يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العزلة وثقافة فصل الخلايا العصبية الحسية من الفرخ الأجنة

14.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51991

⸱

سبتمبر 24, 2014

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Assumption College

في هذه المقالة

ملخص

نماذج ثقافة الخلية توفر تحكم مفصلة على الظروف البيئية وبالتالي توفر منصة قوية لتوضيح جوانب عديدة من بيولوجيا الخلايا العصبية. نحن تصف طريقة سريعة وغير مكلفة، وموثوق بها لعزل وفصل، والثقافة الخلايا العصبية الحسية من الأجنة الفرخ. كما تقدم تفاصيل إعداد الطبقات التحتية ومناعية.

الملخص

الخلايا العصبية هي الخلايا متعددة الأوجه التي تحمل المعلومات الأساسية لمجموعة متنوعة من المهام بما في ذلك الإحساس، وحركة السيارات، والتعلم، والذاكرة. يمكن دراسة الخلايا العصبية في الجسم الحي يكون تحديا بسبب تعقيدها، بيئاتها المتنوعة والديناميكية، والقيود الفنية. لهذه الأسباب، ودراسة الخلايا العصبية في المختبر يمكن أن يكون مفيدا لكشف أسرار معقدة من الخلايا العصبية. طبيعة محددة جيدا من نماذج ثقافة الخلية يوفر تحكم مفصلة على الظروف البيئية والمتغيرات. نحن هنا تصف كيفية عزل، فصل، والخلايا العصبية الثقافة الابتدائية من الأجنة الفرخ. هذا الأسلوب هو سريعة وغير مكلفة، ويولد تنمو بقوة الخلايا العصبية الحسية. الإجراء ينتج باستمرار الثقافات التي يتم التخصيب لديها الخلايا العصبية وعدد قليل جدا من الخلايا غير العصبية (أقل من 5٪). الخلايا العصبية الأولية لا تلتزم بشكل جيد للزجاج غير المعالجة أو زراعة الأنسجة البلاستيك، وبالتالي الإجراءات التفصيلية لإنشاء اثنين ديستانط، موصوفة محددة جيدا الطبقات التحتية التي تحتوي على laminin لطلاء الخلايا العصبية. الخلايا العصبية مثقف قابلة للغاية لتقنيات الخلوية والجزيئية متعددة، بما في ذلك التعاون مناعي، تخيل خلية الحية، رني، ومناعية. وقد تم تحسين إجراءات مناعية المزدوج على هذه الخلايا العصبية مثقف وصفها هنا.

المقدمة

الخلايا العصبية هي الخلايا المعقدة التي تحمل المعلومات الأساسية لمجموعة متنوعة من المهام بما في ذلك الإحساس، الرؤية، وحركة السيارات، والتعلم، والذاكرة. فريد من أنواع الخلايا الأخرى، تمتد عمليات الخلايا العصبية تشبه الذراع، ودعا محاور عصبية، لتشكيل العصبية الطرق الأساسية للاتصال. أثناء التطوير المتخصصة المقصورات الموجودة على نصائح من محاور النمو، دعا مخاريط النمو، انتقل من خلال الحفل من العظة خارج الخلية لقيادة محور عصبي إلى وجهتها المناسبة. ليست مفهومة تماما الآليات الجزيئية المعقدة التي تكمن وراء النمو مخروط الملاحة. إلى فهم أفضل لهذه الآليات، استخدمت محققين نماذج زراعة الخلايا لدراسة الخلايا العصبية في بيئة المختبر محددة ومبسطة في. وقد أدى دراسة الخلايا العصبية في الثقافة 1 إلى تقدم كبير في فهمنا لبيولوجيا الخلية العصبية بما في ذلك: تمايز الخلايا العصبية 2، وديناميات هيكل الخلية، الإلتقام والاتجار، التغصناتتنظيم 3،4، تجدد المحاور 5، والحالات السريرية مثل اعتلال الأعصاب 6. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا العصبية مثقف قابلة للغاية لمجموعة واسعة من تقنيات البحث بما في ذلك مناعية، خلية السطح المشترك مناعي، لطخة غربية، ترنسفكأيشن، رني، والتصوير الحي مثل تحليل timelapse من مخروط نمو الحركة. وهكذا، زراعة الخلايا العصبية الأولية هو نهج قوي لتوضيح جوانب عديدة من بيولوجيا الخلايا من الخلايا العصبية.

