مقالة منهجية

جيل من الأمعائية س. YSU Auxotrophs عن طريق الطفرات ينقول

DOI:

10.3791/51934

⸱

أكتوبر 31, 2014

1Department of Biological Sciences, Center for Applied Chemical Biology, Youngstown State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأمعائية س. YSU تنمو في الجلوكوز الحد الأدنى من الأملاح المتوسطة. يتم إنشاء Auxotrophs عن طريق تحويل ذلك مع transposome الذي إدراج نفسها عشوائيا في جينوم المضيف. تم العثور على المسوخ بواسطة الطلاء المتماثلة من المتوسطة معقد إلى الحد الأدنى من المتوسط. يتم تحديد جينات الانقاذ توقفت بسبب الجينات وتسلسلها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنموذجية التغذي البكتيريا تنمو على M-9 الأملاح الحد الأدنى تستكمل المتوسطة مع الجلوكوز (M-9 المتوسطة)، والذي يستخدم كمصدر للكربون والطاقة. يمكن أن تتولد Auxotrophs باستخدام transposome. المتاحة تجاريا، TN 5 transposome -derived المستخدمة في هذا البروتوكول يتكون من شريحة خطي من الحمض النووي الذي يحتوي على R6K أصل النسخ γ، جين المقاومة الكانامايسين واثنين تسلسل الفسيفساء تنتهي، والتي تكون بمثابة ترانسبوزاز ملزمة المواقع. وtransposome، على النحو المنصوص عليه مجمع بروتين DNA / ترانسبوزاز، هو عرض بواسطة الصعق الكهربائي في سلالة بدئية الاغتذاء، الأمعائية س. YSU، ويشتمل على نفسها عشوائيا في جينوم هذا المضيف. Transformants هي نسخة مطلية على لوريا، Bertani أجار لوحات تحتوي على كانامايسين، (LB-اساسه) وعلى لوحات أجار M-9 متوسطة تحتوي على كانامايسين (M-9-اساسه). تعتبر transformants التي تنمو على لوحات LB-اساسه ولكن ليس على لوحات M-9-أن يكون اساسه auxotrophs. الجينومية النقىيتم هضم الحمض النووي من عوني التغذي جزئيا، و ligated وتحولت الى البير + الإشريكية القولونية (إي كولاي) سلالة. تكرار أصل R6Kγ يسمح البلازميد إلى تكرار في البير + E. سلالات القولونية، والمقاومة علامة كانامايسين تسمح لاختيار البلازميد. كل المحولة يمتلك البلازميد جديد يحتوي على ينقول يحيط بها المنطقة الكروموسومات انقطاع. سانجر تسلسل والأساسية المحلية محاذاة أداة البحث (انفجار) تشير إلى الهوية المفترضة من الجين توقف. هناك ثلاث مزايا لاستخدام هذه الاستراتيجية الطفرات transposome. أولا، أنها لا تعتمد على التعبير عن الجينات ترانسبوزاز من قبل المضيف. الثاني، هو عرض transposome إلى المضيف الهدف بواسطة الصعق الكهربائي، وليس عن طريق الاقتران أو عن طريق التنبيغ وبالتالي أكثر كفاءة. ثالثا: تكرار أصل R6Kγ يجعل من السهل تحديد تحور زالشم الذي تعافى جزئيا في البلازميد المؤتلف. هذه التقنية يمكن استخدامها للتحقيق في الجينات المسؤولة عن الخصائص الأخرى للالأمعائية س. YSU أو من مجموعة متنوعة من السلالات البكتيرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنموذجية التغذي البكتيريا تنمو في M-9 الأملاح التي تحتوي على الحد الأدنى من متوسط ​​الجلوكوز (M-9 المتوسطة)، وتحويل الجلوكوز من خلال مسارات الأيض الكربون المركزية لتوليد السلائف، مثل الأحماض الأمينية، والأحماض النووية والفيتامينات، ل1 الحيوي. M-9 المتوسطة يحتوي على كلوريد الأمونيوم كمصدر النيتروجين والفوسفات والبوتاسيوم والصوديوم كمنطقة عازلة ومصدر الفوسفور، كبريتات المغنيسيوم كمصدر الكبريت والجلوكوز كمصدر للكربون والطاقة. لوريا، Bertani (LB) متوسطة غنية في الأحماض الأمينية من تريبتون والفيتامينات وعوامل النمو من خلاصة الخميرة. وهو يدعم نمو auxotrophs التي لا يمكن توليف الأحماض الأمينية والفيتامينات وعوامل النمو الأخرى المطلوبة للنمو على M-9 متوسطة. وبالتالي، سوف prototrophs تنمو في LB M-9 والمتوسطة، في حين auxotrophs سوف تنمو في LB المتوسطة ولكن ليس في M-9 متوسطة. من خلال تقديم الطفرات في عدد السكان بدئية الاغتذاء من البكتيريا وتحديد الجينات الطافرة التي تسبب الظواهر بعامل نمائي، هو بوssible للحصول على فهم أفضل لعملية الأيض في سلالة بكتيرية.

