لتحليل القلب ملامح التعبير الجيني أثناء نمو القلب الزرد، لابد من استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من قلوب معزولة. هنا، نقدم بروتوكول لجمع وظيفية / قلوب الضرب السريع تشريح اليدوي من أجنة الزرد الحصول مرنا القلب محددة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتكون القلب الجنينية الزرد فقط بضعة مئات من الخلايا، التي تمثل سوى جزء صغير من الجنين بأكمله. لذلك، لمنع Transcriptome على القلب من أن تقنع من خلال Transcriptome على الجنينية العالمي، فمن الضروري لجمع أعداد كافية من قلوب لمزيد من التحليلات. وعلاوة على ذلك، مع استمرار التطور القلب الزرد بسرعة، وجمع القلب وطرق استخراج الحمض النووي الريبي تحتاج إلى أن تكون سريعة لضمان تجانس العينات. هنا، نقدم اليدوي السريع بروتوكول تشريح لجمع وظيفية / قلوب الضرب من الأجنة الزرد. هذا هو شرط أساسي لاحق القلب محددة استخراج الحمض النووي الريبي لتحديد مستويات القلب محددة التعبير الجيني عن طريق تحليل Transcriptome على مثل الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-QPCR). وتستند هذه الطريقة على الخصائص التفاضلية لاصقة من القلب الجنينية الزرد مقارنة مع الأنسجة الأخرى. وهذا يسمح للفيز السريعالفصل sical من القلب من أنسجة extracardiac من قبل مجموعة من فلويديك تعطيل قوة القص، والترشيح تدريجي وجمع اليدوي المعدلة وراثيا قلوب fluorescently المسمى.
المقدمة
ويستخدم الزرد (دانيو rerio) على نطاق واسع في علم الأحياء التنموي لدراسة توالد الأعضاء في الجسم الحي بسبب تطورها الجنيني سريعة وشفافة وخارج الرحم، جنبا إلى جنب مع صغر حجمها وتوافر خطوط مراسل المعدلة وراثيا مع التعبير الأنسجة محددة من البروتينات الفلورية. بشكل خاص يناسب هذا الفقاريات الصغيرة بشكل جيد لدراسة تطوير القلب بسبب الأوكسجين للجنين الزرد في وقت مبكر لا تعتمد على ضربات القلب وتدفق الدم. وقد سمحت هذه الميزات توصيف أعداد كبيرة من المسوخ القلب والأوعية الدموية 1،2 والزرد هو الآن كائن نموذج المعترف بها على نطاق واسع لدراسة أمراض القلب 3.
لدراسة التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني، ويتم تحليل النصوص عادة من قبل جبل لالجامع في الموقع التهجين (WISH) 4، وRT-QPCR 5، 6 ميكروأرس، أو الجيل القادم التسلسل (RNA تسلسل) 7. في حينWISH يسمح للتحليل المكاني الزماني للالتعبير الجيني داخل الجنين بأكمله، يتم تقييمها عادة مستويات النص التي كتبها RT-QPCR، ميكروأرس أو النهج RNA يليها. ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب تخصيب الأنسجة لمحدد التنميط التعبير الجيني.
منذ القلب الجنينية الزرد يمثل جزءا صغيرا من جنين كامل، ودراسات Transcriptome على أثناء التطور القلب تتطلب بروتوكول للتشريح وإثراء القلوب. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، من المهم للحفاظ على نسيج القلب تعمل بكامل طاقتها حتى استخراج الحمض النووي الريبي. هنا، نحن تصف بروتوكول للعزل بسرعة طبيعية من الناحية الفسيولوجية وضرب قلوب من مئات الأجنة الزرد الحصول على عينات الحمض النووي الريبي جودة عالية بكفاءة لمزيد من التحليلات. ويستند هذا الأسلوب على بروتوكول ذكرت من قبل بيرنز وماكراي 2006 8. لإثراء الأنسجة القلبية، سواء طرق استخدام خط مراسل عضلة القلب المعدلة وراثياوالاستفادة من الخصائص التفاضلية التصاق قلوب الجنينية الزرد مقابل الأنسجة الأخرى. لفترة وجيزة، قبل pipetting العديد من الأجنة صعودا وهبوطا من خلال طرف ماصة ضيق، يتم الإفراج قلوب في وقت واحد من الهيئات الجنينية وبعد ذلك فصل من الحطام الجنينية في خطوتين الترشيح السريعة؛ ثم يتم فرز قلوب fluorescently المسمى يدويا من الحطام المتبقي وجمع لمزيد من المعالجة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من القانون الألماني والدولة برلين. تم رصد معالجة الزرد من قبل السلطة المحلية لحماية الحيوان (LaGeSo، برلين-براندنبورغ).