ويوفر نموذج خلية ثقافة المحققين مع سيطرة مفصلة على الظروف البيئية والمتغيرات. على سبيل المثال، والطبقات التحتية التي ومطلي الخلايا العصبية (وتنمو عليها) يمكن التلاعب بها بسهولة. هنا، ونحن نقدم تعليمات مفصلة لتوليد اثنين من الطبقات التحتية المتميزة، واحدة مع انخفاض laminin-1 تركيز والآخر مع تشبع تركيزات laminin-1. والمثير للدهشة، أن تركيزات مختلفة من نفس الجزيء لها آثار دراماتيكيةعلى الحالة الداخلية من الخلايا العصبية فضلا عن تكوين سطح الخلية الخاصة بهم. على سبيل المثال، مستويات الخلايا من المخيم ومستويات سطح integrins تختلف اختلافا كبيرا في الخلايا العصبية مطلي على هذين 7،8 الطبقات التحتية. وقد أظهرت دراسات إضافية أن الجزيئات الأخرى، بما في ذلك فبرونيكتين وكبريتات شوندروتن البروتيوغليكان، تأثير التعبير عن جزيئات سطح الخلية والحركة العصبية 7-11. بالإضافة إلى ذلك، جزيئات قابلة للذوبان مثل neurotrophins وneurotropins تؤثر أيضا تكوين غشاء الخلية العصبية والحركة 12-16 ويمكن بسهولة وبدقة التلاعب في نموذج ثقافة الخلية.

هنا، نحن تصف طرق لعزل وفصلها الثقافة الخلايا العصبية الحسية من الأجنة الفرخ. وقد استخدم هذا الإجراء لتحقيق اختراقات كبيرة في بيولوجيا الأعصاب، بما في ذلك محور عصبي ثمرة 5،7،8،10،11،16-21 وتم تعديل من إجراء يهدف إلى عزل خلايا العقدة 22. هناكالعديد من المزايا لهذا النهج. أولا، العديد من الميزات من الفرخ عقدة الجذر الظهري (DRG) تطوير تتميز جيدا بما في ذلك الإطار الزمني للولادة، والإرشاد محور عصبي، وملامح تعبير البروتين 2،23-28، وبالتالي توفير أساس المفيد التي تبنى عليها بالمعلومات في تجارب المختبر. الثانية، فصل الثقافات العصبية تسمح المحقق لدراسة الخلايا العصبية أكثر مباشرة مقارنة النهج البديلة باستخدام إإكسبلنتس سليمة DRG (التي تحتوي على الخلايا العصبية والخلايا غير العصبية) و / أو الثقافات المختلطة التي تحتوي على كل من الخلايا العصبية وفصلها الخلايا غير العصبية. ثالثا، الإجراء الموضح هنا واضح ومباشر، وغير مكلفة وقابلة للطلاب الجامعيين. ولذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها لأغراض البحث وكذلك لأغراض تعليمية. وعلاوة على ذلك، يجب أن اختلافات طفيفة من هذا البروتوكول يسمح تنقية سريع، عالية الغلة من الخلايا العصبية من مصادر أخرى غير DRGs. على سبيل المثال، يمكن تعديل هذا الإجراء لتوفير neuronally ENRالثقافات iched من الأنسجة الأخرى مثل الدماغ الأمامي الجنينية أو الحبل الشوكي.

وقد تم تحسين بروتوكولات مناعية لهذه الثقافات العصبية فصلها ويتم وصفها بالتفصيل هنا. يتم توفير إجراءات مناعية المزدوج ضد جزيء التصاق الخلايا العصبية (NCAM) وintegrins β1. وقد استخدمت البيانات الناتجة من هذه الأساليب immunocytochemical لدراسة الزخرفة المكانية وكثافة عدة الجزيئات في الخلايا العصبية مثقف 8،16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ساترة التحضير: تغسل حمض وتخبز