ويمكن استخدام ينقول الطفرات لتحديد العديد من الجينات المطلوبة للنمو على مستوى السكر في M-9 متوسطة. الترانسبوزونات إدراج نفسها عشوائيا في جينوم المضيف 2. قبل اكتشاف transformants ينقول على لوحات أجار LB نسخة والطلاء لهم على لوحات M-9 المتوسطة أجار، فمن الممكن للكشف عن auxotrophs. يتم تحديد جينات توقف من خلال إنقاذ الجينات. تستخدم هذه الدراسة متاحة تجاريا تينيسي 5 -derived transposome التي يتم شحنها كحل للشريحة الحمض النووي ينقول الخطي مختلطة مع البروتين ترانسبوزاز. قطاع DNA تفتقر إلى الجين ترانسبوزاز ولكن يحتوي على الجينات المقاومة الكانامايسين، وهو R6K تكرار γ المنشأ واثنين من الزخارف الفسيفسائية التي هي تسلسل الحمض النووي لترانسبوزاز ملزم في نهاية كل قطعة 3،4. منذ يتم إضافة بروتين ترانسبوزاز مباشر على الحمض النووي، والجزء الحمض النووي وحدهيعرف بأنه ينقول، ويعرف مجمع بروتين DNA / ترانسبوزاز باسم transposome. وحولت transposome بواسطة الصعق الكهربائي 5 إلى المضيف حساسة الكانامايسين (الشكل 1A). المستعمرات التي تنمو على لوحات أجار LB تحتوي على كانامايسين (LB-اساسه) لديها إدراج ينقول (الشكل 1B)، ونسخة مطلية transformants التي لا تنمو على M-9 لوحات المتوسطة أجار التي تحتوي على كانامايسين (M-9-اساسه) هي auxotrophs (Figire 1C). الحمض النووي الجيني من المسخ هو النقى ويهضم جزئيا مع 4-قاعدة تقييد القطع نوكلياز داخلية، الاتحاد البلغاري CI (الشكل 1D). يتم تحويل الحمض النووي و ligated الى سلالة من القولونية (إي كولاي) الذي يحتوي على الجينات البير (الشكل 1E). يسمح هذا الجين البلازميد جديد يحتوي على ينقول والمنطقة المحيطة الكروموسومات المضيفة لتكرار في E. القولونية 6. ويعمل هذا الجين المقاومة الكانامايسين مثلعلامة جدير بالانتخاب لالبلازميد الجديد. أخيرا، تسلسل باستخدام بادئات مكملة لبعضها نهاية ينقول والأساسية المحلية محاذاة أداة البحث (انفجار) 7،8 تحليل تسلسل الناتجة تستخدم لتحديد هوية الجينات توقف.

