مقالة منهجية

تقنيات التجريبية والتصوير لدراسة الهياكل الليفين الجلطة في السليمة والمصابة الولايات

DOI:

10.3791/52019

⸱

أبريل 1, 2015

 ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المخطوطة ، يتم تقديم تقنيات تجريبية ، بما في ذلك تحضير الدم ، والفحص المجهري متحد البؤر ، وتحليل معدل التحلل ، لفحص الاختلافات المورفولوجية بين هياكل الجلطة الطبيعية وغير الطبيعية بسبب الحالات المريضة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيبرين هو بروتين مصفوفة خارج الخلية مسؤول عن الحفاظ على السلامة الهيكلية لجلطات الدم. تم إجراء الكثير من الأبحاث على الفيبرين في السنوات الماضية لتشمل التحقيق في التوليف ، ووظيفة البنية ، وتحلل الجلطات. ومع ذلك ، لا يزال هناك الكثير من الأشياء غير المعروفة حول السمات المورفولوجية والهيكلية للجلطات التي تنشأ عن المرضى الذين يعانون من المرض. في هذه الدراسة البحثية ، يتم تقديم تقنيات تجريبية تسمح بفحص الاختلافات المورفولوجية لهياكل الجلطات غير الطبيعية بسبب الحالات المريضة مثل مرض السكري وفقر الدم المنجلي. تركز دراستنا على تحضير وتقييم جلطات الفيبرين من أجل تقييم الاختلافات المورفولوجية باستخدام العديد من المقايسات التجريبية والفحص المجهري متحد البؤر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف طريقة تسمح بالحساب المستمر في الوقت الفعلي لمعدلات التحلل في جلطات الفيبرين. التقنيات الموضحة هنا مهمة للباحثين والأطباء الذين يسعون إلى توضيح أمراض التخثر المصاحبة مثل احتشاء عضلة القلب وأمراض القلب الإقفارية والسكتات الدماغية لدى مرضى السكري أو مرض فقر الدم المنجلي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إصلاح إصابة البطانية بطانة الأوعية الدموية من خلال الاستجابة مرقئ، أو تشكيل لتجلط الدم. عندما يتخلل الدم في المصفوفة خارج الخلية، والعوامل الأنسجة تنشيط الصفائح الدموية في مجرى الدم التي تسهل الشروع في شلال التخثر. المكون الميكانيكي الرئيسي من هذه العملية هو شفاء المصفوفة الليفين، وتتألف من ألياف الفيبرين التي هي مرنة للغاية، ويمكن الحفاظ قوات كبيرة 1-4. لقد درس كثير من الباحثين بنية تشكيل وظيفة الفيبرين على نطاق واسع في العقود الماضية 5-13.

المرضى الذين يعانون من أمراض مثل داء السكري وفقر الدم المنجلي لديهم خطر متزايد لتطوير مضاعفات الجلطات مثل احتشاء عضلة القلب وأمراض نقص تروية القلب، والسكتات الدماغية 14-19. يتم تشخيص أكثر من 2 مليون شخص حديثا مع داء السكري كل عام في الولايات المتحدة. هناك نوعان من مرض السكري: النوع الأول، حيثفشل الجسم على إنتاج كميات كافية من الأنسولين، والنوع الثاني، حيث يصبح الجسم مقاوما للأنسولين. بين مرضى السكري، وأمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب ل80٪ من المراضة والوفيات المرتبطة بهذا المرض 20،21.

مرض فقر الدم المنجلي (SCD) هو اضطراب وراثي في الدم يؤثر على أكثر من 100،000 شخص في الولايات المتحدة (22). SCD هو مرض نقاط الطفرة التي تسبب خلايا الدم الحمراء لتصبح على شكل هلال، مما يجعل من الصعب على الخلايا لتمر عبر الأوعية الدموية في الدم 23. كل من هذه الحالات المرضية تزيد من فرص تطوير الظروف atherothrombotic في الجسم. واحدة من أسباب ذلك هو نتيجة لهيكل الفيبرين تغيير وظيفة في الدول المريضة 14،24-26.

