من بقعة 2DE جل لوظيفة البروتين: الدرس المستفاد من HS1 في سرطان الدم الليمفاوي المزمن

Benedetta Apollonio; Maria Teresa Sabrina Bertilaccio; Umberto Restuccia; Pamela Ranghetti; Federica Barbaglio; Paolo Ghia; Federico Caligaris-Cappio; Cristina Scielzo

doi:10.3791/51942

مقالة منهجية

من بقعة 2DE جل لوظيفة البروتين: الدرس المستفاد من HS1 في سرطان الدم الليمفاوي المزمن

DOI:

10.3791/51942

⸱

أكتوبر 19, 2014

Benedetta Apollonio¹^,² , Maria Teresa Sabrina Bertilaccio¹ , Umberto Restuccia³ , Pamela Ranghetti¹ , Federica Barbaglio¹ , Paolo Ghia¹^,⁴ , Federico Caligaris-Cappio¹^,⁴ , Cristina Scielzo¹

¹Division of Molecular Oncology, IRCCS, San Raffaele Scientific Institute, ²Department of Haemato-Oncology, King's College London, ³IFOM, FIRC Institute of Molecular Oncology, ⁴Università Vita-Salute San Raffaele

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف البروتوكول الذي الأزواج اثنين من التقنيات البروتين، وهما 2 الأبعاد الكهربائي (2DE) والطيف الكتلي (MS)، لتحديد أعرب تفاضلي / البروتينات المعدلة بعد متعدية بين اثنين أو أكثر من مجموعات من العينات الأولية. هذا النهج، جنبا إلى جنب مع التجارب الفنية، ويسمح للتحديد وتوصيف علامات / الأهداف العلاجية النذير.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد جزيئات تشارك في بدء الورم والتقدم هو أمر أساسي لفهم البيولوجيا المرض و، نتيجة لذلك، لإدارة السريرية للمرضى. في العمل الحالي سنقوم بشرح النهج بروتيوميك الأمثل للتعرف على الجزيئات المعنية في تطور سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL). في التفاصيل، يتم حلها لست] خلية اللوكيميا بنسبة 2 الأبعاد الكهربائي (2DE) وتصور على أنها "البقع" على المواد الهلامية 2DE. تحليل مقارن لخرائط البروتين يسمح تحديد البروتينات وأعرب تفاضلي (من حيث وفرة والتعديلات بعد متعدية) التي يتم انتقاؤها، معزولة والتي حددها الطيف الكتلي (MS). ويمكن اختبار وظيفة بيولوجية من المرشحين حددها فحوصات مختلفة (أي الهجرة، والتصاق البلمرة F-أكتين)، التي قمنا الأمثل لخلايا اللوكيميا الأولية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، وسرطان الدم البالغين الأكثر شيوعا في الدول الغربية، مستمد من تراكم حيدة النسيلة الأورام الليمفاوية B ⁺ CD5 هو سريريا وغير متجانس جدا. قد تكون موجودة كشكل من أشكال ما قبل بابيضاض الدم، الذي يعرف بأنه الليمفاوية B-خلية وحيدة النسيلة (MBL) ^1،2،3. في حالات أخرى يمكن أن يظهر المرض إما مع مسارا سريريا المتراخي، التي يمكن أن تبقى مستقرة لسنوات قبل أن تحتاج العلاج، أو كمرض chemorefractory التدريجي مع التشخيص الكئيب رغم العلاج. أخيرا، قد تقدم إلى سرطان الغدد الليمفاوية وارتفاع درجة قاتلة في كثير من الأحيان (متلازمة-RS ريختر) ^2،3،4. عادة ما يتم تصنيف المرضى في اثنين من مجموعات فرعية رئيسية هي: التشخيص الجيد والسيئ، استنادا إلى مجموعة من العوامل النذير الذي يقدم معلومات تكميلية بشأن تنبؤ من نتائج المرض والبقاء على قيد الحياة. الأرجح يعكس عدم التجانس السريرية التجانس البيولوجي. وهناك عدد من الوراثية، microenvironmental وموقد تبين أن العوامل llular لنتفق على التسبب بالمرض رغم عدم وجود آليات موحدة تم العثور على ^5. في التفاصيل، وقد أثبتت العديد من الدراسات أن الاختلافات في سياق السريرية للمرض يمكن تفسيره جزئيا من خلال وجود (أو غياب) بعض العلامات البيولوجية التي لها قيمة ^6،7،8 النذير. وأظهرت هذه البيانات أن فهم أفضل للبيولوجيا المرض يمكن أن توفر تلميحات إضافية للإدارة السريرية لعلم الأمراض، من خلال تحديد كل من علامات النذير والأهداف العلاجية.