وتنص هذه الاستراتيجية transposome الطفرات ثلاث مزايا 3. أولا، لأن البروتين ترانسبوزاز لا بد مباشرة إلى ينقول، الإدراج لا يعتمد على التعبير عن الجينات ترانسبوزاز داخل المضيف. مرة واحدة يدمج ينقول نفسه في جينوم المضيف، مع تدهور ترانسبوزاز، ومنع حركة إضافية لينقول. ومع ذلك، حركة إضافية لا يمكن منعها إذا كان المضيف يمتلك الذاتية عنصرا transpositional تينيسي 5. ثانيا، إدخال transposome بواسطة الصعق الكهربائي يجعل من الممكن استخدامها في مجموعة واسعة من المضيفين. كما أنه يزيل الحاجة إلى إدخال ينقول طريق الاقتران البكتيري أو السادسإصابة راؤول. تتطلب كلتا العمليتين قابلية المضيف. ثالثا، إدراج الجينات المقاومة الكانامايسين وR6K تكرار γ الأصل في transposome يجعل من الاسهل لتحديد الجين توقف. المناطق ينقول انقطاع ويمكن تخزين والتسلسل كما البلازميدات، مما يلغي الحاجة إلى استخدام سلسلة رد فعل البلمرة العكسية (PCR) تقنية لتحديد الجينات.

بروتوكول المعروضة في هذا الفيديو يصف كل خطوة لينقول الطفرات من الأمعائية س. YSU 9 باستخدام transposome من عرضه في الخلايا البكتيرية إلى تحديد الجين المفترض أنها توقفت. بالإضافة إلى البروتوكولات نشرت سابقا 3،4،10، يتم عرض طرق مفصلة لاستخدام الطلاء طبق الأصل للكشف عن auxotrophs. ويمكن استخدام هذه التقنية الطفرات عن التحقيق في الظواهر الأخرى، مثل المضادات الحيوية والمعادن المقاومة، في أنواع مختلفة من البكتيريا، لIDENTifying عدد ضئيل من الجينات المطلوبة للنمو في ظل ظروف ثقافة المحددة في دراسات علم الأحياء الاصطناعية، أو لتعليم عنصرا مختبر لعلم الوراثة أو علم وظائف الأعضاء بالطبع الميكروبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Electroporation للخلايا المختصة 5،11

  1. تمييع لO / N ثقافة LB من الأمعائية س. YSU 1/20 إلى 50 مل من الطازجة المتوسطة LB وتنمو مع اهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية إلى التطوير التنظيمي (600 نانومتر) بين 0.4 و 0.6. اختياريا، وتنمو سلالات بكتيرية أخرى في درجة حرارة النمو الأمثل لها.