  1. 2 أيام على الأقل قبل تشريح (الخطوة 2)، وتبدأ الخطوات التالية لإعداد coverslips. تنفيذ الخطوة غسل الحمضية لإزالة الزيوت وcoverslips نظيفة تماما.
  2. coverslips الحمل في حامل الخزف أن المواقف عموديا coverslips ويمنعها من لمس بعضهم البعض. غمر حامل وcoverslips في إناء زجاجي الأنسجة مليئة 2 M حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك). بدلا من ذلك، إذا حامل الخزف غير متوفر، تنتشر ~ 20 coverslips أفقيا لتغطية الجزء السفلي من 100 ملم الزجاج طبق بتري وغمر coverslips في 2 M حمض الهيدروكلوريك.
  3. وضع إناء زجاجي (مع coverslips مغمورة في حامض) على جدول الروك في غطاء الدخان والسماح هزاز لطيف لمدة 5 على الأقل ساعة في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، coverslips حامض يغسل بين عشية وضحاها في ظل نفس الظروف.
  4. غسل coverslips مع H 2 O (DH 2 O) المقطر عن طريق نقل حامل الخزف تحميلهامع coverslips من 2 M حمض الهيدروكلوريك إلى الحاويات الزجاجية الأنسجة نظيفة مليئة درهم 2 O. بدلا من ذلك، صب 2 M حمض الهيدروكلوريك من الزجاج طبق بتري مع coverslips وإعادة ملء مع DH 2 O.
  5. يغسل من قبل الصب DH 2 O مرة أخرى وإعادة تعبئة الوعاء الزجاجي مع DH الطازجة 2 O. تكرار لما مجموعه 3 يغسل سريعة.
  6. يبدأ أطول نظام الغسيل من خلال العودة عاء زجاجي (مع coverslips وDH 2 O) على الروك. تسمح الإثارة لطيف لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، صب DH 2 O وإضافة جديدة DH 2 O. تكرار لما مجموعه عشرة على الأقل يغسل. بدلا من ذلك، تواصل غسل بين عشية وضحاها.
  7. وضع coverslips غسلها في فرن مسخن إلى 350 درجة مئوية. في حالة استخدام حامل الخزف، وإزالة حامل من DH 2 شغل-O إناء زجاجي ثم وضع حامل مع coverslips مباشرة في الفرن. في حالة استخدام طبق بتري الزجاج، صب DH 2 O ووضع صحن زجاجي مع coverslips في furnacه.
  8. خبز coverslips لمدة خمس ساعات على الأقل أو طوال الليل في 350 درجة مئوية.
  9. بعد الخبز الكامل، إزالة coverslips من حامل الخزف مع غرامة ملقط معقم ووضعه في 100 ملم الزجاج طبق بتري. ترك coverslips التي لم توضع أصلا في حامل الخزف في الزجاج طبق بتري.

2. الفرخ تشريح وعزل DRGs

  1. إزالة خصبة، نظموا الأبيض يفورنو فرخ البيض من الحاضنة (الذي عقد في 37 حتي 38،5 درجة مئوية مع هزاز لطيف).
    ملاحظة: استخدمت دراسات سابقة يوم الجنينية 7-10 لعزل DRGs 2،8،11-13،16.
  2. وضع البيض مختارة في غطاء تدفق الصفحي. إجراء كافة الإجراءات المدرجة أدناه تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي مع الحلول والأدوات المعقمة. قبل كل الحلول الدافئة في 37 ° C حمام الماء.
  3. كسر البيض ومكان محتويات البلاستيك إلى 100 ملم طبق بتري. استخدام ملقط القياسية لنقل الجنين إلى 100 ملم طبق بتري آخر.
    4. باستخدام ماصة باستور، إضافة استعد برنامج تلفزيوني 1X إلى طبق بتري للحفاظ على النسيج الرطب. قطع رأس الجنين عن طريق معسر الرقبة مع ملقط غرامة. نقل الجسم إلى 100 ملم نظيفة طبق بتري آخر.
  4. إضافة F12HS10 الحارة (F12 هام و10 ملي HEPES، 100 وحدة / مل البنسلين، 0.1 ملغ / مل الستربتوميسين و 10٪ مصل بقري جنيني) إلى الطبق مع ماصة باستير للحفاظ على النسيج الرطب. استخدام ملقط لوضع الجنين على الجانب الظهري لها (الشكل 1A).
  5. وضع 100 ملم البلاستيك طبق بتري تحتوي على الأنسجة الجنينية في الصعود إلى مجهر مجهر تشريح stereovision في غطاء تدفق الصفحي. استخدام ملقط غرامة لجعل شق خط الوسط الرأسي من ذيل إلى عنق بواسطة معسر الأدمة النامية لفضح القلب والرئة وغيرها من الأجهزة. بدلا من ذلك، وجعل سلسلة من الدموع صغيرة لكشف الأعضاء الداخلية.
  6. وتستخدم بلطف 2 مجموعات من ملقط غرامة معقمة ل: أ) فهم الرقبة وب) فهم الشريان الأورطي أو الأنسجة الأخرى متفوقة على الفور إلى القلب وسحب نحو الذيل،نزع احشاء الحيوان.
  7. تطبيق F12HS10 دافئة مع ماصة باستور إلى الأنسجة. استخدام ملقط لإزالة أي المتبقية القلب والأوعية الدموية، الجهاز التنفسي أو الجهاز الهضمي لفضح الأضلاع النامية، العمود الفقري وDRGs (أرقام 1B-1D).
  8. تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط غرامة لمواصلة إزالة الأجهزة وجمع DRGs على طول جانبي العمود الفقري القطني، أقل شأنا من أضلاعه. جمع DRGs من نتف DRGs سليمة من الجنين. قرصة وقطع الجذور التي تصل من DRG نحو النخاع الشوكي والعصب يمسك النامية التي تصل من DRG نحو المحيط أو العكس بالعكس.
  9. وضع DRGs سليمة في صحن الثقافة 35 مم مليئة F12HS10 دافئة. إزالة أي نوع من الأنسجة الزائدة، مثل الظهرية أو البطنية الجذور التي قد انضمت إلى DRGs، من DRGs سليمة في 35 ملم طبق من معسر مع ملقط غرامة.
  10. للحصول على DRGs متفوقة على منطقة أسفل الظهر، وإزالة النصف البطنية من الصدر والأيليةالعمود الفقري كال. يتم ذلك عن طريق تقديم قطع في العمود الفقري وضع عمودي على محور الحبل الشوكي في المنطقة العنقية العليا وقطع أخرى في منطقة أسفل الظهر العليا. ثم، إجراء تخفيضات موازية لمحور الحبل الشوكي على طول الجانبين الأيمن والأيسر من العمود الفقري. رفع نصف بطني من العمود الفقري من الجنين، الذي يعرض يعرض الحبل الشوكي (أرقام-1E 1F).
  11. للسماح سهولة الوصول إلى DRGs، وإزالة الحبل الشوكي العنقي والصدري من يمسك الحبل الشوكي مع ملقط غرامة. استخدام ملقط لرفع الحبل الشوكي من العمود الفقري. كتقريب، الحبل الشوكي الصدري هو على مستوى الأضلاع ومنطقة عنق الرحم متفوقة على الأضلاع.
  12. جمع الصدر سليمة وDRGs عنق الرحم بالملقط الجميلة ووضعها في F12HS10 دافئة مع DRGs الأخرى. إزالة الأنسجة الزائدة التي قد تلتزم DRGs.
  13. شطف الداخلية من الزجاج باستور ماصة جديدة مع F12HS10 للمساعدةمنع DRGs من التمسك جدران ماصة. استخدام ماصة تشطف لنقل جميع DRGs وF12HS10 من طبق بيتري صغير لالعقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، والشروع فورا في الخطوة 3.
    يمكن تشريح أجنة إضافية لزيادة عدد DRGs: ملاحظة. يجب أن تبقى في DRGs F12HS10 عند 37 درجة مئوية لتصبح جاهزة للخطوة 3.

3. التفكك، وإثراء، والتثقيف DRG الخلايا العصبية - الجزء 1

  1. مكان أنبوب مخروطي مع DRGs سليمة في أجهزة الطرد المركزي وتدور بلطف (200 x ج) لمدة 2-3 دقيقة. تأكيد أن DRGs قد غرقت إلى أسفل الأنبوب. إن لم يكن، وتدور مرة أخرى.
  2. باستخدام ماصة، وإزالة بلطف F12HS10، وترك DRG بيليه دون عائق. إضافة 2 مل من 1X الكالسيوم والمغنيسيوم الحرة (CMF) PBS، طرد بيليه من DRGs. تدور مرة أخرى وإزالة CMF PBS مع ترك بيليه DRG سليمة. كرر هذه الخطوة لغسل ما مجموعه ثلاثة يغسل لإزالة مصل بقري جنيني في F12HS10، التي من شأنها أن تتداخل مع عملية الهضم التربسين في الخطوة التالية.
  3. إضافة 2 مل من التربسين تحسنت إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 2 مل CMF PBS وDRGs. مكان أنبوب في 37 ° C حمام الماء لمدة 10-15 دقيقة لهضم DRGs في خلايا فصل.
  4. أثناء الحضانة، وجعل F12H + ملحق يحتوي على وسائل الإعلام (F12 هام و10 ملي HEPES 100 وحدة / البنسلين مل، 0.1 ملغ / مل الستربتومايسين، 10 نانوغرام / مل NT3، 10 نانوغرام / مل NGF، 200 مم L-الجلوتامين وN2) ودافئة في 37 ° C حمام الماء. عادة، و 10 مل من وسائل الإعلام الكلي كافية لمدة 4-5 35 مم أطباق من الخلايا العصبية الحسية الأولية. تبدأ أيضا ذوبان laminin-1 لطلاء coverslips (الخطوة 4).
  5. DRGs يسحن بلطف في محلول التربسين مع P1000 ماصة وتفقد البصر عن غياب DRGs سليمة. مواصلة سحن حتى لم يعد ينظر DRGs سليمة بالعين و / أو السماح لأطول الحضانة التربسين في 37 ° C حمام الماء حتى يتم فصلها DRGs سليمة. لحماية الخلايا العصبية DRG من التلف، وتجنب فقاعات الهواء خلال سحن والحد التربسين الهضم إلى <30 دقيقة.
  6. Centrifugالبريد أنبوب يحتوي DRGs فصل والتربسين في 200 x ج لمدة 3-5 دقيقة لتشكيل بيليه. تدور أطول إذا لزم الأمر حتى يتم تشكيل بيليه.
  7. نضح بعناية التربسين دون تعطيل بيليه. إضافة 2 مل من F12HS10 لتكوير. يسحن بلطف DRGs مع طرف P1000 ماصة.
  8. نقل جميع المحتويات من 15 مل أنبوب مخروطي إلى 100 ملم صحن الثقافة. شطف أنبوب مع 8 مل F12HS10 وتحويلها إلى الطبق الثقافة، 2 مل في وقت لما مجموعه 10 مل. هذه الخطوة تساعد الشطف جمع الخلايا التي قد بقيت انضمت إلى جدران الأنبوب.
  9. وضع 100 طبق الثقافة ملم (مع 10 مل F12HS10 وفصل الخلايا DRG) في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
    ملاحظة: CO 2 لا يشترط في الحاضنة لHEPES مخازن درجة الحموضة وسائل الإعلام في غياب CO 2. أثناء الحضانة، والخلايا الدبقية ربط إلى سطح الأنسجة والخلايا العصبية البلاستيك ثقافة تميل إلى التمسك فضفاضة إلى الفراش الدبقية.

4. حمض غسلها طلاءوCoverslips خبز مع Laminin-1

  1. ذوبان الجليد معقمة مأخوذة من المجمدة laminin-1 على الجليد.
  2. تحت ظروف معقمة، إضافة 1 مل من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X إلى 50 قسامة ميكرولتر من laminin-1.
  3. استخدام مقياس الطيف الضوئي للحصول على قيمة الامتصاصية من laminin-1 عند 280 نانومتر. استخدام هذه القيمة في المعادلة التالية لتحديد تركيز laminin-1.

ABS 280 = (تركيز ملغ / مل) * (معامل الانقراض من البروتين)
معامل الانقراض لlaminin-1 هو 0.86.

  1. تحت ظروف معقمة، وتمييع laminin-1 مع 1X PBS للحصول على تركيز 1 ملغ / مل و 20 ملغ / مل. استخدام هذه التركيزات اثنين من تطبيق laminin-1 لتحقيق فارق عشرة أضعاف من laminin-1 منضمة إلى ساترة (30 نانوغرام / سم 2 و 300 نانوغرام / سم 2 على التوالي) بعد الحضانة 7،8،10.
  2. في غطاء تدفق الصفحي، استخدام ملقط غرامة لمكان واحد حمض غسلها والمخبوزات جoverslip في الجزء السفلي من واحد 35 مم طبق الثقافة. كرر حسب الضرورة للحصول على عدد من الأطباق الحاجة.
  3. تخضع لل coverslips للأشعة فوق البنفسجية لمدة 20-30 دقيقة لضمان مزيد من التعقيم. إبقاء غطاء طبق من خلال هذه الخطوة.
  4. إضافة 400 ميكرولتر من استعداد laminin-1 إلى كل ساترة الزجاج. استخدام ماصة لنشر laminin-1 لضمان التغطية الكاملة لساترة. التوتر السطحي سوف تسمح laminin-1 لتبقى على ساترة وليس تنتشر على قاع الطبق الثقافة، وهو مطلوب.
  5. وضع غطاء على طبق والسماح laminin-1 لاحتضان لمدة 2-3 ساعة في درجة حرارة الغرفة (3 ساعة هو الأمثل).
  6. بعد laminin-1 الحضانة، شطف coverslips باستخدام تقنية العقيم مع برنامج تلفزيوني العقيمة في غطاء تدفق الصفحي. إزالة الحل على ساترة وإضافة 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. الانتظار 5-10 دقيقة. تكرار لما مجموعه 3 يشطف.
  7. ترك برنامج تلفزيوني على ساترة بعد شطف الماضي. لا كسر التوتر السطحي أثناء الشطف وعدم السماح coverslips لتجف. لوغطاء افي على حتى على استعداد لوحة الخلايا العصبية نأت على coverlip.

5. التفكك، وإثراء، والتثقيف DRG الخلايا العصبية - الجزء 2

  1. بعد الحضانة، واستخدام 10 مل ماصة معقمة لشطف بلطف الجزء السفلي من 100 ملم صحن يحتوي على خلايا DRG فصلها. عقد الطبق في ~ 45 درجة زاوية، وسحب ~ 7 مل من F12HS10 مع مساعدات ماصة، ثم طرد بلطف 7 مل على ما يقرب من 1/3 من الطبق. تكرار 5X، طرد بلطف الخلايا العصبية.
  2. تدوير الطبق وتكرار الشطف الداخلي، لمدة ستة يشطف آخر، على 1/3 آخر من الطبق. كرر الإجراء مرة أخرى للبقاء 1/3 من الطبق. بهذه الطريقة، وشطف بلطف الجزء السفلي بأكمله من الطبق مع F12HS10 لإزالة الخلايا العصبية.
  3. باستخدام نفس ماصة، ونقل F12HS10 تحتوي على الخلايا العصبية من 100 ملم إلى 15 طبق أنبوب مخروطي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5-10 دقائق على 200 غرام لتكوير الخلايا.
  4. إزالة F12HS10، وترك بيليه دون عائق. بيليه resuspend مع 2 مل من F12H حرارة + ملاحق.
    5. استخدم عدادة الكريات لتحديد كثافة الخلية.
  5. تمييع الخلايا الضرورية كما هو الحال مع F12H + المكملات للحصول على التركيز المطلوب الطلاء (120،000 خلية / مل لcoverslips المغلفة مع / مل laminin-1 و 40،000 خلايا 1 ميكروغرام / مل لcoverslips المغلفة مع 20 ميكروغرام / مل laminin-1 8،16).
  6. إزالة برنامج تلفزيوني من coverslips المغلفة laminin ووضع على الفور 400 ميكرولتر من الخلايا على coverslips. نقل بعناية طبق لترطيب، 37 ° C ثقافة الخلية الحاضنة. السماح لاحتضان لمدة 1 ساعة على الأقل وحتى 3 ساعة للسماح الخلايا العصبية التمسك laminin-1.
  7. تحت ظروف معقمة، الفيضانات بلطف 35 ملم الأطباق التي تحتوي على الخلايا العصبية مع 1.6 مل من F12H + ملاحق.
    ملاحظة: في هذا الوقت، يمكن تقسيم السطح التوتر على ساترة. الخلايا العصبية انضمت كاف لlaminin-1 على ساترة.
  8. العودة الخلايا الحاضنة واحتضان بين عشية وضحاها. إجراء تجارب مثل مناعية في اليوم التالي.

6. أناmmunocytochemistry

  1. قبل مناعية، حل تثبيتي الدافئ (بارافورمالدهيد 4٪، 30٪ سكروز 2X PBS) في 37 ° C حمام الماء.
    ملاحظة: قبل تثبيت الخلايا، وعلاج مع مختلف الكواشف، مثل netrin-1، المنغنيز 2+، القنفذ سونيك، semaphorin، وephrin 16،29-31.
  2. إزالة ببطء 1 مل من مل 2 من F12H + ملاحق من صحن الثقافة. بلطف إضافة 1 مل من محلول تثبيتي تحسنت. السماح لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
  3. إزالة بعناية حل تثبيتي، وإضافة 2 مل PBS. تطبيق حل نحو حافة الطبق، وتجنب بإزاحة ممكن من خلايا ثابتة نتيجة لتطبيق برنامج تلفزيوني. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. تكرار غسل PBS لما مجموعه 5 يغسل. لا تسمح للخلايا لتجف خلال أي خطوة من مناعية.
  5. إزالة برنامج تلفزيوني. تطبيق 1 مل من عرقلة الحل (0.1٪ تريتون-X، 1X PBS، 5٪ مصل الماعز العادي). احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، إلى وصمة عار الجزيئات السطحية، لا تستخدم تريتون-X في عرقلة الحل 8.
  6. تمييع الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل لكل توصية للتصنيع. استخدام 1: 500 عن الأجسام المضادة ضد NCAM والمفعلين β1 integrins 16. الحل إزالة الحجب، إضافة 1 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  7. إزالة حل الأجسام المضادة الأولية وإضافة 2 مل من 1X PBS. احتضان لمدة 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تكرار لما مجموعه 4 يغسل PBS. يغسل ويمكن تمديد، إذا لزم الأمر.
  8. تمييع الضد الثانوية 1: 1،000 في عرقلة الحل. إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 1 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية خفيفة حساسة. إبقاء حلول والخلايا في الظلام قدر الإمكان من هذه النقطة إلى الأمام.
  9. إزالة حل الضد الثانوية وشطف مع 5X 1X PBS، كما فعلت سابقا.
  10. تطبيق ~ 60-80 ميكرولتر من FluoromountG على شريحة المجهر. باستخدام ملقط غرامة، ورفع بلطف ساترة من الطبق وانخفاض ساترة في Fluoromount G على شريحة المجهر. تجنب فقاعات الهواء.
  11. متجر الشرائح أفقيا في 4 درجات مئوية في الظلام. بعد 12-24 ساعة، وFluormount G تتبلمر وسوف تعلق ساترة بحزم إلى شريحة المجهر. خلايا الصورة بعد هذه الخطوة البلمرة كاملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بروتوكول الموصوفة هنا تمكن المحققون إلى ثقافة السكان المخصب من فصلها الخلايا العصبية الحسية الجنينية مع عدد قليل جدا من الخلايا (على سبيل المثال، <5٪) غير العصبية 7،8،10،16. ويمكن الحصول على العديد من DRGs القطنية العجزية، الصدر ومناطق عنق الرحم. تبعا للاحتياجات المحقق، DRGs من هذه المناطق التشريحية متميزة يمكن عزله بسهولة. على سبيل المثال، ويبين الشكل 1 صور للجنين الفرخ من خلال مراحل مختلفة من تشريح مع DRGs قطني أبرزت في أرقام 1C و1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا نقدم بروتوكولات مفصلة لعزل وزراعة الخلايا العصبية الحسية فصلها من جنين الفرخ. يولد هذا الإجراء السكان المخصب من الخلايا العصبية المتنامية بقوة في المختبر 7،8،10،16. العديد من التقنيات الخلوية والجزيئية يمكن تطبيقها على هذه الخلايا العصبية مثقف، بما في ذلك مناعية، الذي يوصف هنا. وقد استخدم هذا البروتوكول في الآونة الأخيرة إلى تقييم كمي لشدة immunolabeled integrins تفعيلها في مخاريط النمو الحسية 8،16. في هذه الدراسات السابقة، تم استخدام برنامج حاسو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نود أن نشكر أليسون Philbrook، بليندا Barbagallo ومايكل فرانسيس للتعليقات الثاقبة على هذه الورقة. وأيد البحث عنها في هذا المنشور من قبل جائزة R15 AREA 1R15NS070172-01A1 منحت لMLL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطباق ثقافة صغيرة معقمة (35 مم)أطباق ثقافة كبيرة معقمة من كورنينج430165
(100 مم)معقمة من فالكون
(100 مم)VWR89000-302
(100 مم)ملقط VWRD108962
ناعمأدوات العلوم الدقيقة11251-10
ملقط قياسيأدوات العلومالدقيقة 1100-12
أغطية (22 × 22 مم)سمك فيشر12 518 105 كيلو0.13-0.17 مم هو الأمثل للفحص المجهري
حامل غطاء البورسلينتوماس العلمي8542E40
مصل الأبقار الجنينيجيبكو17502-048استخدم 50 مل من الحصص لكل 500 مل من وسائط Ham's F12
HClVWRVW3204-1استخدم عند 2 متر ، ويمكن استخدامه مرتين قبل التخلص
كلوريد الصوديومSigmaS9888استخدم محلول 5 M كلوريد الصوديوم لمحلول مخزون laminin-1
Laminin-1Invitrogen23017-015أضف 72 & micro ؛ ل من معقم 5 M كلوريد الصوديوم وaliquot إلى 50 & ميكرو; ل
معالجة خليةأنبوبية مخروطية229411
PBS CMF 10xGibco14200المستخدمة في 1x ، مخففة بالماء المصفى المعقم Millipore
PBS 10xGibco14080المستخدمة في 1x ، مخففة بالماء المصفى المعقم Millipore
Ham's F12Lonza12-615F
ألبومين مصل الأبقار الجنيني (BSA)Gibco10438استخدم في F12HS20 بنسبة 10٪
HEPESSigmaH3375اصنع محلول معقم 1 متر في الماء المقطر ، مخفف في وسائط F12 للحصول على التركيز النهائي ل 10 ملي مولار
البنسلين / الستربتوميوسينSigmaP0781استخدم 5 مل في 500 مل من وسائط F12
NT3MilliporeGF031أضف 1 مل من ماء Millipore المعقم ، وتناوله في ظروف معقمة ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ C ، استخدم بالتركيز النهائي 10 نانوغرام / مل في وسائط F12H ، والحفاظ على -20 درجة ؛ C الفريزر غير المزيل للذويب
أنظمة NGFRnD256-GFأضف 1 مل من 1x PBS المعقم مع 0.1٪ BSA ، aliquot في ظل ظروف معقمة ، وتخزينها عند -20 درجة ؛ C ، تستخدم في التركيز النهائي ل 10 نانوغرام / مل في وسائط F12H
L-GlutamineSigmaG7513aliquot في ظل ظروف معقمة ، تخزينها في -20 درجة ؛ C ، استخدم بتركيز نهائي يبلغ 200 ملي مولار في وسائط F12H
TrypsinSigmaT4049aliquot في ظروف معقمة ، وتخزينها عند -20 درجة ؛ ألبومين
مصل الأبقار C (BSA)Gibco15260
العناصر الأخرى المطلوبة: أدوات التشريح العامة ، بما في ذلك ماصات باستور الزجاجية ، وبيض الدجاج الأبيض الخصب ، وحاضنة البيض (رطبة ، 37 درجة ؛ ج) ، غرفة حضانة الخلية (رطبة ، 37 درجة ؛ ج) ، غطاء التدفق الصفحي ، نطاق تشريح الرؤية المجسمة مجهري
السكروز ، 2x PBS)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
تقنيات مصل الماعزالعاديPCN500
شرائح المجهرVWR16004-430
<قوية>جدول الأجسام المضادة الأولية< / قوي >
جسم مضاد ضد NCAMMilliporeAB5032
الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد منشط وتجريبي ؛ 1 ingegrinMilliporeMAB19294أحادي النسيلة
الماعز المضاد للفأر IgG Alexa 488تقنيات الحياةA11001
تقنيات الماعز المضادة للأرانب IgG Alexa 548Lifeتقنيات A11036
أطباق بتري كبيرة 353003 طبق بتري زجاجي من 15 مل العينين < td colspan = "4" ><قوي>جدول كواشف الكيمياء المناعية< / قوي> السكروز Sigma S9378 المستخدم في المحلول المثبت (4٪ paraformaldehye ، 30٪ سكروز ، 2x PBS) Triton-X 100 Sigma T-8787 Paraformaldehyde Sigma P6148 المستخدمة في محلول التثبيت (4٪ paraformaldehye ، 30٪ < TD colspan = "4" ><قوي>جدول الأجسام المضادة الثانوية < / قوي >

المراجع

  1. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
  2. Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
  3. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
  4. Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
  5. Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
  6. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
  7. Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
  8. Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
  9. Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
  10. Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
  11. Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
  12. Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
  13. Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
  14. Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
  15. Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
  16. Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
  17. Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
  18. Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
  19. Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
  20. Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
  21. Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
  22. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  23. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921(2013).
  24. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
  25. Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
  26. Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
  27. Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
  28. Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
  29. Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
  30. Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
  31. Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
  32. Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
  33. Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
  34. Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
  35. Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

العزلة وثقافة فصل الخلايا العصبية الحسية من الفرخ الأجنة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.