في كل من السكري ومرض فقر الدم المنجلي، وهناك hypercoagulation والنشاط hypofibrinolysis أن يدفع atherothrombosis وأمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) بالمقارنة مع المرضى الأصحاء 17،27،28. ومن المعروف أن hypofibrinolysis يشجع تصلب الشرايين التقدم ويولد الأحداث الدماغية المتكررة للمرضى الذين يعانون من السابق لأوانه مرض الشريان التاجي (29). في المخطوطة الحالية، ونحن التحقيق في دور الخصائص الفيزيائية الليفين في هذا الإعداد معين. وتتكون الهياكل جلطة الفيبرين في المرضى غير المريضة من ألياف رقيقة، والمسام الكبيرة، وعموما أقل كثافة 14،24. تم العثور على زيادة المسامية وجلطات الفيبرين أقل كثافة في المرضى الأصحاء لتسهيل انحلال الفيبرين 16. في ظروف hyperthrombotic مثل مرض الخلية المنجلية ومرض السكري، وهناك زيادة في الإنتاج الفيبرينوجين، مما تسبب في تركيز الفيبرينوجين إلى زيادة من المستويات العادية من 2.5 ملغ / مل في المرضى الأصحاء 30-33. تم العثور على تجلط الليفين التي تشكلت في مرضى السكري إلى أن تكون أقل مسامية، أكثر جمودا، على المزيد من النقاط فرع، وأكثر كثافة بالمقارنة مع الأصحاء، وعدم ديا-المرضى betic 14،24،33-35. هيكل الفيبرين تغيير هو نتيجة لآليات غلكأيشن التي تحدث في البروتينات المشاركة في تشكيل الجلطة. يحدث غير إنزيمي (لا رجعة فيه) غلكأيشن عندما ربط جزيئات الجلوكوز إلى بقايا يسين على جزيء الفيبرينوجين، الذي يثبط عامل XIIIa البشري (FXIIIa) من الجلوتامين ويسين المخلفات بشكل صحيح عبر ربط 33،36،37.

وقد تمت دراسة التحليل الهيكلي للشبكات الفيبرين على نطاق واسع في الآونة الأخيرة. على وجه الخصوص، واستخدمت الباحثين المجهر الإلكتروني وإعادة الإعمار 3D شبكات الفيبرين 38، التحقيق في الكيفية التي تؤثر بها على حد سواء داخل الأوعية الدموية (البطانية) الخلايا وخارج الأوعية (الخلايا الليفية والعضلات الملساء) خلايا هيكل الفيبرين 39، اللزجة المستخدمة والتحليل الطيفي لتحليل الهياكل الفيبرين 40، و الارتباطات المتقدمة بين هيكل الفيبرين والخواص الميكانيكية باستخدام التجريبية والنهج الحاسوبية 41 . وكان التركيز في الدراسة الحالية لصياغة هياكل جلطة في ظل ظروف السكري والجلطة خلية المنجل محاكاة واستخدام متحد البؤر المجهري لفحص بنية ووظيفة جلطات في الدول المريضة. وتم تشكيل جلطات الليفين من الفيبرينوجين البشري، الثرومبين البشري، وFXIIIa. وهي lysed الجلطات باستخدام بلازمين. لمحاكاة الظروف السكري، وقد حضنت زيادة تركيز الفيبرينوجين في حل الجلوكوز للحث في المختبر الفيبرينوجين غلكأيشن. لمحاكاة الظروف تخثر مرض الخلية المنجلية، كانت مختلطة زيادة تركيز الفيبرينوجين مع الهيماتوكريت المنجلي تم جمعها من المرضى كما فعلت سابقا من قبل لدينا مجموعة 42. وقد استخدمت هذه الأساليب لدراسة هيكل ووظائف المشاركة في تشكيل جلطة الفيبرين وانحلال الفيبرين في ظل ظروف المريضة، فضلا عن الآليات التي تحفز الأمراض القلبية الوعائية. وبناء على المعلومات الحالية حول هذه الأمراض، كانت الهياكل الفيبرين جلطة السكري أكثر كثافة مع عدد أقل منالثانية المسام أصغر. وكانت جلطات الفيبرين مع خلايا الدم الحمراء من مرضى فقر الدم المنجلي (كرات الدم الحمراء) أيضا أكثر كثافة وعرضها التجميع من كرات الدم الحمراء ومجموعات الفيبرين مكتل. وهذه ظاهرة راسخة الذي تم تحديده سابقا 43. وقد افترض أيضا أن معدل انحلال الفيبرين سيكون أقل من ذلك بكثير في تجلط الليفين السكري مع وبدون تخفيض بلازمين مقارنة صحي، الفيبرين العادي. وأظهرت النتائج أن للجلطات الفيبرين السكري، ولوحظت نتائج معدل تحلل مختلفة إلى حد كبير إلا في ظل ظروف انخفاض تركيز بلازمين. هذه التقنية التجريبية من استخدام متحد البؤر المجهري تقدم مزايا هامة على طرق التصوير الأخرى لأن الخلايا والبروتينات لا تزال في دولتهم الأم، والتي تمكن من التقاط الفيديو في الوقت الحقيقي لنشاط التخثر. هذا الأسلوب من تخثر حمل صناعي هو أيضا أرخص وأكثر كفاءة من الوقت الحصول على عينات من المرضى وتصفية فردالبروتينات والانزيمات. وعلاوة على ذلك، عن طريق استخدام البروتينات والانزيمات فصل لتجميع الجلطات، وموحدة للجلطات بحيث لم يكن هناك التباين بين العينات نتيجة لبروتينات أخرى في البلازما.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: بروتوكول التالية تلتزم المبادئ التوجيهية التي وضعها مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في معهد جورجيا للتكنولوجيا.

