لتحليل القلب ملامح التعبير الجيني أثناء نمو القلب الزرد، لابد من استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من قلوب معزولة. هنا، نقدم بروتوكول لجمع وظيفية / قلوب الضرب السريع تشريح اليدوي من أجنة الزرد الحصول مرنا القلب محددة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتكون القلب الجنينية الزرد فقط بضعة مئات من الخلايا، التي تمثل سوى جزء صغير من الجنين بأكمله. لذلك، لمنع Transcriptome على القلب من أن تقنع من خلال Transcriptome على الجنينية العالمي، فمن الضروري لجمع أعداد كافية من قلوب لمزيد من التحليلات. وعلاوة على ذلك، مع استمرار التطور القلب الزرد بسرعة، وجمع القلب وطرق استخراج الحمض النووي الريبي تحتاج إلى أن تكون سريعة لضمان تجانس العينات. هنا، نقدم اليدوي السريع بروتوكول تشريح لجمع وظيفية / قلوب الضرب من الأجنة الزرد. هذا هو شرط أساسي لاحق القلب محددة استخراج الحمض النووي الريبي لتحديد مستويات القلب محددة التعبير الجيني عن طريق تحليل Transcriptome على مثل الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-QPCR). وتستند هذه الطريقة على الخصائص التفاضلية لاصقة من القلب الجنينية الزرد مقارنة مع الأنسجة الأخرى. وهذا يسمح للفيز السريعالفصل sical من القلب من أنسجة extracardiac من قبل مجموعة من فلويديك تعطيل قوة القص، والترشيح تدريجي وجمع اليدوي المعدلة وراثيا قلوب fluorescently المسمى.
المقدمة
ويستخدم الزرد (دانيو rerio) على نطاق واسع في علم الأحياء التنموي لدراسة توالد الأعضاء في الجسم الحي بسبب تطورها الجنيني سريعة وشفافة وخارج الرحم، جنبا إلى جنب مع صغر حجمها وتوافر خطوط مراسل المعدلة وراثيا مع التعبير الأنسجة محددة من البروتينات الفلورية. بشكل خاص يناسب هذا الفقاريات الصغيرة بشكل جيد لدراسة تطوير القلب بسبب الأوكسجين للجنين الزرد في وقت مبكر لا تعتمد على ضربات القلب وتدفق الدم. وقد سمحت هذه الميزات توصيف أعداد كبيرة من المسوخ القلب والأوعية الدموية 1،2 والزرد هو الآن كائن نموذج المعترف بها على نطاق واسع لدراسة أمراض القلب 3.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من القانون الألماني والدولة برلين. تم رصد معالجة الزرد من قبل السلطة المحلية لحماية الحيوان (LaGeSo، برلين-براندنبورغ).
1. الحصول على اسماك الزرد الأجنة لاستخراج القلب
- عبر مراسل القلب الزرد مثل تيراغرام (myl7: EGFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9 من أجل الحصول على أجنة مع القلب محدد GFP التعبير.
- الحفاظ على الأجنة في الماء البيض في 28.5 درجة مئوي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا، نحن تصف تمثيلية تجربة تشريح القلب باستخدام الزرد تيراغرام (myl7: GFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9، الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) حصرا داخل عضلة القلب (الشكل 1). جمعنا كل من قلوب تشريح والأجنة من التي كانت تستمد لتقييم نقاء العينة القلب. لفترة وجيزة، متماثل تيراغرام (myl7: GFP) twu34 الزرد 9 تم outcrossed مع من النوع البري حتى يتسنى لجميع قلوب الجنينية تم GFP المسمى. تم نقل نحو 500 الأجنة (56 HPF) إلى 1.5.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول يسمح للتخصيب السريع للأنسجة القلب الزرد الجنينية للتعبير الجين يحلل. كمية ونوعية عينة الحمض النووي الريبي القلب محددة يعتمد إلى حد كبير على بضع خطوات حاسمة: أولا، كمية من العينة تحسنت كثيرا إذا تم منع فقدان القلوب في كل خطوة من البروتوكول، منذ تنقية RNA سوف تعمل فقط مع كافية بدءا المادية. الثانية، ونقاء من العينة، التي تعتمد اعتمادا كليا على المجرب، يتم تحديد عن طريق الفرز وجمع قلوب داخل طبق بتري مع استبعاد بدقة الأنسجة الأخرى. ثالثا، جودة العينة يعتمد بشكل كبير على.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر C. Burns و C. McRae على تحديد المبدأ الأساسي لبروتوكول التنقية هذا ، و F. Priller على التنفيذ الأولي لهذه الطريقة في مختبرنا. س. س. مدعومة من قبل أستاذية هايزنبرغ في Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). تم دعم هذا العمل من خلال منحة DFG SE2016 / 7-1.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| معدات تربية الأسماك وجمع البيض | انظر كتاب الزرد 11< / sup> للحصول على تفاصيل | ||
| المجهر | |||
| المبرد جهاز الطرد | |||
| المركزي الدقيق للأشعة فوق البنفسجية | < م > على سبيل المثال < / em> غرفة | ||
| الرحلان | |||
| الكهربائي للحمض النووي Thermo Scientific Nanodrop 2000أطباق بتري 4 سم Ø ؛ مغلفة ب 1٪ agarose في | |||
| وأطراف (P20 ، P100 ، P1000) | |||
| 1.5 مل أنابيب | |||
| 15 مل و 50 مل | |||
| من ملقط | |||
| Dumont # 5ExactaCruz & trade; نصائح تحميل هلام مستديرة في رف معقم ، 1-200 & mu ؛ l | سانتا كروز | sc-201732 | |
| 100 & mu; مرشح m (مصفاة خلية BD Falcon 100 مم) BD | Biosciences | 352360 | |
| 30 & mu ؛ مرشح m (مرشحات ما قبل الفصل -30 & micro; م) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| جل قفل المرحلة ، ثقيل ، أنابيب 1.5 مل ؛ | برايم | 2302810 | |
| ماء بيض متوسط | 60 مو ؛ جم / مل أملاح البحر المحيطية الفورية في ddH2O ، 0.00001٪ (وزن / حجم) الميثيلين الأزرق | ||
| E3 المتوسط ؛ | 5 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي كلوريد كلوريد ، 0.33 ملي كلوريد الكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي > ، 0.33 ملي مولار MgSO4< / sub> | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 مجم / مل محلول مخزون التريكايين ، درجة الحموضة 7 |
| 1٪ agarose (في وسط E3) 1 | |||
| ٪ هلام الاغاروز (في عازلة TBE) Leibovitz | |||
| & acute ؛ s L-15 متوسطة | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (مصل الأبقار الجنينية) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen ؛ | Invitrogen | 10814-010 | 20 & micro; ز /& مايكرو ؛ ل في الماء الخالي من |
| الكلوروفورم | |||
| الأيزوبروبانول | |||
| 75٪ إيثانول (في DEPC-ddH2O) ماء | |||
| خال من النوكلياز أو معقم معالج ب DDH2O | |||
| عازلة | |||
| TBE (Tris / Borate / EDTA) عازلة للرحلان | الكهربائي |
المراجع
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