1. الحصول على اسماك الزرد الأجنة لاستخراج القلب
- عبر مراسل القلب الزرد مثل تيراغرام (myl7: EGFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9 من أجل الحصول على أجنة مع القلب محدد GFP التعبير.
- الحفاظ على الأجنة في الماء البيض في 28.5 درجة مئوية حتى المرحلة الجنينية المطلوب 10،11. ضمان حصول السكان الجنين جمعت متجانس على حد سواء وراثيا ومرحلة تنموية للحد من الاختلافات في التعبير الجيني.
- Dechorionate الأجنة يدويا.
2. تشريح الزرد الجنينية قلوب
ملاحظة: حافظ على كل الحلول على الجليد. إذا كان ذلك ممكنا، هل العمل الجماعي: شخص واحد يشرح قلوب من الإدارة الانتخابيةryos بينما شخص آخر فرز قلوب تحت stereomicroscope مضان. وهذا يسمح للتجهيز عدة مئات من الأجنة في غضون ساعات قليلة.
- نقل حوالي 100 الأجنة في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي. تخدير الأجنة مع تريكين (0.16 ملغ / مل في E3 المتوسطة). المضي قدما مرة واحدة يتم تخدير الأجنة بشكل واضح (لا السباحة والرواسب إلى أسفل الأنبوب، ولكن قلوبهم لا تزال الضرب).
- إزالة تريكين / E3 حل ويغسل الأجنة مرة واحدة مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة والحفاظ على الجليد.
ملاحظة: متوسطة FBS L-15/10٪ مهم للحفاظ على الأجهزة والخلايا على قيد الحياة أثناء إجراء تشريح كامل حتى تم نقل القلوب إلى RNAlater أو Trizol. - إضافة 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة إلى الأجنة وماصة صعودا وهبوطا 5-8 مرات مع جولة جل تحميل تلميح حتى يتم تعطيل صفار البيض تماما. ماصة الأجنة انخفاض الحكيم على سطح من الحل، حتى أن انخفاض سوف تنفجر وتتعطل الأجنة بلطف.
ملاحظة: كيف بقوة وعدد المرات الأجنة يجب أن pipetted صعودا وهبوطا يعتمد على المرحلة التنموية للأجنة، هناك حاجة إلى أي مزيد من pipetting لفي مراحل متأخرة (على سبيل المثال في 56 HPF). - لأول دفعة من الأجنة تشريح، وتقييم سلامة الأجنة ونسبة قلوب تشريح تحت stereomicroscope، منذ بعض القلوب قد تبقى تعلق على الأجنة إذا pipetted بلطف جدا. ضبط طريقة pipetting لللجولات المقبلة من تشريح وفقا لذلك.
ملاحظة: استخدم منخفضة نصائح ماصة والاحتفاظ أنابيب microcentrifuge للحد من قلوب التمسك البلاستيك. - تطبيق العينة على مرشح 100 ميكرون وضعت على أنبوب 50 مل الطرد المركزي. شطف أنبوب 1.5 مل مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة ومن ثم تطبيق هذا إلى تصفية من أجل تقليل الخسائر في العينة (بعض القلوب قد تكون شائكة على جدران الأنبوب). غسل الفلتر مرتين مع 1 مل L-15 / 10٪ FBS. في هذه الخطوة قلوب تمر من خلال مرشح ويتم جمعها في أنبوب 50 مل.
- تطبيق التدفق من خلال الصعود إلى 30 ميكرون فلتر وضعت على أنبوب الطرد المركزي 15 مل وشطف مرشح مرة واحدة مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة. في هذه الخطوة الترشيح الثانية، يتم الاحتفاظ قلوب في تصفية ويتم غسلها أصغر الحطام قبالة.
- تحويل مرشح رأسا على عقب وتدفق قلوب من مرشح إلى 1٪ المغلفة الاغاروز طبق بتري من خلال تطبيق ثلاث يغسل متتالية مع 1 مل L-15/10٪ FBS.
- فصل يدويا قلوب GFP إيجابية من تحت الانقاض الجنينية nonfluorescent (مثل عدسات العين) مع زوج من ملقط تحت stereomicroscope مضان والتركيز عليها في وسط الطبق. جمعها وفقا لالخطوة 3.