1. جمع الدم والدم الحمراء إجراء عزل خلية

  1. جمع 40-120 مل من الدم من المتبرعين في 10 مل أنابيب vacutainer heparinized. بدء PBMC (الطرفية خلية mononucleated الدم) العزلة داخل 4 ساعات من جمع. خلال هذا الوقت، والحفاظ على الدم في RT.
    ملاحظة: O / N تخزين الدم في RT أو في 4 ° C لا ينصح لأن هذا سيؤدي إلى انخفاض العائد PBMC.
  2. تمييع الدم الكامل 1: 1 في الجليد الباردة (4 ° C) PBS العقيمة.
  3. ماصة 10 مل من الجليد الباردة السكاريد ماء في علبة فارغة، معقم 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. بلطف نقل الدم الكامل المخفف على رأس السكاريد ماء.
  4. استخدام ماصة 25 مل في وضع بطيئة وماصة الدم على طول الجانب من الأنبوب ببطء شديد. تأكد من أن الدم لا مختلطة مع السكريد قبل centrifugation لأن السكاريد ماء غير سامة للخلايا وإلا فإن العائد PBMC يكون أقل.
  5. عينات الدم أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 400 x ج في 4 درجات مئوية. إذا كان متوفرا، والحد من سرعة الفرامل من أجهزة الطرد المركزي إلى نصف الحد الأقصى للأفضل الانفصال بعد الطرد المركزي.
  6. نضح قبالة جزء بلازما / الصفائح الدموية من عينة من الدم طرد. نضح بعناية قبالة طبقة السكاريد ماء مباشرة فوق طبقة RBC معبأة.
  7. جمع 8-10 مل من كرات الدم الحمراء معبأة وتمييع 1: 1 مع غير معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم المالحة.

2. متحد البؤر المجهر تقييم السكري الهياكل الجلطة (مقلد السكري الجلطات)

  1. تذويب الفيبرينوجين البشري وfluorescently المسمى المكورات الفيبرينوجين البشري عند 37 درجة مئوية.
  2. ماصة ما يلي إلى 0.5 مل تخرج أنبوب microcentrifuge.
    1. لصحية، وجلطات الفيزيولوجية الطبيعية، ومزيج الفيبرينوجين البشري مع 10٪ fluorescently المسمى الفيبرينوجين البشريالمكورات في 50 ملي تريس / 100 مم كلوريد الصوديوم عازلة بتركيز 5 ملغ / مل.
    2. لالفيبرينوجين السكري بشكل مصطنع (لمحاكاة الجلطات لمرضى السكري)، واحتضان الفيبرينوجين البشري و 10٪ fluorescently المسمى الفيبرينوجين المترافقة في محلول 5 ملم من الجلوكوز المذاب في 50 ملي تريس / 100 مم كلوريد الصوديوم لتركيز الناتجة من 6.8 ملغ / مل.
  3. تغطية أنابيب الطرد المركزي الجزئي باستخدام مادة مبهمة لتجنب التعرض للضوء. احتضان الأنابيب في 37 ° C حمام الماء لمدة 48 ساعة.
  4. جعل الغرفة على المجهر شريحة زجاجية عن طريق لصق لاصقة رقيقة في 2 الجانبين من الشرائح.
  5. بعد فترة الحضانة 48 ساعة، وإعداد الكواشف لتكوين الفيبرين التي كتبها إزالة الجليد FXIIIa والثرومبين ألفا البشري في RT.
  6. تمييع FXIIIa إلى 80 U / مل في 5 ملي CaCl 2 العازلة.
  7. تمييع الثرومبين إلى 4 U / مل في 5 ملي CaCl 2 العازلة.
    1. لجلطات العادية، وضمان أن تركيزات النهائية من الفيبرينوجين، FXIIIa، والثرومبين هي 2.5 مترز / مل، 20 U / مل، و 1 U / مل على التوالي في حجم 50 ميكرولتر.
    2. لجلطات السكري، وضمان أن تركيزات النهائية من الفيبرينوجين، FXIIIa، والثرومبين هي 3.4 ملغ / مل، 20 U / مل، و 1 U / مل على التوالي في حجم 50 ميكرولتر.
  8. ماصة على الفور 30 ​​ميكرولتر من حل الليفين في غرفة شكلتها لاصقة.
  9. وضع 22 مم × 22 مم الغطاء الزجاجي الانزلاق بسمك 0.15 مم على أعلى من 2 طبقات من مادة لاصقة. ختم الجانبين مفتوحة مع لاصق واضحة لمنع تجلط الليفين من الجفاف. تأكد من أن لاصق لا تتفاعل مع جلطة الفيبرين.
  10. السماح للجلطات الليفين إلى تتبلمر في 21-23 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل التصوير متحد البؤر.
  11. التقاط صور المجهري مبائر من الجلطات باستخدام مجهر متحد البؤر مع 40X / 1.30 النفط M27 عدسة مع 488 نانومتر الأرجون ليزر.

