوس 20،000 متباينة خلايا ES (MES) / جيد في 96 بولي D يسين المغلفة لوحات جيدة والحفاظ على الخلايا العصبية الحركية في وسائل الإعلام محطة التمايز لمدة 5-7 أيام.
1. إدارة المجمع والتسمم مع بونت / A
تنفيذ كافة الأعمال التالية في الضميمة BSL2 للحفاظ على الامتثال للمبادئ التوجيهية CDC / المعاهد الوطنية للصحة.
- إعداد 10 ملم حلول المخزون من كل مجمع المكتبات في DMSO 100٪ البولي بروبلين في 96 لوحات جيدة. اس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
خلقت البيانات من الضوابط ارتفاع وانخفاض اثنين من السكان متميزة مع الفرق اثنين من الوساطات تتجاوز 3 انحرافات معيارية (الشكل 7A). الهدف من عملية الفرز هو العثور على المركبات داخل العينة مع القيم أقرب إلى السكان السيطرة إيجابي، على افتراض التوزيع الطبيعي ضمن العينة (الشكل 7B، (ط)). وتعتبر نقاط البيانات التي هي 3 انحرافات معيارية خارج يعني إحصائيا مختلفا عن الضوضاء وتصنف على أنها "ضرب" النشط (7B الشكل (II)، مربعات حمراء). سيتم إخضاع ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أدى رجولية عالية من أعصاب البوتولينوم والسهولة النسبية للتسليح في تصنيفها ضمن الفئة ألف (أولوية قصوى) وكلاء biothreat من المراكز الامريكية لمكافحة الامراض والوقاية منها. لسوء الحظ، هناك علاجات وافقت ادارة الاغذية والعقاقير لا بونت لمواجهة التسمم بعد أن تم المنضوية السم من قبل الخلايا العصبية الحركية. أي آلية druggable تعزز انتعاش العصبية من بونت التسمم قد يؤدي نحو تطوير علاج محتمل لحماية كل من القوات المسلحة والجمهور ضد هذا التهديد البيولوجي. في هذه المقالة، نقدم HCI بروتوكول فحص .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
كريشنا بي كوتا هو موظف في شركة Perkin Elmer Inc. Waltham ، MA ، التي تنتج الأدوات والبرامج المستخدمة في هذه المخطوطة. لا يعكس محتوى هذا المنشور بالضرورة وجهات نظر أو سياسات وزارة الصحة والخدمات الإنسانية الأمريكية أو وزارة الدفاع الأمريكية أو وزارة الجيش الأمريكية أو المؤسسات والشركات التابعة للمؤلفين.
شكر وتقدير
تم توفير التمويل من قبل المكتب المشترك للعلوم والتكنولوجيا - الدفاع البيولوجي الكيميائي (JSTO-CBD) وكالة الحد من التهديدات الدفاعية (DTRA) تحت مشروع الراعي رقم CCAR # CB3675 والمعاهد الوطنية للصحة (1 R21 AI101387-01 و 5 U01AI082051-05).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| توكسين البوتولينوم العصبي A | Metabiologics | NA | لا يوجد رقم كتالوج |
| لوحات Microtitre | Greiner | 655946 | بولي دي ليسين 96 بئر لوحات |
| BACs الأجسام المضادة | لامباير البيولوجية | NA | |
| ميكروكيم | الوطنية ؛ | 0255 | |
| ميثانول | حراري علمي | A412-20 | |
| الفورمالديهايد | الحراري العلمي | 28908 | |
| مصل الحصان | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT محطة عمل أوتوماتيكية صغيرة | بيركين إلمر | AJMDT01 | |
| أوبرا | بيركين إلمر | OP-QEHS-01 | |
| تريتون X-100 | سيجما ألدريتش | 9002-93-1 | |
| BIII الأجسام المضادة للتوبولين | R & D أنظمة | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus برامج تحليل الصور | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox مبيض | فيشر Scientific | 18-861-284 | |
| بليت ستاك |
المراجع
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