  2. هدئ الخلايا على الجليد لمدة 5 دقائق وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 7،000 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. تجاهل طاف، resuspend الخلايا في 50 مل من الماء المعقم البارد الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 7000 x ج لمدة 5 دقائق. كرر هذه الخطوة.
  4. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في حجم جليد الماء البارد مساويا لحجم بيليه الخلية. للتخزين على المدى الطويل، وغسل الخلايا مع 10 مل من الجليد الباردة بنسبة 10٪ (V / V) الجلسرين، resuspend في أي حجم بيليه مساو من الجليد الباردة بنسبة 10٪ (V / V) الجلسرين وتخزينها في -80 درجة مئوية، وذوبان الجليد على الجليد قبل Electroporation لل.
  5. إضافة 0.5 ميكرولتر من transposome إلى 40 ميكرولتر منالخلايا. يتم توفير حل transposome متاحة تجاريا في تركيز الحمض النووي من 0.33 ميكروغرام / ميكرولتر. على الرغم من 0.33 ميكروغرام يوصى، 0.165 ميكروغرام DNA كافية.
  6. ضع الخليط خلية / transposome في البرد الجليدي، 0.2 ملم، كفيت electroporation والاستفادة من هذا المزيج على الجزء السفلي من كفيت. صدمة الخلايا عند 25 μF، 200 Ω، و 2.5 كيلو فولت. للتأكد من أن الخلايا تبقى المبردة، تخزين cuvettes Electroporation للفي -20 درجة مئوية الثلاجة قبل الاستخدام.
  7. على الفور، إضافة 960 ميكرولتر من فلتر تعقيم مرق السوبر الأمثل مع مقيضة القمع (SOC) متوسطة. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا ونقل الخلايا إلى العقيمة 1.5 مل microfuge أنبوب.
    ملاحظة: هذه الخلايا تبدأ في الموت بعد الصدمة، ولكن الملح في المتوسط ​​SOC يسمح لهم باسترداد. للاقتصاد، فإنه ليس من الضروري إضافة transposome أو لصدمة الخلايا السيطرة السلبية. فقط إضافة 960 ميكرولتر من العقيمة المتوسطة SOC إليها.
  8. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية وأو 45-60 دقيقة مع اهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة. وهذا يوفر الوقت للtransposome لتتحد مع جينوم المضيف وللخلايا للتعبير عن المقاومة الكانامايسين.
  9. نشر 100 ميكرولتر من الخلايا على لوحة أجار LB-كان واحتضان لوحة O / N عند 30 درجة مئوية. تخزين مزيج التحول المتبقية في الثلاجة على 4 درجات مئوية. تنتشر كميات إضافية في وقت لاحق تصل إلى 2 أسابيع بعد Electroporation للالأولي إذا لزم الأمر.