3. متحد البؤر المجهر تقييم الليفين الجلطات التي تحتوي على كرات الدم الحمراء المنجلية المرضى من خلية

  1. تذويب الفيبرينوجين البشري وfluorescently المسمى المكورات الفيبرينوجين البشري عند 37 درجة مئوية.
  2. ماصة ما يلي إلى 0.5 مل تخرج أنبوب microcentrifuge.
    1. لصحية، طبيعية جلطة الفيبرين، مزيج الفيبرينوجين البشري مع 10٪ fluorescently المسمى المكورات الفيزيولوجية البشرية في 50 ملي تريس / 100 مم كلوريد الصوديوم عازلة بتركيز 5 ملغ / مل.
    2. لجلطات تحتوي على SCD كرات الدم الحمراء، ومزيج الفيبرينوجين البشري و 10٪ fluorescently المسمى المكورات الفيزيولوجية البشرية في 50 ملي تريس / 100 مم كلوريد الصوديوم مثل أن تركيز الناتجة من الفيبرينوجين هو 10 ملغ / مل.
  3. تسمية كرات الدم الحمراء المعزولة (سواء العادية وتلك من مرضى فقر الدم المنجلي تم الحصول عليها من بروتوكول العزلة RBC) باستخدام حل الخلية وضع العلامات.
    1. تعليق الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 في مل في أي اختيار المصل خالية مستنبت.
    2. إضافة 5 ميكرولتر / مل من تعليق الخلية إلى حل الخلية وضع العلامات. تخلط جيدا من قبل pipetting لطيف بلطف.
    3. الطرد المركزي أنابيب تعليق صفت في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    4. إزالة طاف وبلطف اعادة تعليق الخلايا في 37 ° C المتوسطة.
    5. كرر الإجراء غسل (3.3.4 و3.3.5) مرتين أخريين.
  4. تمييع FXIIIa إلى 80 U / مل في 5 ملي CaCl 2 العازلة.
  5. تمييع الثرومبين إلى 4 U / مل في 5 ملي CaCl 2 العازلة.
    1. لجلطات العادية، وضمان أن تركيزات النهائية من الفيبرينوجين، FXIIIa، والثرومبين هي 2.5 ملغ / مل، 20 U / مل، و 1 U / مل على التوالي في حجم 50 ميكرولتر.
    2. لجلطات تحتوي على SCD كرات الدم الحمراء، وضمان أن تركيزات النهائية من الفيبرينوجين، FXIIIa، والثرومبين هي 5 ملغ / مل، 20 U / مل، و 1 U / مل على التوالي في حجم 50 ميكرولتر.
  6. ماصة 10 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء وصفت في حل الفيبرين. ماصة 30 ميكرولتر من الفيبرين مع كرات الدم الحمراء على الزجاج المجهر (يرجى الرجوع إلى الشريحة استعدادا لGLجلطات ycated).
  7. السماح للالليفين إلى تتبلمر في 21-23 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل التصوير متحد البؤر.
  8. التقاط صور مبائر من الجلطات باستخدام المجهر متحد البؤر، واستخدام أشعة الليزر الإثارة مع موجات من 488 نانومتر و 633 نانومتر لإثارة الفيبرين fluorescently المسمى وكرات الدم الحمراء.

4. متحد البؤر المجهر تقييم انحلال الفبرين الأسعار السكري الهياكل الجلطة

  1. كرر بروتوكول المجهري متحد البؤر جلطات السكري (بروتوكول الخطوة 2) لتقييم معدل انحلال الفيبرين في جلطات السكري.
  2. لا ختم ينتهي من غرفة بمادة لاصقة واضح. السماح للجلطات الليفين إلى تتبلمر لمدة 1.5 ساعة عند 21-23 ° C في الضميمة مغلقة تحتوي على 250 مل من الماء لمنع الجفاف.
  3. بعد البلمرة، الحصول على صور من الجلطات باستخدام المجهر متحد البؤر.
  4. ماصة بلازمين في نهاية مفتوحة من الغرفة وتفريق بلازمين من خلال الجلطة عن طريق عمل شعري.
    1. إلىالتجارب انحلال الفيبرين العادية والسكري مع تركيزات العادية، ماصة 25 ميكرولتر في 200 ميكروغرام / مل من بلازمين في افتتاح القاعة.
    2. لجلطات السكري مع انخفاض تركيزات، ماصة 25 ميكرولتر في 50 ميكروغرام / مل في افتتاح القاعة.
  5. استخدام ميزة السلاسل الزمنية (انظر الشكل 1) في البرنامج المجهر متحد البؤر لالتقاط الوقت الحقيقي لقطات فيديو للبلازمين الناشر الجلطة.
    1. انقر فوق وضع اقتناء وثم حدد "السلاسل الزمنية". حدد عدد من الدورات والفاصل الزمني التسجيل.

5. حساب انحلال الفبرين أسعار

  1. تحديد معدل تحلل عن طريق تحديد مساحة (2،500 ميكرون 2) وحساب الوقت المنقضي اللازمة لإذابة منطقة محددة من الجلطة. حساب معدل تحلل باستخدام المعادلة التالية (الشكل 2):
    figure-protocol-1

6. التحليل الإحصائي للانحلال الفبرين أسعار

  1. تحليل البيانات تحلل باستخدام برنامج التحليل الإحصائي. إجراء ANOVA في اتجاه واحد وآخر خاص توكي-كرامر اختبار 44،45.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

متحد البؤر تحليل المجهر من السكري الليفين الهياكل الجلطة

وتعرض الصور المجهري مبائر جلطات العادية والسكري في الشكل (3). ويكشف تحليل متحد البؤر المجهري للجلطات العادية والسكري أن جلطات السكري هي أكثر كثافة مع المسام أصغر من جلطات طبيعية مع وبدون إضافة FXIIIa خلال البلمرة الجلطة على حد سواء. في الشكل 3A و 3B، هناك تركيز أقل الليفين الذي خلق بنية أقل كثافة من جلطات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للحصول على بيانات ذات مغزى حول بنية آليات التخثر في الحالات المرضية، من المهم لعزل العوامل التي تدخل في تخثر لتحديد الآثار المترتبة على البروتينات والخلايا في هذه الظروف. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لأغراض التحقيق في هيكل جلطة الفيبرين في الدول السكري وSCD في المختبر.

فمن الضروري لفهم الآليات التي تشارك في تكوين الفيبرين وانحلال الفيبرين في الحالات المرضية منذ الظروف المتغيرة تسبب hypercoagulation، ather...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا Lam Lab في Georgia Tech على العديد من المناقشات المفيدة في تطوير المقايسات التجريبية. تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم K01HL115486 ومنحة المبتكر الجديد 1DP2OD007433-01 من مكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (عديد السكاريد المائي المحبة)GE Healthcare45-001-749
10 مل أنابيب الفراغ الهيبارين BDBiosciences366643
مختبرات أبحاث إنزيمالفيبرينوجين البشريN / A
المجسات الجزيئيةالمترافقة الفيبرينوجينF13191
0.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق المتدرجفيشر ساينتفيك05-408-120
مسحوق الجلوكوزلايف تكنولوجيز15023-02
مختبرات أبحاث الإنزيمFXIIIaمجهر
VIS مجهر متحد البؤرZeiss LSM 510LSM 510
50 mM تريسلونزاS50-642
كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD CellTechnologiesLife L7781
مختبرات أبحاث إنزيمالبلازمينN / A
كلوريد الصوديوم (5 M كلوريد الصوديوم) LifeTechnologiesAM9759
برنامج النمذجة الإحصائيةIBMSPSS Statistics 22
Alexa Fluor 488 البشري متحد البؤر N / A Sealing

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781(2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212(1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة