مقالة منهجية

تشكيل مستعمرة الفحص لينة آجار

DOI:

10.3791/51998

⸱

أكتوبر 27, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, University of Illinois at Chicago, 2Department of Pulmonary, Critical Care, Sleep, and Allergy, University of Illinois at Chicago, 3Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقايسة تكوين مستعمرة الأجار الناعمة هي طريقة تستخدم لتأكيد النمو المستقل عن الارتساء الخلوي في المختبر. الهدف من هذا البروتوكول هو توضيح طريقة صارمة للكشف عن الإمكانات السرطانية للخلايا المحولة والتأثيرات المثبطة للبروتينات للورم على الخلايا المحولة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النمو المستقل عن المرسى هو قدرة الخلايا المحولة على النمو بشكل مستقل عن سطح صلب ، وهو سمة مميزة للتسرطن. يعد اختبار تكوين مستعمرة الأجار الناعمة طريقة راسخة لتوصيف هذه القدرة في المختبر ويعتبر أحد أكثر الاختبارات صرامة للتحول الخبيث في الخلايا. يسمح هذا الاختبار أيضا بتقييم شبه كمي لهذه القدرة استجابة لظروف العلاج المختلفة. هنا ، سوف نوضح مقايسة تكوين مستعمرة الأجار الناعمة باستخدام خط خلايا سرطان رئة الفئران ، CMT167 ، لإثبات التأثيرات المثبطة للورم لعضوين من مسار إشارات Wnt ، Wnt7A و Frizzled-9 (Fzd-9). تسبب الإفراط في التعبير المتزامن ل Wnt7a و Fzd-9 في تثبيط تكوين المستعمرة في خلايا CMT167. هذا يدل على أن التعبير عن ترابط Wnt7a ومستقبله المجعد 9 كاف لقمع نمو الورم في نموذج سرطان رئة الفئران.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتقييم التحول الخلوي في المختبر. تاريخيا، تم استخدام فحص آخر، لفحص مولد الرمع، التي وصفها الصولجان وآخرون في عام 1956 لتقييم قدرة الخلايا على تكوين مستعمرات 1. في هذه التقنية، وفرقت الخلايا على لوحة الثقافة، وتنمو في وجود الخلايا المغذية "أو المتوسطة مكيفة لتوفير عوامل النمو اللازمة. كان الحد من هذه التقنية أنها قدمت فقط المعلومات المتعلقة تشكيل مستعمرة. يتم منع الخلايا الطبيعية من النمو مرسى مستقل، نظرا لنوع معين من الموت أفكارك، ودعا anoikis 2. ومع ذلك، تحولت الخلايا لديها القدرة على النمو والانقسام من دون ملزم لالركيزة. للاستفادة من هذا المفهوم، طور الباحثون لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص. ومنذ ذلك الحين تم تعديل أجار لينة تشكيل مستعمرة الفحص، في السنوات الأخيرة، من أجل التصدي ليرة سوريةاحتياجات ecific. تباين واحد ينطوي على دمج صبغة فلوروميتريك للسماح الإنتاجية العالية مستعمرة العد. اختلاف آخر ينطوي استخدام الحل أجار متخصص للسماح للاسترجاع من خلايا قابلة للحياة بعد تشكيل مستعمرة عندما تكون هناك حاجة البروتين أو الحمض النووي العينات.

في أجار لينة تشكيل مستعمرة الفحص التقليدي، وتزرع الخلايا في طبقة من أجار لينة مختلطة مع خلية ثقافة المتوسط ​​الذي يرتكز على طبقة أخرى من أجار لينة، ويخلط أيضا مع خلية ثقافة المتوسط، ولكن تحتوي على تركيز أعلى من أجار. هذا يمنع الخلايا من الانضمام إلى لوحة الثقافة، ولكن يسمح تحول الخلايا لتشكل مستعمرات مرئية. الأساس المنطقي وراء هذه التقنية هو أن الخلايا الطبيعية تعتمد على الخلية إلى خارج الخلية اتصال مصفوفة لتكون قادرة على النمو والانقسام. على العكس، تحول الخلايا لديها القدرة على النمو والانقسام بغض النظر عن البيئة المحيطة بهم. وبالتالي، كانت خلايا قادرة على تشكيل مستعمرات بطريقة مستقلة ج-مرسىonsidered أن تتحول ومسرطنة. الهدف العام من هذه الطريقة هو قياس هذه القدرة في الخلايا بطريقة شبه الكمية وصرامة.