2. Gridding من Transformants

  1. الشريط على الشبكة لغطاء علبة فارغة 100 × 15 مم طبق بتري. نسخ من شبكة "دورة قصيرة في علم الوراثة البكتيرية" (12).
  2. رسم خط على الجزء السفلي من لوحة أجار LB-اساسه. استخدام قطعة صغيرة من الشريط لتثبيته على غطاء الشبكية بحيث يكون مرئيا من خلال شبكة آغار. تأكد من أن الخط على الجزء السفلي من لوحة تتماشى مع أعلى، وسط الشبكة. ترسيخ وحة مع الشريط يحفظه من الانزلاق، والسماح لحتى gridding. خط يسهل التعرف مستعمرة بعد الطلاء طبق الأصل.
  3. اختيار المحولة واحد مع المسواك العقيمة وبقعة في وسط ساحة في الشبكة. مجرد لمس مستعمرة والبقعة. لا حفر مسواك في أجار. لتجنب تلويث لوحة، والتعامل مع مسواك فقط في نهاية واحدة.
  4. بقعة المحولة آخر في ساحة مجاورة كما في الخطوة 2.3. عندما لوحة ممتلئة، احتضان عليه O / N عند 30 درجة مئوية. هذه هي اللوحة الرئيسية.

3. طبق الطلاء لتحديد النمط الظاهري عوني التغذي 12

  1. لكل لوحة التي تم الشبكية، وجعل كومة من ثلاث لوحات جديدة أجار مرقمة واحد من خلال ثلاثة: واحد للLB-كان، اثنان لM-9-اساسه وثلاثة لLB-اساسه. تجف لوحات رأسا على عقب، O / N، عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. رسم خط على رأس كل لوحة كما في الخطوة 2.2.
  3. مسح أداة الطلاء المتماثلة مع 70٪ من الإيثانول، ضع مربع القطيفة معقمة على الجزء العلوي من الطلاء طبق الأصل لرأ والمشبك مربع القطيفة أسفل. يد تعج الميكروبات حتى بعد غسلها. منع دخول الميكروبات الملوثة عن طريق التعامل مع الساحة القطيفة من قبل حافته.
  4. محاذاة خط على لوحة رئيسية مع خط مرسوم على المشبك ووضع لوحة على الجزء العلوي من مربع القطيفة. تطبيق ضغط لطيف على نقل البكتيريا من لوحة إلى ساحة القطيفة. يجب الحرص على عدم تشويه البكتيريا. إزالة لوحة رئيسية من الساحة القطيفة.
  5. محاذاة الخط الذي رسمته على لوحة رقم واحد مع خط على المشبك ووضعه على قمة الساحة القطيفة. تطبيق ضغط لطيف على نقل البكتيريا من الساحة القطيفة لوحة. إزالة لوحة رقم واحد.
  6. تجاهل مربع القطيفة في كوب من الماء ومكان نظيف ومعقم مربع القطيفة على أداة الطلاء طبق الأصل كما في الخطوة 3.3. هذه الخطوة يمنع الإفراط في التلقيح الذي يسبب نمو اختراق ونتائج إيجابية كاذبة.
  7. محاذاةخط على لوحة رقم واحد مع خط على المشبك ووضعه على قمة الساحة القطيفة جديد. تطبيق ضغط لطيف لنقل البكتيريا من لوحة رقم واحد على الساحة القطيفة. إزالة لوحة رقم واحد.
  8. محاذاة الخط الذي رسمته على لوحة رقم اثنين مع خط على المشبك ووضعه على قمة الساحة القطيفة. تطبيق ضغط لطيف على نقل البكتيريا من الساحة القطيفة لوحة رقم اثنين. إزالة لوحة رقم اثنين.
  9. كرر الخطوة 3.8 لوحة رقم ثلاثة. اللوحة الثالثة هي السيطرة على نقل كامل من لوحة رئيسية لالأخريين لوحات. تجاهل مربع القطيفة في كوب من الماء. إعادة استخدام الساحات القطيفة، الأوتوكلاف الكأس التي تحتوي على الساحات القطيفة الملوثة، وغسلها، وتجفيفها، والانتهاء منها في رقائق الألومنيوم وإعادة الأوتوكلاف-لهم.
  10. احتضان لوحات عند 30 درجة CO / N. وتعتبر المستعمرات التي تنمو على حد سواء لوحات أجار LB-اساسه لكنه يفشل في النمو على لوحات M-9-أن يكون اساسه auxotrophs ( الشكل 2).
  11. خط خارج auxotrophs من لوحة رقم واحد على لوحة جديدة أجار LB-كان، واحتضان لوحة عند 30 درجة CO / N.
  12. خط خارج لعزل 3 مستعمرات من لوحة خط في خطوة 3.11 على لوحة LB-اساسه جديدة. احتضان لوحة عند 30 درجة CO / N. هذا يضمن أن متحولة معزولة جيدا. تقسيم اللوحة إلى الثلثين ومسحة من كل مستعمرة في مقطع واحد.
  13. المستعمرات بقعة من المستعمرات يشوبه من المستمدة من الخطوة 3.12 على لوحة LB-اساسه جديدة لتشكيل الشبكة كما في الخطوات 2،1-2،4. يتم إعادة اختبار كل متحولة في ثلاث نسخ.
  14. تكرار لوحة مرة أخرى كما هو الحال في الخطوات 3،1-3،10 لتأكيد النمط الظاهري عوني التغذي.

4. جين الإنقاذ

  1. تنمو 3 مل O / N ثقافة مستعمرة معزولة متحولة من الخطوة 3.13 في السائل المتوسطة LB اساسه عند 30 درجة مئوية. تنقية الحمض النووي الجيني من 1 مل من ثقافة استخدام الجينومية طقم تنقية الحمض النووي المتاحة تجاريا.
  2. انشاء خليط من 0.025 Uالاتحاد البلغاري CI تقييد نوكلياز داخلية و 14 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / الحمض النووي الجيني ميكرولتر في رد فعل 20 ميكرولتر على الجليد. منذ BFU CI يقطع ينقول في اثني عشر موقعا مختلفا، قد يكون أكثر كفاءة في استخدام نوكلياز داخلية التقييد، منتدى بواو الاسيوى الأول أو الثالث هاي، الذي يقطع ينقول في اثنين وثلاثة مواقع مختلفة، على التوالي.
  3. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ثم في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإبطال نشاط الإنزيم. تحليل 3 ميكرولتر من الحمض النووي يهضم جزئيا على هلام الاغاروز 0.8٪ (الشكل 3). والنتائج الناجحة الهضم جزئية في مسحة من فوق 10 كيلو بايت وصولا الى الجزء السفلي من هلام.
  4. Ligate 15 ميكرولتر من المهضوم جزئيا الحمض النووي الجيني باستخدام 800 وحدة من T4 DNA يغاز في رد فعل ميكرولتر 500. احتضان رد الفعل O / N عند 4 درجات مئوية. حجم رد فعل كبير يزيد من ربط شظايا واحدة لنفسها ويقلل من التفاعل بين اثنين أو أكثر من شظايا الحمض النووي.
  5. Precipitaالشركة المصرية للاتصالات الحمض النووي و ligated من خلال إضافة 50 ميكرولتر من 3 خلات الصوديوم M، ودرجة الحموضة 5.5 و 1 مل من الايثانول 95٪ وذلك في احتضان -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  6. Microfuge الحمض النووي في 4 درجات مئوية و 13500 x ج لمدة 10 دقيقة، ويغسل بيليه مع الايثانول 70٪، جففه في فراغ المكثف الطرد المركزي، و resuspend في 10 ميكرولتر من المياه مجانا نوكلياز. بدلا من ذلك، فإن الحمض النووي يمكن تجفيفها في الهواء RT لمدة 15 دقيقة.
  7. استخدام 4 ميكرولتر من الحمض النووي معلق لتحويل E. كولاي سلالة ECD100D البير أو ECD100D pir116 بواسطة الصعق الكهربائي كما في القسم 1. R6k تكرار γ أصل يتطلب سلالة بكتيرية مع جين بير لتكرار 6. نتائج سلالة البير في البلازميدات نسخة منخفضة، وسلالة pir116 تحتوي على الجين الطافر بير الذي ينتج في البلازميدات نسخة عالية. يحتوي كل المحولة البلازميد الجديد مع ينقول ومنطقة من الصبغي انقطاع (الشكل 1E).
  8. Inoculأكل 5 مل من المتوسط ​​LB اساسه مع مستعمرة واحدة، تنمو O / N مع اهتزاز عند 120 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية، وتنقية DNA البلازميد من يا كامل / N ثقافة استخدام عدة التجارية.
  9. استيعاب 14 ميكرولتر من البلازميد باستخدام تقييد نوكلياز داخلية Xho أولا تأكد من أن الحجم النهائي للتفاعل هو 20 ميكرولتر. يعترف هذا الانزيم موقع في منتصف ينقول في نهاية 5 'من الجينات المقاومة الكانامايسين. تحليل 10 ميكرولتر من عسر الهضم ويهضم البلازميد على agarose هلام 0.8٪ (الشكل 3). يتكون البلازميد من 2 كيلوبايت ينقول بالإضافة المرافقة DNA المضيف.