ملاحظة: إذا الأجنة تكون أقدم من 24 HPF، وقلوب يجب الضرب، مشيرا إلى أن الأنسجة لا تزال طبيعية من الناحية الفسيولوجية.
3. عزل مرنا من Dissecتيد القلوب
- جمع قلوب في أصغر حجم ممكن (على سبيل المثال 10 ميكرولتر) وماصة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 0.75 مل RNAlater (على الجليد). تحقق من أن لا قلوب لا تزال في الطرف ماصة عن طريق عرض عليه تحت stereomicroscope مضان.
- بدلا من ذلك، إذا غطاء الكيميائية يوجد في الجوار المباشر لالمجهر مضان، ونقل قلوب جمعها في Trizol (تنبيه) تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. هذا تلتف احتمال خسارة قلوب العالقة في الطرف ماصة وأيضا أثناء الطرد المركزي من قلوب (الخطوات 3.4 و 3.5 و 3.7). تجمع قلوب من عدة جولات من العزلة في نفس أنبوب مع Trizol وانتقل مباشرة إلى الخطوة 3.8. يجب أن لا تتجاوز الحجم النهائي 10٪ من حجم Trizol الأصلي.
ملاحظة: اقرأ Trizol المواد ورقة بيانات السلامة (MSDS) قبل الاستخدام. التعامل مع Trizol كاشف تحت غطاء محرك السيارة وارتداء أوصى معدات الحماية الشخصية. تجنب ملامسة الجلد والعينين وclothiنانوغرام. إزالة جميع مصادر الإشعال. - تجمع قلوب من عدة جولات من العزلة في نفس أنبوب مع RNAlater (على الجليد)، وكفاءة عزل الحمض النووي الريبي يحسن مع كمية من الأنسجة التي تم جمعها. إذا تجاوز إجمالي حجم العينة 10٪ من حجم RNAlater الأصلي، استخدام أنبوب إضافي مع 0.75 مل RNAlater للتخزين (على الجليد).
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 15،700 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى الرواسب القلوب.
- تحت stereomicroscope مضان، وجمع بعناية بقدر طاف وقت ممكن إلى 1٪ المغلفة الاغاروز طبق بتري تحتوي على 3 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة، ولكن لا تزعج قلوب الرسوبية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. منذ ما يصل الى 15٪ من قلوب يمكن أن تبقى في طاف بسبب اللزوجة العالية من RNAlater، استرجاعها كما هو موضح في الخطوة 3.7.
- تحت غطاء الكيميائية، إضافة 0.5 مل Trizol إلى الأنبوب الذي يحتوي على قلوب الرسوبية والحفاظ على الجليد.
- تحت microsco الفلورسنتالمؤسسة العامة، ونقل قلوب (من الخطوة 3.5) من الطبق المغلفة الاغاروز 1٪ تحتوي على حل FBS RNAlater / L-15/10٪ في طبق آخر 1٪ المغلفة الاغاروز مع 3 مل L-15/10٪ FBS لتمييع خارج RNAlater. جمع قلوب في وسط طبق بتري ونقلها في حجم صغير في أنبوب للقلوب الرسوبية في Trizol تحت غطاء الكيميائية.
- دوامة أنبوب 1.5 مل تحتوي على القلوب في Trizol لتعطيل قلوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تحت غطاء الكيميائية، إضافة 100 ميكرولتر الكلوروفورم (تنبيه)، تخلط جيدا ونقل الحل / الكلوروفورم Trizol إلى 1.5 مل نسج قبل PLG أنبوب (أجهزة الطرد المركزي 30 ثانية في أقصى سرعة قبل الاستخدام). احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: اقرأ MSDS الكلوروفورم قبل الاستخدام. التعامل مع الكلوروفورم كاشف تحت غطاء محرك السيارة وارتداء أوصى معدات الحماية الشخصية. تجنب ملامسة الجلد والعينين والملابس. الابتعاد عن المتضادين مثل المعادن والقلويات. - Centrifuجنرال الكتريك العينة في 15،700 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
- إضافة 5-10 ميكروغرام الجليكوجين و 250 ميكرولتر precooled (-20 ° C) الأيزوبروبانول. تخلط جيدا واحتضان أكثر من ليلة في -20 ° C.
- الطرد المركزي العينة في 15،700 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
- غسل بيليه مع 1 مل 75٪ من الإيثانول، الطرد المركزي في 15،700 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
- السماح للتتبخر الإيثانول عن طريق تجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح أبيض (على سبيل المثال لمدة 10-15 دقيقة).
- إضافة 20 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية DDH 2 O لبيليه واحتضان لمدة 10-15 دقيقة في 55 ° C بحل RNA. ثم الحفاظ على الجليد.
- تقييم تركيز الحمض النووي الريبي والنقاء التي كتبها قياس الامتصاصية. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق تشغيل العينة على هلام الاغاروز 1٪.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا، نحن تصف تمثيلية تجربة تشريح القلب باستخدام الزرد تيراغرام (myl7: GFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9، الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) حصرا داخل عضلة القلب (الشكل 1). جمعنا كل من قلوب تشريح والأجنة من التي كانت تستمد لتقييم نقاء العينة القلب. لفترة وجيزة، متماثل تيراغرام (myl7: GFP) twu34 الزرد 9 تم outcrossed مع من النوع البري حتى يتسنى لجميع قلوب الجنينية تم GFP المسمى. تم نقل نحو 500 الأجنة (56 HPF) إلى 1.5...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول يسمح للتخصيب السريع للأنسجة القلب الزرد الجنينية للتعبير الجين يحلل. كمية ونوعية عينة الحمض النووي الريبي القلب محددة يعتمد إلى حد كبير على بضع خطوات حاسمة: أولا، كمية من العينة تحسنت كثيرا إذا تم منع فقدان القلوب في كل خطوة من البروتوكول، منذ تنقية RNA سوف تعمل فقط مع كافية بدءا المادية. الثانية، ونقاء من العينة، التي تعتمد اعتمادا كليا على المجرب، يتم تحديد عن طريق الفرز وجمع قلوب داخل طبق بتري مع استبعاد بدقة الأنسجة الأخرى. ثالثا، جودة العينة يعتمد بشكل كبير على...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر C. Burns و C. McRae على تحديد المبدأ الأساسي لبروتوكول التنقية هذا ، و F. Priller على التنفيذ الأولي لهذه الطريقة في مختبرنا. س. س. مدعومة من قبل أستاذية هايزنبرغ في Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). تم دعم هذا العمل من خلال منحة DFG SE2016 / 7-1.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| معدات تربية الأسماك وجمع البيض | انظر كتاب الزرد 11< / sup> للحصول على تفاصيل | ||
| المجهر | |||
| المبرد جهاز الطرد | |||
| المركزي الدقيق للأشعة فوق البنفسجية | < م > على سبيل المثال < / em> غرفة | ||
| الرحلان | |||
| الكهربائي للحمض النووي Thermo Scientific Nanodrop 2000أطباق بتري 4 سم Ø ؛ مغلفة ب 1٪ agarose في | |||
| وأطراف (P20 ، P100 ، P1000) | |||
| 1.5 مل أنابيب | |||
| 15 مل و 50 مل | |||
| من ملقط | |||
| Dumont # 5ExactaCruz & trade; نصائح تحميل هلام مستديرة في رف معقم ، 1-200 & mu ؛ l | سانتا كروز | sc-201732 | |
| 100 & mu; مرشح m (مصفاة خلية BD Falcon 100 مم) BD | Biosciences | 352360 | |
| 30 & mu ؛ مرشح m (مرشحات ما قبل الفصل -30 & micro; م) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| جل قفل المرحلة ، ثقيل ، أنابيب 1.5 مل ؛ | برايم | 2302810 | |
| ماء بيض متوسط | 60 مو ؛ جم / مل أملاح البحر المحيطية الفورية في ddH2O ، 0.00001٪ (وزن / حجم) الميثيلين الأزرق | ||
| E3 المتوسط ؛ | 5 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي كلوريد كلوريد ، 0.33 ملي كلوريد الكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي > ، 0.33 ملي مولار MgSO4< / sub> | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 مجم / مل محلول مخزون التريكايين ، درجة الحموضة 7 |
| 1٪ agarose (في وسط E3) 1 | |||
| ٪ هلام الاغاروز (في عازلة TBE) Leibovitz | |||
| & acute ؛ s L-15 متوسطة | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (مصل الأبقار الجنينية) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen ؛ | Invitrogen | 10814-010 | 20 & micro; ز /& مايكرو ؛ ل في الماء الخالي من |
| الكلوروفورم | |||
| الأيزوبروبانول | |||
| 75٪ إيثانول (في DEPC-ddH2O) ماء | |||
| خال من النوكلياز أو معقم معالج ب DDH2O | |||
| عازلة | |||
| TBE (Tris / Borate / EDTA) عازلة للرحلان | الكهربائي |
المراجع
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