إشارات الطريق WNT أمر بالغ الأهمية في التطور الجنيني، وغالبا ما ينظم دي في تكون الأورام 3-6. هناك مسارات متعددة ترتبط مع إشارات WNT. مسار قانوني ينطوي على إشارات WNT وتنظيم النسخ الجيني المصب من خلال آثاره على coactivator النسخي بيتا كاتينين. Wnts أيضا إشارة من خلال عدة مسارات غير متعارف عليها، على سبيل المثال، في مسار مستو قطبية الخلية، والذي ينظم العناصر المتورطة في بنية هيكل الخلية 7، ومسار WNT الكالسيوم، الذي ينظم إطلاق الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية 8. بروابط WNT تمارس أنشطتها من خلال ربط مستقبلات Frizzled. على الرغم من أن عدة Wnts وقد ثبت أن upregulated في سرطان الرئة، وقد تبين Wnt7a أن ينظم إلى أسفل في غير األصغرل خلية سرطان الرئة من خلال المروج مثيلة 9. Wnt7a تربط Fzd9 وبمثابة القامع الورم من خلال مسار غير متعارف عليه. استعادة WNT-7A وFZD-9 يمنع نمو خلايا غير صغيرة خلية سرطان الرئة 10. وتوسط آثار Wnt7a / Fzd9 من خلال تفعيل إرك-5، والذي بدوره، ينشط بيروكسية تنشيط مستقبلات ناشر γ (PPARγ) 11،12. هنا، وتبين لنا أن overexpression من Wnt7a وFzd9 النتائج في قمع النمو مرسى مستقل لسرطان الرئة خط الخلية الفئران. تم اشتقاق خلايا CMT167 الفئران من سرطان الرئة في C57BL / 13 الفئران lcrf وكانت ستابلي مع Wnt7A وFzd9. وقد أكد overexpression من Wnt7A وFzd9 بواسطة الكمي-PCR (Q-PCR) وظائف Wnt7A وFzd9 overexpression وأكد من خلال تفعيل المصب من PPARγ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد المواد والكواشف

  1. تسمية كل بئر من زراعة الأنسجة تعامل وحة 6 جيدا بشكل مناسب لكل خط الخلية أو حالة قيد التحقيق.
  2. إعداد 2X مستنبت الخلايا عن طريق إذابة 1 غرام من مسحوق المتوسطة و 0.2 غرام من بيكربونات الصوديوم في دي المتأينة المياه إلى الحجم النهائي من 50 مل.
  3. تمر هذه الوسيلة من خلال مرشح 0.2 ميكرون لتعقيم.
  4. إضافة مكونات إضافية لازمة لثقافة طبيعية للخط الخلوي من الفائدة. على سبيل المثال، تنمو CMT خط 167 خلية في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين حل. المتوسط ​​الدافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء الساخن قبل استخدامها.
  5. إعداد 1X خلية ثقافة المتوسط ​​بشكل منفصل كما تفعل لزراعة الخلايا العادية من خط خلية من الفائدة.
  6. إعداد 1٪ أجار النبيل بإضافة 1 غرام من أجار نبيلة إلى 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: سوف نوبل أجار لا تذوب تماما مع الانفعالات وحدها.
  7. إعداد0.6٪ نبيلة أجار عن طريق إضافة 0.6 غرام من أجار نبيلة إلى 100 مل من الماء دي المتأينة. كلا الحلول أجار ويمكن إجراء في 100 مل زجاجة الزجاج مع الأغطية محكمة السد للتخزين على المدى الطويل.
  8. الأوتوكلاف خلطات آغار النبيلة لتعقيم. هذه الخلطات يمكن إجراء في وقت مبكر وتخزينها في 4 درجات مئوية ولكن يجب أن يكون ساخنا مرة أخرى في وقت التجربة حتى يذوب تماما أجار.
  9. تحضير محلول كلوريد تترازوليوم نتروبلو بجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون في برنامج تلفزيوني 1X (8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.44 ز نا 2 هبو 4 و 0.24 غرام KH 2 PO 4 في H 2 O إلى الحجم النهائي من 1000 مل ). وسوف تستخدم هذه في نهاية التجربة وصمة عار على المستعمرات.

2. تصفيح من طبقة سفلية من آجار

  1. ترخي الغطاء على زجاجة من 1٪ أجار النبيل والميكروويف لمدة 1-2 دقيقة. في حين تسخين في الميكروويف، ومراقبة عن كثب الحل لتجنب غليان. مواصلة التدفئة، في حين خلط متقطع،حتى يذوب تماما أجار والحل واضح.
    ملاحظة: استخدم قفازات مقاومة للحرارة للتعامل مع قارورة بعد التسخين. الفشل في القيام بذلك قد يؤدي إلى حرق أو إصابة خطيرة.
  2. وضع ذاب حل أجار وقبل تحسنت مستنبت 2X في دلو الجليد مملوءة ماء الصنبور الساخن (42 درجة مئوية). وضع أيضا أنبوب مخروطي 50 مل في حامل أنبوب في دلو الثلج مع الماء الساخن. دلو لنقل ثقافة خلية غطاء للخطوات اللاحقة.
  3. للطبقة السفلية من أجار، سوف تحتاج 1.5 مل من مزيج من أجار والمتوسطة في بئر من لوحة 6 جيدا.
  4. لضمان وجود كمية كافية من هذا الخليط، وإعداد ما مجموعه 12 مل لكل لوحة 6 جيدا.
  5. نبدأ بإضافة 6 مل من مستنبت إلى 50 مل أنبوب مخروطي ثم 6 مل من 1٪ الحل أجار النبيل.
  6. عكس أنبوب مخروطي عدة مرات لخلط. سوف نعمل بخطى سريعة منع تصلب المبكر للأجار لينة.
  7. وضع ما يقرب من 5.5 مل من الخليط في 5 مل بي المصليةpette.
  8. السماح لفقاعات الهواء لترتفع إلى أعلى العمود ماصة قبل إيداع 1.5 مل من هذا الخليط في كل بئر. توخي الحذر لتجنب ترسب أي فقاعات الهواء في الآبار لوحة.
  9. تغطية لوحات والسماح خليط أجار ليصلب في درجة حرارة الغرفة، في الثقافة خلية غطاء محرك السيارة، لمدة 30 دقيقة.

3. طلاء الطبقة العليا من الخلايا التي تحتوي على آجار

  1. مرة واحدة وقد عززت الطبقة السفلى من أجار، يبدأ التحضير للطبقة العليا.
  2. أولا، من قبل خلايا الحصاد trypsinization وتمييع لهم 1: 5 في مستنبت (مثلا 1 مل من التربسين، إضافة 4 مل من المتوسط) في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  3. عد الخلايا وحساب عدد الخلايا اللازمة لكل بئر لإعداد تعليق خلية النهائي في هذا الوقت. وهذا العدد تختلف تبعا لنوع الخلية. استخدام 5000 خلية / كذلك نقطة انطلاق وتعديل حسب الحاجة. لذلك عدد الخلايا، وكنت إعداد تعليق خلية من 6667 خلية / مل (أي كل أهلا وسهلاسوف يحصل ل 0.75 مل من هذا التعليق و 0.75 مل من أجار لإجمالي حجم 1.5 مل. وسيتم أيضا تركيز خلايا تخفيفه 1: 2 لعدد الخلايا الكلي للنهائي 5000).
  4. فإن حجم التعليق الخلية اللازمة لكل بئر من لوحة 6 جيدا مرة أخرى تكون 1.5 مل. إعداد تعليق خلية إضافي بقيمة 12 مل لكل لوحة 6 جيدا.
  5. تذوب 0.6٪ محلول أجار في الميكروويف على النحو الوارد أعلاه ووضعها في دلو الثلج التي تحتوي على الماء الساخن مع 50 مل أنبوب مخروطي الشكل في حامل أنبوب وتعليق خلية النهائي من الخطوة 3.3.
  6. نقل دلو الثلج ذاب مع 0.6٪ أجار لغطاء محرك السيارة زراعة الخلايا لخطوات لاحقة.
  7. مزيج 0.6٪ أجار وتعليق خلية في نسبة 1: 1، وإعداد إجمالي حجم 12 مل لكل لوحة 6 جيدا. سيطلب 1.5 مل لكل بئر ولكن خارج ينبغي أن تدلي على النحو الوارد أعلاه.
  8. ماصة 6 مل من تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل.
  9. ثم، تضاف 6 مل من 0.6٪ أجار للأنبوب.
    ملاحظة: يجب أن تكون درجة حرارة هذا الخليطأبقى حوالي 42 درجة مئوية لتفادي تصلب سابق لأوانه وتعظيم بقاء الخلية.
  10. العمل بسرعة، ماصة هذا الخليط 2-3x لتوزيع الخلايا، ثم وضع 5.5 مل من الخليط في 5 مل ماصة المصلية.
  11. يسمح أي فقاعات الهواء لترتفع إلى أعلى العمود ماصة قبل إيداع 1.5 مل من هذا الخليط في كل بئر. توخي الحذر لتجنب ترسب أي فقاعات الهواء في الآبار لوحة.
  12. السماح للخليط خلية / أجار ليصلب في درجة حرارة الغرفة، في الثقافة خلية غطاء محرك السيارة، لمدة 30 دقيقة قبل ان يضع الى 37 درجة مئوية الثقافة ترطيب الخلية الحاضنة.
  13. الوقت اللازم لتشكيل مستعمرة يختلف كاف لكل خط الخلية، عادة حوالي 21 يوما.
  14. ينبغي الحفاظ على طبقة المتوسطة من النمو خلال الطبقة العليا من أجار لمنع جفاف. 100 ميكرولتر من المتوسط ​​أضاف مرتين أسبوعيا كافية لهذا الغرض.

4. تلطيخ لوحات وعد المستعمرات

  1. خلايا صمة عار وذلك بإضافة 200 _6؛ لتر من محلول كلوريد تترازوليوم نتروبلو لكل بئر واحتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. مرة واحدة هي ملطخة المستعمرات، والتقاط صور فوتوغرافية من الآبار باستخدام تصوير والاعتماد المستعمرات باستخدام برمجيات تحليل الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير عن Wnt7A وFzd9 في CMT167 خلايا فعال في قمع الورم كما هو موضح لدينا أجار لينة تشكيل مستعمرة الفحص. مبدئيا، استخدمنا Q-PCR لإظهار أن يتم التعبير عن Wnt7A وFzd9 مرنا في مستويات منخفضة في CMT167 الخلايا. أظهرت خلايا CMT167 مستويات منخفضة من الذاتية Wnt7A وFzd9 بالمقارنة مع MLE 12 الخلايا، والفئران الظهارية الرئة خط الخلية تتحول SV40 (الشكل 1). ثم نحن transfected CMT167 الخلايا مع اثنين من ناقلات overexpression فيروسات معربا عن يبني الإنسان من Wnt7A (LNCX-Wnt7A...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تأكيدا من المختبر وظيفة الورم القمعية من البروتينات مما يشير أمر صعب. واحدة من فحوصات أكثر صرامة المتاحة لتحقيق هذه الخاصية هي لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص. هنا، ونحن قد يتضح لينة أجار الفحص تشكيل مستعمرة باستخدام سرطان الرئة خط الخلية الفئران overexpressing مستقر Wnt7a وFzd9 مقارنة الوالدين خط الخلية CMT167 لها.

هناك العديد من النقاط الهامة التي يجب مراعاتها فيما يتعلق الفحص أجار لينة. الخطوة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة بجائزة الاستحقاق من وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة R01CA1385282522717 إلى RW.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خط اهتمام الخلايا السرطانيةSigma-Aldrich10032302خلايا CMT-167
مسحوق RPMI 1640 متوسطGibco31800-089تستخدم لتحضير وسط زراعة الخلايا 2x.
يشار إلى Liquid RPMI 1650 MediumCellgro10-040-CVباسم وسيط زراعة الخلايا 1x.
مصل الأبقار الجنينيHyCloneSH30910.03يستخدم لتكملة وسط زراعة الخلايا.
البنسلين / الستربتومايسينCellGro30-002-Clيستخدم في وسط زراعة الخلايا.
Difco Noble AgarBD Biosciences214230يستخدم لتحضير 1.0٪ و 0.6٪ أجار.
بيكربونات الصوديومفيشرBP-328-1تستخدم في وسط زراعة الخلايا 2x.
مرشحات التربسينCellgro25-050-Cl
معقمة للزجاجةفيشر09-761-126تستخدم لتعقيم الفلتر 2x متوسط.
كاشف ليبوفاكتامينInvitrogen18324-020يستخدم في اختبار PPAR-RE luciferase.
6-آبار لوحات ثقافة الأنسجة المعالجة
37 &# 176; C / 5٪ CO2< / sub> حاضنة
Chemi-Doc ImagerBio-Radتستخدم لالتقاط صور للمستعمرات.
الكمية واحدة برنامجBio-Radيستخدم لحساب مستعمرات الخلايا.
15 مل أنابيب
50 مل أنابيب
250 مل قوارير
ميكروويف
5 مل ماصات
ماصة ماصة
ماصة دقيقة
الدم مع غطاء زلة
ماصة نصائح
مقلوب المجهر
الخفيف الطرد
قفازات
ساران التفاف
دلو
مخروطيةمخروطيةإرلين مايرمصلية مقياس المركزيمقاومة للحرارة الثلج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
  2. Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases. The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).
  3. Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).
  4. Reya, T., et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414 (2003).
  5. Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
  6. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
  7. Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells. Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).
  8. De, A. Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).
  9. Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer). PLoS One. 7, (2012).
  10. Winn, R. A., et al. Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation. J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).
  11. Winn, R. A., et al. Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).
  12. Tennis, M. A., et al. Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer. Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).
  13. Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma. Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Wnt7A Fzd 9 CMT167

مقالات ذات صلة