الهدف من هذه الورقة هو إظهار كيف يمكن استخدام مزيج من البروتين تقنيات مختلفة لتحديد البروتينات المشاركة في بداية CLL والتقدم. نهجنا يوضح أنه من الممكن للانضمام معا البروتين الأساسي والبيانات السريرية ^5.

في العمل الحالي، خلايا اللوكيميا الأولية من المرضى المختارين(جيد مقابل التكهن سيئة) هي معزولة ومن ثم يتم استخدام الخلية لست] للحصول على خرائط البروتين. 2DE يسمح توصيف للوضع بروتيوميك من سكان الخلية، بما في ذلك التعديلات بعد متعدية، وبالتالي إعطاء معلومات غير المباشرة على النشاط البيولوجي من كل من البروتين. يتم حلها لست] خلية كاملة قبل أول المدى البعد على أساس نقطة تساوي الكهربية، يليه البعد الثاني تعمل على هلام بولي أكريلاميد الذي يحل البروتينات على أساس الوزن الجزيئي. تحليل مقارن لخرائط البروتين يسمح تحديد البروتينات وأعرب تفاضلي (سواء من حيث الوفرة والتعديلات بعد متعدية) كبقع على هلام التي يمكن أن تقطع وتحليلها بواسطة الطيف الكتلي. دور كل مرشح ثم يمكن استغلالها من قبل فحوصات مختلفة.

هذا النهج الذي يقتصر CLL في المخطوطة الحالية، يمكن توسيعها بسهولة إلى أمراض أخرى / عينات، وبالتالي توفير المعلومات حول proteomiج / الاختلافات البيولوجية بين مجموعتين (أي مرضية مقابل المعتاد، مقابل حفز unstimulated والبرية من نوع مقابل ضربة قاضية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم الحصول على جميع عينات الأنسجة مع موافقة مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى سان رافاييل (ميلان، إيطاليا).

1. عينات الأنسجة البشرية وتنقية الخلايا (الشكل 1)

ملاحظة: تم الحصول على الخلايا الليمفاوية اللوكيميا السرطانية من الدم المحيطي (PB) من المرضى CLL، وفقا لتشخيص موليجان وآخرون ^9.

1.1) فصل خلية اللوكيميا من PB

جمع PB vacutainer في أنابيب جمع الدم مع الهيبارين الصوديوم.
نقل الدم إلى أنبوب 15 مل وإضافة B-خلية كوكتيل التخصيب البشري في 50 ميكرولتر / مل من الدم الكامل. تخلط جيدا واحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تمييع عينة مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني + 2٪ FBS، مزيج بلطف وتراكب بعناية الدم خلال Ficoll، والتأكد من عدم كسر واجهة. 1 استخدام جزء على الأقل من Ficoll إلى 2 أجزاء من العينة المخففة (أي 4 مل Ficoll + 10 مل من الدم في 15 مل رالتعليم الأساسي للجميع).
الطرد المركزي في 400 XG، في درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة بدون فرامل. خلايا وحيدات النوى سيكون في الواجهة.
نضح بعناية واجهة لاستعادة خلايا ووضع في أنبوب جديد. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج، 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 5 دقائق. سوف يكون بيليه في القاع.
تجاهل طاف. Resuspend وبيليه في طاف المتبقية عبها الأنبوب ذهابا وإيابا مع الأصابع. تمييع بيليه مع 10 مل الكامل المتوسطة RPMI (1640 RPMI تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين و 15 ملغ / مل جنتاميسين) وعدد الخلايا باستخدام طريقة الاستبعاد التريبان الأزرق.

1.2) تقييم الطهارة

ملاحظة: الطهارة من كافة الاستعدادات يجب أن يكون دائما فوق 99٪.

احتضان 100 ميكرولتر من تعليق خلية النقي مع الأجسام المضادة التالية (متوفرة تجاريا، وانظر جدول المواد): CD3 _FITC (5 ميكرولتر / قسم التدريب والامتحاناتر)، CD14 _PE (5 ميكرولتر / اختبار)، CD19 _{تنمية الطفولة المبكرة} (6 ميكرولتر / اختبار)، CD16 _CD56-PC5 (2 ميكرولتر / اختبار)، CD5 _PC7 (4 ميكرولتر / اختبار)، لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في FACS أنبوب.
غسل العينة مع 4 مل من برنامج تلفزيوني (أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج) والتحقق من نقاء من تدفق cytometry.Check في مؤامرة٪ من خلايا CLL (> 99٪) التي تشترك في التعبير عن CD19 وCD5 على سطحها و هو مبين في الشكل 1 (6). تأكد من أن التحضيرات تخلو تقريبا من NK، الخلايا الليمفاوية T وحيدات عن طريق فحص٪ من CD3، CD14 وCD16-56 في المؤامرة، التي ينبغي أن تكون قريبة من الصفر.

1.3) عينات التخزين

للدراسات البروتين، وجمع 25 × 10 ⁶ خلايا في أنبوب 1.5 مل، والخلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف يجفد الكريات لمدة 4 ساعة. تبقي في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
لفحوصات التحقق من صحة، وخلايا resuspend في RPMI كاملة (الكمية تعتمد على مزيد من الفحص الذي هوالمختار) والمضي قدما في الخطوة 4.

2. الكهربائي ثنائي الأبعاد (2-DE) (الشكل 2)

2.1) Isoelectrofocusing (منتدى الطاقة الدولي)

ذوبان الخلايا CLL الكريات مع الحجم النهائي من 380 ميكرولتر 2-DE العازلة (344 ميكرولتر من حل RBthio (9 M اليوريا، و 10 ملي تريس، 4٪ CHAPS)، 30 ميكرولتر من DTT 65MM، 6 ميكرولتر من 2٪ IPG عازلة ampholine درجة الحموضة 4-7).
تطبيق عينات البروتين (1 ملغ) إلى 18 شرائط IPG (درجة الحموضة 4-7) وأداء IEF التالية بروتوكول قياسي كما وصفها كونتي وآخرون ¹⁰
تتوازن شرائط في 2 مل من موازنة العازلة (EB: 50 ملي درجة الحموضة 8.8 تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة التي تحتوي على 6 M اليوريا والجلسرين 30٪، 2٪ SDS)، على أن تستكمل مع 2٪ من DTT الطازجة، لمدة 15 دقيقة في RT. تجاهل EB + DTT وإضافة 2 مل من EB تستكمل مع 2.5٪ Iodoacetamide. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT على منصة هزاز.

2.2) SDS-PAGE

تجفيف شرائح على ورقة دون لمس جل لإزالةفائض EB. تحميل كل قطاع على رأس 9-16٪ التدرج هلام SDS-PAGE. إضافة كمية صغيرة من SDS-الكهربائي العازلة (25 ملي تريس، جليكاين 192 ملم، SDS 0،1٪ ث / ت) على رأس هلام لتسهيل تحميل القطاع.
ختم هلام بإضافة ~ 5 مل من محلول الآجار (0.8٪) لمنع تعويم الشريط، ثم تجميع وحدة الكهربي وملء مع SDS-الكهربائي العازلة. أداء على المدى عند 60 مللي أمبير / هلام لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية.
إزالة هلام من وحدة الكهربي ووضعه في مربع تلطيخ المناسب.

2.3) وصمة عار الفضية لمحضرة جل

المثبت	50٪ ميثانول 12٪ حمض الخليك 0،05٪ الفورمالين	2 ساعة (أو بين عشية وضحاها) *
الاحتياطي اغسل	35٪ Ehanol	20 دقيقة (تكرار الخطوة ثلاث مرات)
محسسة	0،02٪ ثيوسلفات الصوديوم	2 دقيقة
المياه والصرف الصحي	H ₂ O	5 دقيقة (تكرار الخطوة ثلاث مرات)
نترات الفضة	0،2٪ نترات الفضة 0076٪ الفورمالين	20 دقيقة
المياه والصرف الصحي	H ₂ O	1 دقيقة (تكرار الخطوة مرتين)
DEVELOPER	6٪ كربونات الصوديوم 0،0004٪ ثيوسلفات الصوديوم 0،05٪ الفورمالين	حتى تلطيخ غير كافية
إيقاف	50٪ الميثانول	30 دقيقة
	* ساعة 2 هو الحد الأدنى من الوقت المطلوب لتثبيت البروتين

الجدول 1.

ملاحظة: بقع البروتين يمكن تصور من قبل تلطيخ المواد الهلامية مع MS الفضة وصمة عار متوافقة ^11. كل الحلول اللازمةلتلطيخ الفضة مدرجة في الجدول 1.

إعداد حوالي 200 مل من كل محلول / هلام والمضي قدما كما هو مبين في الجدول 1. إضافة بعناية كل حل لتلطيخ مربع تحتوي على هلام. أداء جميع حضانات على منصة هزاز.
بعد التلوين، وإزالة الحل محطة وترك جل في حل من حمض الخليك 1٪ حتى الاستحواذ.

2.4) اقتناء وتحليل جل

الحصول على صور بدقة عالية باستخدام مقياس الكثافة خلال 3 أيام من تلطيخ.
تحليل 2-D أنماط البروتين باستخدام برنامج لالهلام 2-DE.
ملاحظة: البرنامج يسمح مقارنة صورة سريعة وموثوق بها.
1. إنشاء مشروع عن طريق اختيار "إنشاء مشروع جديد" من القائمة السياقية. إنشاء مجلد واستيراد المواد الهلامية باختيار "الصور هلام استيراد" مع. TIF، PNG. أو .gel التمديد.
2. مرة واحدة يتم استيراد المواد الهلامية، وأضاف إلى workspالآس، تؤدي إلى اكتشاف بقعة الآلي عن طريق اختيار المواد الهلامية للكشف بقعة واختيار "تحرير> البقعة> كشف" في القائمة.
3. المقبل، إجراء الطرح الخلفية عن طريق اختيار من القائمة "خلفية طرح". ملاحظة: بعد أنه من الممكن لمقارنة المواد الهلامية متعددة والكشف عن أوجه التشابه أو الاختلاف عن طريق التحليل الكمي و / أو الكيفي.

3. تحديد البروتين بواسطة MALDI-TOF MS تحليل (الشكل 3)

3.1) هضم البروتين

شطف الجل مع الماء والمكوس البقع من الاهتمام من المواد الهلامية إما عن طريق دليل (قطع مع مشرط نظيف) أو عن طريق الاستئصال الآلي.
غسل هلام الجسيمات مع الماء (100-150 ميكرولتر)، وتدور إلى أسفل (30 ثانية في 400 x ج)، وإزالة السائل.
إضافة حجم مساو (اعتمادا على حجم هلام) من CH ₃ CN إلى قطع جل والانتظار لمدة 10-15 دقيقة حتى القطع هلام تتقلص. تجفيف الجسيمات هلام طغ فراغ الطرد المركزي.
إضافة 75-100 ميكرولتر من 10 ملي Dithioerythritol مخففة في 50 ملي NH ₄ HCO ₃ واحتضان لمدة 30 دقيقة في 56 ° C (الحد الخطوة). يتقلص مرة أخرى القطع هلام مع CH ₃ CN كما هو موضح في الخطوة 3.1.3.
المضي قدما الألكلة بإضافة 75-100 ميكرولتر من محلول مخفف 55 ملي في 50 ملي Iodoacetamide NH ₄ HCO ₃ واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
تقليص القطع هلام مرة أخرى مع CH ₃ CN باستخدام حجم ما يكفي لتغطية قطع هلام كما هو موضح في الخطوة 3.1.3. جاف في جهاز للطرد المركزي فراغ.
ترطيب الجسيمات في العازلة التي تحتوي على 25 ملي NH ₄ HCO _3، 5 مم CaCl _{2، و12،5 نانوغرام /} ميكرولتر من التربسين في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدام حجم كاف من العازلة لتغطية قطع هلام. إزالة-يمتص الامم المتحدة طاف من القطع جل وإضافة 25 ملي NH ₄ HCO _3، 5 مم CaCl ₂ دون التربسين إلى COVإيه هلام.
ترك العينات عند 37 درجة مئوية على الأقل 3 ساعة (الحد الأدنى من الوقت اللازم لهضم الببتيد) ليلة وضحاها.