5. تسلسل الحمض النووي

  1. تسلسل البلازميد باستخدام طقم المتاحة تجاريا التسلسل، الاشعال التي هي مثلي أن كل نهاية ينقول، ونظام تحليل التسلسل الشعري. بدلا من ذلك، قد يتم شحنها البلازميد إلى مؤسسة خارجية للتسلسل.
  2. استخدام معيار الوزن الجزيئي (1 كيلوبايت سلم) فيهلام لتقدير حجم البلازميد. ثم، تقدير عدد نانوجرام (نغ) البلازميد ما هو مطلوب لمدة 50 fmol.
  3. قياس تركيز الحمض النووي البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي في موجات من 260 نانومتر (A 260) و 280 نانومتر (A 280). ضمان طول مسار الضوء من خلال كفيت هو 1 سم. تحديد تركيز بضرب الامتصاصية في 260 نانومتر بنسبة 50 نانوغرام / ميكرولتر. سوف DNA البلازميد جودة عالية لديهم 260 / A 280 النسبة بين 1.8 و 2.0.
  4. حجم الحمض النووي المطلوبة لكل رد فعل التسلسل هو عدد نانوغرام اللازمة ل50 fmol مقسوما على تركيز البلازميد. مزيج حجم البلازميد المطلوبة مع الماء لجلب إجمالي حجم ما يصل الى 10 ميكرولتر.
  5. تسخين الخليط DNA البلازميد / الماء عند 96 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ثم تبريده لRT.
  6. إضافة 8 ميكرولتر من مزيج الرئيسي من عدة التسلسل و 2 ميكرولتر من 1.6 ميكرومتر واحد من الاشعال التسلسل.
  7. فلانخفاض البروتوكول من عدة التسلسل لبرنامج cycler الحرارية وتنظيف التفاعل.
  8. تحليل كل عينة باستخدام نظام تحليل الحمض النووي الشعرية.
  9. استخدام مجموعة من البرامج المتاحة تجاريا لعرض تسلسل الحمض النووي. البحث عن تسلسل "5'-GAGACAG-3"، "وهو BP 7 الأخير من ينقول (الشكل 4). تسلسل قبل نهاية 5 'من هذا القطاع 7 BP ينتمي إلى ينقول. تسلسل بعد 3 'نهاية هذه الشريحة 7 BP ينتمي إلى جينات توقف.
  10. تحديد وظيفة الجينات المحتملة للتوقف باستخدام الأساسية المحلية محاذاة أداة البحث (انفجار) 7،8. استخدم التالي link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . لصق سلسلة من المقاطعةإد جين في خانة البحث، حدد "الآخرين" في إطار قاعدة البيانات وانقر على "انفجار" في أسفل الصفحة. عندما تظهر النتيجة، انتقل لأسفل الصفحة لعرض نتائج المحاذاة (الشكل 5).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحويل الأمعائية س. YSU بواسطة الصعق الكهربائي مع transposome بدأت عشوائي الجينوم الإدراج في جينوم المضيف (الشكل 1A، B). وElectroporation للنجاح أثمرت عدة آلاف من transformants التي نمت على لوحات LB-اساسه. للحصول 300-400، المستعمرات في لوحة متباعدة بشكل جيد، تم تحسين كمية انتشار خليط التحول على كل لوحة أجار LB-اساسه. يتضمن كل المحولة واحد على الأقل إدراج ينقول، ولكن لم يتضح ما اذا انقطع جين مهم للنمو على M-9 وسيط وبدون فحص بواسطة الطلاء طبق الأصل. تم نقل T...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطفرات ينقول باستخدام transposome هي أداة فعالة لتوليد auxotrophs في الأمعائية س. YSU وأنواع أخرى من غرام سلبي وغرام البكتيريا إيجابية 3،4. وقد بدأت هذه العملية عن طريق إدخال transposome -derived تينيسي 5 إلى المضيف بواسطة الصعق الكهربائي. لتحديد المستعمرات مع تدرج، وكان الهدف سلالة untransformed أن تكون حساسة لكانامايسين من أجل تحديد للعلامة المقاومة التي يحملها ينقول. بعض المضيفين تنتج نوكليازات الاقتطاع الداخلية التي تحط من الحمض النووي ينقول قبل أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكاتب ليس لديه ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود الكاتب أن أشكر كل من بلدي الجامعية المستقلة طلاب البحوث وكل من بلدي الميكروبية الفسيولوجيا طلاب الدراسات العليا الذي اختبر أفكاري ينقول الطفرات خلال فصول الربيع 2010-2014. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل قسم العلوم البيولوجية في جامعة ولاية يانجز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
EZ-Tn5 R6K & جاما ؛ ori / KAN-2 Tnp Transposome KitEpicenter (Illumina)TSM08KR
EC100D pir < sup> + < / sup> بكتريا قولونيةEpicentre (Illumina)ECP09500قادرة على تكرار البلازميدات ذات R6K & gamma ؛ أصل النسخ المتماثل برقم نسخة منخفض
EC100D pir-116 Electroefficient E. coliEpicentre (Illumina)EC6P095Hقادرة على تكرار البلازميدات باستخدام R6K & gamma ؛ أصل النسخ المتماثل برقم نسخة مرتفع
5X M-9 أملاحثيرمو فيشرDF048517
لينوكس LB مرقثيرمو فيشرBP1427-2
AgarAmresco، Inc.J637-1KGتحتوي الوسائط الصلبة على 1.6٪ (وزن / حجم) أجار
كبريتات كاناميسين   ؛شركة Amresco، Inc.0408-25Gعند الحاجة ، احتوت الوسائط على 50 & mu ؛ جم / مل كبريتات الكاناميسين
D-Glucose MonohydrateAmresco، Inc.0643-1KG
مستخلص الخميرةAmresco، Inc.J850-500G
التربتونأمريسكو ، إنكJ859-500G
KClسيجما ألدريتشP4504-500G
NaClAmresco، Inc.X190-1KG
MgCl 2< / sub>Fisher ScientificBP214-500
MgSO2< / sub> FisherScientificBP213-1
مرق فائق الأمثل مع قمع الكاتابوليت (SOC) متوسط0.5٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة ، 2٪ (وزن / حجم) التربتون ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي مللي كلوريد < >2< / فرعي > ، 20 ملي مولار MgSO4< / sub> و 20 ملي مولار جلوكوز
BfuC INEBR0636Sالهضم الجزئي للحمض النووي الجيني
Xho INEBR0146Sهضم البلازميد
T4 DNA LigaseNEBM0202S
Nuclease Free WaterAmresco، Inc.E476-1Lلإذابة الحمض النووي المترسب وتفاعلات نوكلياز التقييد
GenomeLab DTCS - مجموعة البدءبيكمان كولتر608120تسلسل الحمض النووي
طقم تنقية الحمض النووي الجينيPromegaA1120A
Wizard Plus SV Minipreps نظام تنقية الحمض النوويPromegaA1460تنقية البلازميد
طبق الأصل طلاء كتلةحراري فيشر09-718-1
مربعات مخمليةثيرمو فيشر09-718-2طبق الأصل تصفيح
PetriStickersمتنوعة التكنولوجيا الحيويةPSTK-1100شبكة لطبق الأصل طلاء
بتري أطباقThermo FisherFB0875712
Gene Pulser IIBioRadElectroporation
Cuvettes & ndash ؛ 2 ممBioExpressE-5010-2
CentriVap DNA فراغ المكثفLabconco7970010تجفيف الحمض النووي
CEQ 2000XL نظام تحليل الحمضالنووي بيكمان كولترالحمض
النووي ناقلات NTI Advance 11.5.0Life Technologies12605099تحليل تسلسل الحمض النووي
كفاءة كهربائية السريع معالج تسلسل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, B. H., Gadd, G. M. Bacterial physiology and metabolism. , Cambridge University Press. Cambridge. (2008).
  2. Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
  3. Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, Clifton, N.J. 55-70 (2011).
  4. Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
  5. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  6. Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
  7. Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), Oxford, England. 1757-1764 (2008).
  8. Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
  9. Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
  10. Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
  11. Ausubel, F., Brent, R., et al. Short Protocols in Molecular Biology. , John Wile., & Sons, Inc. New York, NY. (1997).
  12. Miller, J. H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1992).
  13. Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
  14. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
  15. Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
  16. Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
  17. Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
  18. Zheng, Y. -N., Li, L. -Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BLAST R6K

مقالات ذات صلة