3.2) قداس التحليل الطيفي (تقنية قطرة المجففة)

بقعة قسامة 1 ميكرولتر من كل عينة على طبق من ذهب MALDI الفولاذ المقاوم للصدأ وتخلط مع 1 ميكرولتر من α-سيانو-4-hydroxycinnamic حمض مثل المصفوفة، الذي أعد في 50٪ CH ₃ CN و 0.1٪ TFA.
الحصول على أطياف الشامل على مطياف الكتلة MALDI-TOF. تتراكم حوالي 200 في بقعة الأطياف، وضبط كثافة الليزر لمنع إشارة التشبع أو زيادة إشارة. أطياف العملية عن طريق برنامج مستكشف البيانات كما هو موضح أدناه:
1. استيراد ملف دات وإجراء تصحيح خط الأساس باختيار "العملية> تصحيح خط الأساس". معايرة الجماهير باستخدام المنتجات التربسين انحلال ذاتي وقمم المصفوفة عن طريق اختيار "العملية> معايرة الكتلة> المعايرة اليدوية. تحديد قمم وثيقة م / ض و855.1 2163.1 بذ اليسار سحب وتحديد الجماهير المرجعية المقابلة، ثم انقر فوق "مؤامرة" و "تطبيق المعايرة" في نافذة المعايرة اليدوي.
2. ضبط عتبة الكشف الذروة ("الذروة> الكشف الذروة")، مكررة التتبع النشط ("عرض> تكرار أثر فعال")، وحدد تتبع جديد وإجراء deisotoping ("الذروة> deisotoping"). باستخدام الماكرو "getpeaklist"، إنشاء قائمة من الجماهير ليتم استخدامها لتحديد الهوية. إذا لزم الأمر، يدويا إزالة إشارات الضجيج واختار قمم لتنظيف قائمة والحصول على التعرف بشكل أفضل.
تحديد البروتينات عن طريق البحث في قاعدة بيانات البروتين غير زائدة عن الحاجة باستخدام شاملة عميقة والتميمة ومحركات البحث ^12.
1. استخدام المعلمات التالية في جميع عمليات البحث: واحد غاب انشقاق في الببتيد، والأكسدة ميثيونين وتعديل متغير، السيستين carbamidomethylation وتعديل الثابتة وinitiآل التسامح كتلة من 50 جزء في المليون.

4. هيكل الخلية نشاط فحوصات (الشكل 4)

ملاحظة: Resuspend الخلايا طهروا في الخطوة 1 في كامل RPMI (10 ⁶ خلية / 200 ميكرولتر).

4.1) الفحص هجرة. هذا الاختبار يسمح الكمي قدرة المهاجرة من الخلايا تحليلها (الخلايا الليمفاوية). استخدام غرفة transwell 6.5 ملم وقطرها 5.0 ميكرون حجم المسام وإجراء الفحص في ثلاث نسخ. تحسين حجم المسام ووقت الهجرة (الخطوة 4.1.3) في حالة أنواع مختلفة من الخلايا.

إعداد مجلس النواب بإضافة 600 ميكرولتر من RPMI كاملة مع أو بدون مؤثرات معينة (أي SDF-1) لقياس والهجرة العفوية التي يسببها على التوالي.
وضع مجلس الشيوخ على ذلك، والسماح للنظام تتوازن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
البذور 10 ⁶ خلية / 200 ميكرولتر في الغرفة العليا (مجموع عدد الخلايا)، واحتضانلوحة لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
إزالة الغرفة العليا، وجمع وسائل الاعلام في مجلس النواب وتغسل مجلس النواب مرة واحدة مع 1 مل PBS. جمع برنامج تلفزيوني في أنبوب.
الطرد المركزي 5 دقائق في 300 XG، تجاهل طاف و resuspend في 500 ميكرولتر PBS.
بواسطة التدفق الخلوي، عد عدد الخلايا هاجر بعد 1 دقيقة من الاستحواذ. في حالة وجود السكان خلية معزولة أنه ليس من الضروري أن تضيف أي الأجسام المضادة السطحية. تحقق من عدد الخلايا في مؤامرة نقطة ثنائية الأبعاد النظر في الجانب تشعث من الخلايا وعدد من الأحداث تصور في 1 دقيقة، وهو عدد لاستخدامها في العمليات الحسابية.
حساب مؤشر هجرة (MI) على النحو التالي:

4.2) فحص الالتصاق. هذا الاختبار يسمح قياس قدرة التصاق الخلايا. إجراء الفحص في ثلاث نسخ.

قبل معطف 96 أهلا وسهلالوحة ليرة سورية (مسطحة القاع) مع 50 ميكرولتر / جيد إما 2٪ BSA-PBS (كخلفية) أو 1 ميكروغرام ICAM-1 مخففة في برنامج تلفزيوني، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
غسل لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني وحجب المواقع غير المحددة وذلك بإضافة 2٪ BSA-برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر / جيد) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
في غضون ذلك الخلايا في resuspend في 5 × 10 ⁶ / مل في RPMI كاملة، تسمية لهم تعقب خلية 1 ملم CMFDA الخضراء واحتضان 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
إضافة 1 × 10 ⁶ خلايا / جيد إلى الآبار المغلفة قبل رميه بعد عرقلة الحل (الخطوة 4.2.2)، واحتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
تحديد التصاق باستخدام قارئ ELISA (فلتر الإثارة: 485 نانومتر، وتصفية الانبعاثات: 535 نانومتر). إجراء القياس الأول على مجموع المدخلات (INPUT).
غسل لوحة بلطف مع 2٪ BSA-برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيد) 4 مرات (خ). إجراء القراءة من لوحة بعد كل خطوة الغسيل (التصاق _خ).
بعد الطرح خلفية لكل قياس، وحساب ADHES محددةأيون (التصاق):

4.3) فحص البلمرة. هذا هو مقايسة اللونية يحدد مقدار-F أكتين البلمرة. إجراء الفحص في ثلاث نسخ.

في resuspend 1X10 ^ 6 خلايا في 100 ميكرولتر من قبل تحسنت كامل RPMI وإضافة حافز معين (أي α-الغلوبولين المناعي 20 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة.
وقف رد الفعل مع 400 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ وإصلاح الخلايا لمدة 10 دقيقة في RT.
يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني (أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، 4 ° C).
تجاهل طاف وpermeabilize الخلايا مع PBS-saponine 0.2٪ (200 ميكرولتر) على الجليد لمدة 2 دقيقة.
يغسل 3 مرات مع PBS-saponine 0.1٪ (أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق، 4 ° C)، وتجاهل طاف resuspend في 100 ميكرولتر PBS-saponine 0.1٪.
وصمة عار مع Phalloidin Alexafluor-488 (3 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة في غرفة رemperature في الظلام.
يغسل 3 مرات مع PBS-0.1٪ saponine. تجاهل طاف و resuspend في 300 ميكرولتر PBS.
قياس كمية من F-الأكتين التدفق الخلوي، وحساب متوسط كثافة التنوير (MFI) من Phalloidin. تحليل البيانات التي تم إنشاؤها في مؤامرة البعد واحدة من أجل إنتاج رسم بياني على أساس كثافة الفلورسنت، يظهر قيمة التمويل الأصغر في التقرير الرسم البياني.
قياس البلمرة F-أكتين (Δ F-الأكتين) على النحو التالي:

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن عزل خلايا B اللوكيميا الأولية تشكل PB المرضى CLL وقمنا بتحليل الخرائط البروتين. عينات (ن = 104) تم تجميعها في اثنين من مجموعات فرعية رئيسية على أساس المظاهر السريرية لكل مريض (التكهن سيئة مقابل التشخيص الجيد) وأجري تحليل مقارن ل2DE المواد الهلامية.

تحديد تحليل المسموح به من البقع أعرب تفاضلي بين مجموعات فرعية اثنين (في فترة من حضور / غياب أو التحول على هلام، مما يعني تغييرات في التعديلات بعد متعدية؛ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا المخطوط هو وصف بروتوكول الأمثل لتحديد جزيئات تشارك في التسبب في CLL، حتى لو كان يمكن تمديد هذا النهج لأمراض أخرى و / أو أنواع أخرى عينة ^16-18. بمقارنة ملامح البروتين من 2 مجموعات فرعية من المرضى CLL، وحسن مقابل التكهن سيئة ^19، أثبتنا أن اختلفوا في وضع الفسفرة من HS1 وأن تفعيله يؤثر على قدرة الهجرة والتصاق خلايا اللوكيميا.

فيما يتعلق بأساليب أخرى، فإن الميزة الرئي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر اللمفاوية وحدة الأورام الخبيثة، إليسا عشرة هاكن، ليديا Scarfò، ماسيمو اليسيو، أنطونيو كونتي، أنجيلا باتشي، وأنجيلا كاتانيو.

وأيد هذا المشروع من قبل: Associazione الإيطالية في لا يسر كل من Ricerca سول Cancro جنة العلاقات الصناعية الاسترالية (باحث غرانت والبرنامج الخاص الجزيئية علم الأورام السريري - 5 بالألف # 9965)

CS وBA تصميم الدراسة، إجراء التجارب، وتحليل البيانات، وكتب المخطوطة. MTSB، UR، FBPR ساعد في كتابة المخطوطة. PG وFCC تصميم عينات الدراسة المقدمة للمرضى والبيانات السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أسيتونيتريل	ميرك	61830025001730
بيكربونات الأمونيوم	SIGMA	A6141-500G
1،4-Dithioerythritol	SIGMA	D9680-5G
Iodoacetamide	SIGMA	I6125-25G
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات	SIGMA	223506-25G
التربسين ، درجة التسلسل	ROCHE	11418475001
&alpha ؛ - حمض سيانو-4-هيدروكسي سيناميك	SIGMA	C2020-10G
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك	SIGMA	T6580
ZipTip_{µ-C18< / sub>}	MILLIPORE	ZTC18M096
RosetteSep كوكتيل تخصيب الخلايا البائية البشرية	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	بيكمان كولتر	082A07767	PC5
CD56	بيكمان كولتر	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 وحدة التركيز المتساوي الكهربية	GE-Healthcare	11-0033-64
اليوريا	SIGMA	U6504
Tris-Hcl Buffer	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	درجة الحموضة الخطية 4-7 18 سم
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	درجة الحموضة 4-7
Glycerol	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilamide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Methanol	SIGMA	32213
حمض الخليك	VWR	631000
الفورمالين	BIO-OPTICAL	05-K01009
الإيثانول	VWR	9832500
ثيوسلفات الصوديوم	FLUKA	72049
نترات الفضة	FLUKA	85228
الديناميكيات الجزيئية مقياس الكثافة بالليزر SI الشخصي	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
كربونات الصوديوم	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	الأنظمة الحيوية
التطبيقية (الإصدار 3.2)	Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 مم	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	مع L-GLUTAMINE
Gentamicin	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
صفيحة مسطحة القاع 96 بئر	BECTON DICKINSON	353072
BSA	سانتا كروز	9048-46-8
ICAM-1	R & D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Green
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Saponine	SIGMA	S-7900
Phalloidin & nbsp ؛	لايف ثيكنولوجيا	A12379	أليكسا فلور 488

برنامج مستكشف بيانات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HS1 SDS PAGE

من بقعة 2DE جل لوظيفة البروتين: الدرس المستفاد من HS1 في سرطان الدم الليمفاوي المزمن

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة