يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل في فيفو التصوير الضوئي

15.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52136

⸱

يناير 5, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> يمكن أن يكون استخدام الفلوروفورات للتصوير في الجسم الحي محدودا بشكل كبير عن طريق الاضطلاع ، والإزالة السريعة ، وحساسية الكشف المنخفضة ، والتأثيرات السامة للخلايا على المضيف. يؤدي تغليف الفلوروفورات في الجسيمات الشحمية عن طريق ترطيب الفيلم والبثق إلى تبريد التألق والحماية مما يتيح التصوير في الجسم الحي بحساسية عالية للكشف.

الملخص

يقدم التصوير البصري

مجموعة واسعة من طرق التشخيص وقد اجتذب الكثير من الاهتمام كأداة للتصوير الطبي الحيوي. على الرغم من العدد الهائل من تقنيات التصوير المتاحة حاليا والتقدم في الأجهزة ، لا تزال هناك حاجة إلى مجسات عالية الحساسية مناسبة للتصوير في الجسم الحي. تتمثل إحدى المشكلات النموذجية لمجسات الفلورسنت قبل السريرية المتاحة في إزالتها السريعة في الجسم الحي ، مما يقلل من حساسية التصوير. للتحايل على الإزالة السريعة ، وزيادة عدد جزيئات الصبغة في الموقع المستهدف ، وبالتالي تقليل التألق الذاتي في الخلفية ، تم تغليف صبغة الفلورسنت القريبة من الأشعة تحت الحمراء ، DY-676-COOH في الجسيمات الشحمية والتحقق من قدرتها على التصوير في الجسم الحي للالتهاب. يعرف DY-676 بقدرته على التبريد الذاتي بتركيزات عالية. حددنا أولا التركيز المناسب للتبريد الذاتي ، ثم قمنا بتغليف تركيز التبريد هذا في الجزء الداخلي المائي من الجسيمات الشحمية PEGylated. لإثبات إمكانية التبريد والتنشيط للجسيمات الشحمية ، نستخدم طريقة تجميد قاسية تؤدي إلى تلف الأغشية الشحمية دون التأثير على الصبغة المغلفة. تم تسمية الجسيمات الشحمية التي تتميز بمستوى عال من التبريد الفلوري باسم Lip-Q. نظهر من خلال التجارب التي أجريت على خطوط الخلايا المختلفة أن امتصاص Lip-Q يكون في الغالب عن طريق البلعمة التي بدورها مكنت من توصيف إمكاناتها كأداة للتصوير في الجسم الحي للالتهاب في نماذج الفئران. علاوة على ذلك ، نستخدم نموذج الوذمة الناجم عن الزيموسان في الفئران لإثبات إمكانات Lip-Q في التصوير البصري للالتهاب في الجسم الحي. بالنظر إلى الامتصاص المحتمل بسبب تأثير النفاذية والاحتفاظ المعزز الناجم عن الالتهاب (EPR) ، تمت مقارنة تركيبة الجسيمات الشحمية التي تعمل دائما بتركيز منخفض وغير مروي من DY-676-COOH (يسمى Lip-dQ) و DY-676-COOH المجاني مع Lip-Q في التجارب على.

المقدمة

وقد تم التحقيق بشكل مكثف الجسيمات الشحمية وبمثابة واحدة من نظم لتقديم الأدوية الطبية الحيوية الأكثر حيويا لتطبيقات سريرية 1،2. وهي تتألف أساسا من الدهون الفوسفاتية والكوليسترول، وكلاهما مركبات حيويا محاكاة أجزاء من أغشية الخلايا الطبيعية. في حين أن المواد المائية يمكن شرك في المناطق الداخلية مائي، يمكن إدراجها كلاء محبة للدهون داخل طبقة ثنائية فسفوليبيد liposomal 3. تغليف المواد داخل الداخلية مائي من الجسيمات الشحمية يمنح الحماية ضد تدهور في الجسم الحي، وكذلك يمنع النظام المضيف من التأثيرات السامة للأدوية السامة للخلايا المستخدمة في العلاج من الأمراض، لمبحث المعالجة الكيميائية المثال تهدف إلى تدمير الخلايا السرطانية. تعديل سطح liposomal مع البوليمرات مثل polyethylenglycol (من مضاد) يمتد مزيد من الوقت تداول liposomal الدم في الجسم الحي بسبب الاستقرار sterical 4. Moreovإيه، يمكن أن الجسيمات الشحمية بتنحية تركيزات عالية من العديد من المواد مثل البروتينات 5،6، 7،8 المواد المائية والإنزيمات 9. ولأنها تخدم الأدوات العلاجية والتشخيصية السريرية موثوق بها والتي تستحق موافقتهم على تسليم الأدوية السامة للخلايا مثل دوكسوروبيسين لعلاج السرطان 4. نظرا لمرونتها، الجسيمات الشحمية يمكن أيضا أن تكون محملة fluorochromes لأغراض الجراحية التشخيصية وموجهة الصورة.

يوفر التصوير مضان فعالة من حيث التكلفة وغير الغازية في أداة تشخيصية الجسم الحي والتي مع ذلك، يطالب بعض المتطلبات الأساسية. يمكن أن ثبت أن fluorochromes التي تتناسب بشكل افضل للتصوير في الجسم الحي يكون امتصاص مميزة والحدود القصوى للانبعاثات في النطاق حيث تشتت الضوء ونثر وكذلك تألق ذاتي الأنسجة القادمة من المياه والهيموغلوبين منخفضة. وهكذا، هذه المجسات لها من ماكسيما ABS / م بين 650 و 900 نانومتر (10). وبالاضافة الى هذا، واستقرار fluorochromes سواء في التجارب المختبرية والحية أمر بالغ الأهمية، كما طهاية والتخليص السريع يمكن أن تحد كثيرا تطبيقها لفي الجسم الحي التصوير 11. آثار أخرى مثل ضعف الاستقرار وانخفاض الحساسية أو آثار السامة للخلايا على الأعضاء المستهدفة كما رأينا مع الأخضر الإندوسيانين (ICG) 12-16، وغير المرغوب فيها ويجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تصميم تحقيقات للتصوير في الجسم الحي. وقد أدت هذه الملاحظات إلى التنمية النشطة العديد من fluorochromes NIR قبل السريرية، الجسيمات النانوية وكذلك تقنيات جديدة للتصوير في الجسم الحي من عمليات التهابات والسرطان وللصورة موجهة جراحة 17-20. وعلى الرغم من استقرار معظم (مضان بالقرب من الأشعة تحت الحمراء) NIRF قبل السريرية الأصباغ في المختبر، نضح السريع والتخليص من خلال الكبد والكلى تعوق استخدامها في التصوير في الجسم الحي البصري للأمراض والعمليات الالتهابية.

ntent "> ونحن بالتالي تقديم بروتوكول للتغليف من fluorochromes مثل تتميز كذلك بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت DY-676-COOH، والمعروف عن ميلها إلى إخماد الذاتي بتركيزات عالية نسبيا 21 في الجسيمات الشحمية. بتركيزات عالية H- تشكيل ديمر و / أو التفاعلات بين الجزيئات fluorophore تقع ضمن فورستر نتيجة دائرة نصف قطرها بعضهم البعض في فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) بين جزيئات تألقي. وفي تركيز منخفض الفضاء بين زيادات جزيئات fluorophore، وبالتالي منع التفاعل التراص PI-التراص بي و -H ديمر تشكيل ومما أدى إلى انبعاث مضان عالية، والتبديل بين تركيز عال ومنخفض والتبريد مضان المرافق وتفعيل هي استراتيجية واعدة التي يمكن استغلالها للتصوير الضوئي (22). وفي هذا الصدد، التغليف من تركيزات عالية من الصبغة NIRF DY-676-COOH في المناطق الداخلية مائي من الجسيمات الشحمية هو أكثر كرة القدمvorable لفي الجسم الحي التصوير من الصبغة مجانا. التحدي المتمثل في طريقة يكمن أولا وقبل كل شيء في التغليف الصحيح وثانيا، في المصادقة على الفوائد الناتجة عن التغليف تركيزات عالية من الصبغة. وبمقارنة خصائص التصوير من الجسيمات الشحمية مروي مع أن من صبغ مجاني وأيضا مع صياغة غير مروي الحويصلية مع تركيزات منخفضة من الصبغة أمر لا غنى عنه. وتبين لنا من خلال ترطيب فيلم وقذف بروتوكول بسيط، ولكن فعالة للغاية جنبا إلى جنب مع بديلة تجميد والذوبان الدورات التي التغليف تركيزات التبريد من DY-676-COOH في الجسيمات الشحمية هو ممكن عمليا. أساليب أخرى تستخدم لإعداد الجسيمات الشحمية مثل الطور المعكوس طريقة التبخر 23 فضلا عن طريقة حقن الإيثانول 24 تمكن إعداد الحويصلية مع الكفاءة العالية التغليف لكثير من المواد المائية. ومع ذلك، فإن طبيعة المادة المراد مغلفة يمكن أن تؤثر على كفاءة التغليف. في الواقع،وترطيب الفيلم وقذف بروتوكول المقدمة هنا كشفت أعلى كفاءة لتغليف من DY-676-COOH. لتوضيح فوائد liposomal التغليف من DY-676-COOH، وهذا نموذج وذمة الناجم عن زيموزان، الذي يسمح دراسة عمليات التهابات في غضون ساعات قليلة، كانت تستخدم. هنا، ثبت أن الجسيمات الشحمية مع تركيزات عالية من مغلفة DY-676-COOH هي أكثر مناسبة للجسم كله في التصوير الضوئي الجسم الحي من العمليات الالتهابية من الصبغة مجانا أو صياغة غير مروي liposomal مع تركيزات صبغ منخفضة. وهكذا فإن البروتوكول الأساسي يوفر طريقة بسيطة وسريعة لإنتاج الجسيمات الشحمية الفلورسنت مروي والتحقق من التنشيط والتصوير إمكاناتهم سواء في التجارب المختبرية والحية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يتم الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الحيوان الإقليمية وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية بشأن استخدام الأخلاقي للحيوانات.

1. إعداد المواد والأدوات

  1. إعداد تشكلت عفويا تشتت الحويصلة (SFV)
    1. حل وإعداد حلول المخزون من الدهون الفوسفاتية التالية: 214 ملغ / مل فسفاتيديل البيض (EPC)، 134 ملغ / مل الكولسترول، 122 ملغ / مل 1،2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [ميثوكسي (البولي ايثيلين جليكول) -2000] (ملح النشادر) (MPEG 2000 -DSPE) و 2 ملغ / مل 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazol-4 -yl) (ملح النشادر) (NBD-مخدر) في الكلوروفورم وتخزينها في قارورة زجاجية.
    2. تقديم حوالي 3 مل الكلوروفورم في قاع القارورة المستديرة ونقل حجم مناسب من حل الأسهم فوسفورية في الجزء السفلي قارورة مستديرة لإعداد الجسيمات الشحمية مكونة من EPC: تشول: MPEG 2000 -DSPE في نسبة المولي 6.5: 3: 0.5. لوضع العلامات مضان مزدوج من الجسيمات الشحمية إضافة 0.3٪ مول دبي الوطني-مخدر إلى حل الدهون.
    3. تتبخر الكلوروفورم من الحل فسفوليبيد العضوية تحت ضغط منخفض (300 م بار) عند 55 درجة مئوية باستخدام المبخر الدوار.
    4. بعد تشكيل لفيلم فوسفورية متجانسة، والحد من الضغط إلى 10 م بار لمدة 1-2 ساعة لإزالة إيداع الكلوروفورم المتبقية.
    5. في حين أن الكلوروفورم تتبخر، ويحل DY-676-COOH (6.181 ميكرومتر) في 10 ملي تريس العازلة الرقم الهيدروجيني 7.4 وملء وعاء ديوار مع النيتروجين السائل. التبديل على حمام بالموجات فوق الصوتية وضعت في 50 ° C.
    6. نقل حجم مناسب (0.5-1 مل) من DY-676-COOH (6.181 ميكرومتر) حل لأسفل القارورة المستديرة لترطيب الفيلم فوسفورية الجاف ودوامة بقوة حتى حويصلة تشكلت عفويا (SFV) أشكال التشتت. تأكد من أن كل من الدهون الفوسفاتية وفرقت لتجنب فقدان الدهون.
    7. هيئة تنظيم الاتصالات بعنايةnsfer أسفل القارورة المستديرة التي تحتوي على تشتت SFV في النيتروجين السائل وتجميد تشتت لمدة 3-5 دقيقة. ضع أسفل القارورة المستديرة في حمام بالموجات فوق الصوتية عند 50 درجة مئوية لذوبان الجليد تشتت ثم دوامة تشتت بقوة لمدة 1-2 دقيقة. كرر هذا الإجراء ست مرات، مما يجعل ما مجموعه سبعة تجميد والذوبان دورات.
  2. قذف SFV لتشكيل الحويصلات الحويصلية متجانسة
    1. نقل تشتت SFV إلى 1 مل حقنة (حقنة-أ) وقذف تشتت عبر غشاء البولي 100 نانومتر باستخدام الطارد-LiposoFast الأساسية إلى حقنة-ب.
    2. قذف تشتت من حقنة-ب، والعودة إلى حقنة واحد، ثم كرر دورة عشر مرات. بسبب قذف، والحل في التغييرات حقنة من مظهر ضبابي إلى تشتت واضح مع الوقت. بعد عشر دورات (عشرون الخطوات قذف واحدة) إزالة حقنة-ب من الجهاز وقذف تشتت للمرة الأخيرة من حقنة واحد مباشرة في عقيمة1.5 مل أنبوب رد فعل.
  3. تنقية liposomal مغلفة DY-676-COOH من الصبغة مجانا
    1. إعداد عمود هلام اللوني باستخدام الخرز G25 غارقة في 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 (العمود طول 28 سم، وقطره 0.8 سم).
    2. نقل 0.5 مل من مقذوف حويصلة التشتت على السرير جل والسماح للعينة هجرة في مصفوفة هلام.
    3. أزل الليبوزومات مع 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 (الشكل 1A) ويغسل العمود حتى المصارف صبغة خالية تماما من العمود. إذا لزم الأمر، جمع وإعادة تدوير الصبغة المجاني من تحلية والجفاف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    4. تركيز الجسيمات الشحمية مزال من قبل تنبيذ فائق (200،000 x ج، 2 ساعة على 8 ° C) ثم انطلاقها فى حجم كاف من معقمة 10 ملي تريس درجة الحموضة العازلة، 7.4.
  4. الكمي لتركيز مغلفة DY-676-COOH
    1. إعداد منحنى المعايرة عن طريق إذابة DY-676-COOH (0، 82، 124،247، 494، 988 نانومتر) في 10 ملي تريس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4 تحتوي على 0.1٪ تريتون X100.
    2. حل 2 ميكرولتر (100 نانومول الدهون النهائي من 50 مليمول / لتر الأسهم) من الجسيمات الشحمية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 100 ميكرولتر تريس العازلة التي تحتوي على 1٪ تريتون X100 لتدمير الحويصلات والافراج عن صبغ مغلفة. ثم تمييع العينات مع 10 ملي تريس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4 إلى تركيز تريتون-X100 النهائي من 0.1٪ (ت / ت) مما يجعل إجمالي حجم 1 مل. إعداد جميع العينات في مكررة.
    3. قياس امتصاص وانبعاث جميع العينات (مجانا DY-676-COOH وتريتون-X100 تعامل الجسيمات الشحمية) في الإثارة λ = 645 نانومتر، وانبعاث λ = 700 نانومتر. إنشاء واستخدام منحنى معايرة الصبغة حرية تحديد تركيز الصبغة مغلفة.
  5. توصيف الحويصلية
    1. تحديد الأحجام وزيتا إمكانات الجسيمات الشحمية التي تشتت الضوء الديناميكي. تمييع عينات liposomal مع فلتر المعقمة (0.2 ميكرون) 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 إلى ميلانoncentration 100-300 ميكرومتر (الدهن). نقل العينات المخفف إلى انخفاض حجم كوفيت القابل للتصرف وقياس العينة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. توصيف الجسيمات الشحمية بواسطة المجهر الإلكتروني لإثبات حجم والنزاهة وتجانس الحويصلات liposomal وفقا لبروتوكولات القياسية.

2. التحقق من الإسفار، التبريد وتفعيل الليبوزومات محضرة

  1. تحليل فيزيائية للتبريد مضان وتفعيل
    1. إعداد اثنين من 1.5 مل أنابيب لالشفاه-Q و 2 أنابيب للالمجاني DY-676-COOH. نقل 100 نانومول الدهون الكلية (2.38 ميكرولتر من محلول المخزون / L الشفاه-Q 42 مليمول، التي تحتوي على 138 ميكروغرام / مل من مغلفة DY-676-COOH) في أنابيب المقابلة. انتقال حر DY-676-COOH ما يعادل محتوى صبغ الشفاه-Q (0.38 ميكروغرام مما يؤدي على سبيل المثال من 138 ميكروغرام / ميكرولتر 1،000 X 2.38 ميكرولتر الشفاه-Q المستخدمة). احتضان حوض واحد(ه) من كل مسبار في 4 درجات مئوية، وتجميد الأنبوب الثاني في -80 درجة مئوية خلال الليل (16 ساعة).
    2. تسخين كتلة التدفئة إلى 30 درجة مئوية. ملء مربع التبريد مع الثلج المجروش وتتوازن قسامة من 10 ملي تريس العازلة درجة الحموضة 7.4 إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. إزالة تحقيقات من 4 ° C وتتوازن في درجة حرارة الغرفة (ملفوفة في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء) وبسرعة ذوبان الجليد تحقيقات من -80 ° C إلى 30 ° C لمدة 5 دقائق. هدئ تحقيقات إذابة على الجليد لمدة 1 دقيقة قبل نقلهم إلى درجة حرارة الغرفة (ملفوفة أيضا في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء).
    4. إضافة 10 ملي تريس العازلة (درجة الحموضة 7.4) إلى كل من تحقيقات إلى 100 الحجم النهائي ميكرولتر وتتوازن جميع تحقيقات في RT لمدة 10 دقيقة.
    5. ماصة 80 ميكرولتر من كل مسبار في كوب انخفاض حجم كفيت وقياس امتصاص كل مسبار 400-900 نانومتر على مطياف. إعادة التحقيق لأنابيب يناظرها.
    6. نقل 80 ميكرولتر من كل مسبار إلى كوفيت الزجاج مناسبةوقياس الانبعاثات مضان على الطيفي بواسطة مثيرة تحقيقات في 674 نانومتر وقياس مضان 694-800 نانومتر.
  2. امتصاص الخلايا وتنشيط مضان
    1. الحصول على وثقافة خطوط الخلايا التالية في وسائل الإعلام ثقافة المقابلة وفقا لظروف قياسية (37 ° C، 5٪ CO 2 والجو مرطب 95٪). هنا، استخدم J774A.1 الفئران البلاعم خط الخلية (Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر تستكمل مع 10٪ (ت / ت) مصل العجل الجنين)، وورم أرومي دبقي خط الخلية البشرية، U-118MG (MEM تحتوي على الفيتامينات الأساسية و 10٪ (ت / ت) مصل الجنين العجل) ويفية خط الخلية البشرية، HT-1080 (RPMI مع 5٪ FCS).
    2. معطف 8 جيدا الشرائح غرفة مع بولي-L-ليسين (إضافة 100 ميكرولتر 0.001٪ بولي-L-ليسين إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. حل نضح والسماح للالشرائح غرفة لتجف لمدة 4 على الأقل ساعة على RT على طاولة العمل العقيمة. شطف الشرائح غرفة 3مرات مع محلول ملحي مخزنة 200 ميكرولتر هانك ثم ختم لهم البارافين ورقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 ° C حتى الحاجة.
    3. في حين أن الشرائح غرفة تجف، فلتر تعقيم الجسيمات الشحمية ومحلول الصبغة وتخزينها في 4 ° C حتى الحاجة.
    4. لتحليل التحقيق مع امتصاص الجسم كله في الجسم الحي NIR نظام التصوير مضان، وإعداد 5 قوارير الثقافة صغيرة لكل من خطوط الخلايا 3 اختبار (15 قوارير في المجموع). البذور 2 × 10 6 J774A.1، U-118MG والخلايا-HT 1080 في قارورة الثقافة مع 5 مل من مستنبت المعني (في quintuples) وتنمو ل16-24 ساعة. موازية لقوارير الثقافة والبذور 30،000 خلايا كل خلية خط (J774A.1 وHT-1080) أو 20،000 الخلايا (U-118MG) إلى 2 الآبار من الشريحة الغرفة على التوالي وتنمو في 500 ميكرولتر مستنبت لل16-24 ساعة .
    5. في اليوم التالي، إضافة 100 نانومول (مبلغ الدهون النهائي) من الشفاه-Q إلى 2 قوارير في خط الخلية وكذلك واحد من كل خط الخلية على الشريحة الغرفة.نقل على الفور 1 قارورة في كل سطر الخلية إلى 4 درجات مئوية، والقارورة الثانية إلى الحاضنة.
      ملاحظة: حجم تحقيقات تضاف إلى قوارير والشرائح الغرفة هي نفسها، مما يجعل التركيز على الشرائح غرفة 10 أضعاف أعلى (5 مل هو 500 ميكرولتر مستنبت). وهذا أمر ضروري لأن الكشف المجهري هو أقل حساسية من نظام التصوير NIR مضان حيث يتم تصوير الكريات خلية من قوارير.
    6. إضافة المجاني DY-676-COOH في يعادل تركيز على المحتوى صبغ الشفاه-Q إلى الخلايا في 2 قوارير في خط الخلية وكذلك واحد من كل خط الخلية على الشريحة الغرفة، ثم نقل على الفور 1 قارورة في خط الخلية إلى 4 ° C (نضوب الطاقة) وقارورة أخرى جنبا إلى جنب مع الشريحة الغرفة إلى الحاضنة. احتضان كل الخلايا لمدة 24 ساعة في الظروف المماثلة. الخلايا في قارورة دون تحقيق تخدم السيطرة غير المعالجة كما.
  3. NIRF التصوير والتحليل شبه الكمي
    1. بعد 24 ساعة مدة الحضانة، وحصاد الخلايا في قوارير عن طريق غسل الخلايا 2 مرات مع هانكس مخزنة محلول ملحي (HBSS) ثم تتخلص من الخلايا في 500 ميكرولتر HBSS وبيليه بواسطة الطرد المركزي (5 دقائق في 200 x ج) في 500 ميكرولتر أنابيب.
    2. وضع أنابيب مع الكريات الخلية (وHBSS) في تصوير NIRF والصورة باستخدام المرشحات للالإثارة (615-665 نانومتر) والانبعاثات (قطع في> 700 نانومتر).
    3. خصم تألق ذاتي وتقييم شدة هدف مقابل تألق ذاتي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وهذا يعطي مستويات شبه الكمية للكثافة مضان كما متوسط ​​إشارة (التهم تحجيم / ثانية)، التي تمثل مستويات العد بعد التوسع لمدة التعرض، وزيادة الكاميرا، binning وعمق البت، بحيث قياسات قابلة للمقارنة بين بعضها البعض.
  4. التحليل المجهري متحد البؤر
    1. بعد 24 ساعة الحضانة، وحصاد الخلايا على شرائح الغرفة عن طريق غسل 2 مرات مع 500 ميكرولتر HBSS.
    2. إصلاح مLLS مع 200 ميكرولتر HBSS تحتوي على 3.7٪ (ت / ت) الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. في حين تثبيت يجري، يخفف من وصمة عار DNA، هويشت-33258 01:50 بمحلول المتزايدة.
    4. بعد التثبيت، وغسل الخلايا 2 مرات مع HBSS ثم فصل الدوائر من الشرائح الزجاجية. إضافة 50 ميكرولتر تصاعد محلول يحتوي على الحمض النووي وصمة عار على كل بقعة المقابلة لآبار الشرائح الغرفة. تغطية الخلايا مع coverslips الزجاج، وختم حواف مع طلاء الأظافر الشفاف والهواء الجاف لمدة 10 دقيقة في RT (الظلام).
    5. خلايا صورة على مضان المجهر مناسبة أو المجهر متحد البؤر. استخدام الإعدادات الإثارة وانبعاث التالية لرؤية مكونات المقابلة: نوى (هويشت-33258: الإثارة 405 نانومتر، والانبعاثات 420-480 نانومتر). NBD-مخدر (liposomal الدهون: الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر). DY-676-COOH (NIR صبغة الفلورسنت: الإثارة 633-645 نانومتر، والانبعاثات 650-700 نانومتر).
      ملاحظة: تأكد من أن مضان المجهرتم تجهيز توفرة مع المرشحات المناسبة التي تسمح الإثارة وانبعاث موجات أعلى من 630 نانومتر.

استنادا الحويصلية-3. في فيفو الإسفار التصوير من التهاب

  1. إعداد الحيوانات والمواد
    1. البيت القديم الأسبوع 8-12 الفئران NMRI الذكور تزن حوالي 36 غرام تحت ظروف قياسية مع بالمال وبالشهرة أيضا الطعام والماء الإعلانية.
    2. سبعة أيام قبل بداية التجارب، وإعطاء كل الفئران لنظام غذائي منخفض pheophorbide من أجل الحد من تألق ذاتي الأنسجة.
    3. قبل أربع وعشرين ساعة من بداية كل تجربة، يحلق الفئران في المنطقة المرغوبة (مثل منطقة الظهر كاملة إذا هو المطلوب التصوير وذمة هند الساق).
    4. وزن الحيوانات وحساب كمية التحقيق ليتم حقنه في الماوس (الشفاه-Q والشفاه-DQ في 10 مكرومول (تركيز الدهن) لكل كيلوغرام من وزن وخالية DY-676-COOH (أي ما يعادل صبغ محتوى الشفاه-Q تستخدم) .
    5. صورة الحيوانات فيعلى الجسم كله NIR الإسفار تصوير مع نفس الإعدادات المستخدمة في الكريات الخلية. يوفر هذا القياس تألق ذاتي من الحيوانات.
    6. حل 10 ملغ زيموزان-A في 1 مل من محلول ملحي متساوي التوتر وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. تحريض التهاب في الجسم الحي وNIRF التصوير
    1. إعداد 3 الحقن في الماوس التي تحتوي على الحلول التالية. ملء حقنة واحدة مع 50 ميكرولتر زيموزان-A حل (10 ملغ / مل)، والحقنة الثانية مع 50 ميكرولتر محلول ملحي متساوي التوتر. ملء الحقنة الثالثة مع تحقيقات، يتم فيه تحديد الشفاه-Q والشفاه-DQ (10 ميكرومول / كجم من وزن (الدهن)) للحيوانات الاختبار وخالية DY-676-COOH (تركيز كما هو الحال في الشفاه-Q) للحيوانات السيطرة. تأكد من أن يتم تخفيفه تحقيقات مع معقم HBSS إلى 150 الحجم النهائي ميكرولتر.
    2. تطبيق كريم العين على عيون الحيوانات لتجنب جفاف وتخدير الحيوانات مع 2٪ الأيزوفلورين حتى أنهم نائما بعمق ولا تتفاعل عند لمسها على الكفوف (وهذا يستغرق حوالي 2 دقيقة).
    3. ضع الماوس على حصيرة دافئة (لا يزال تحت التخدير) وحقن-A زيموزان تحت الجلد حل على الساق الخلفية اليمنى ومحلول ملحي على الساق الخلفية اليسرى. حقن مباشرة التحقيق عن طريق الوريد وصورة الحيوان بعد ذلك ثم وقت قياسي من حقن / قياس (كما ر = 0 ساعة). حفظ الصور الناتجة كما مكعبات الصورة وكرر الخطوات المذكورة أعلاه لجميع الحيوانات الأخرى وتحقيقات منها.
    4. صورة الحيوانات كل 2 ساعة لمدة 10 ساعة حقن آخر، ثم في 24 ساعة حقن آخر، والتأكد من أن مرحلة من غرفة القياس دافئة (على سبيل المثال، عن طريق وضع حصيرة الدافئة تحت)، وذلك لتجنب انخفاض حرارة الجسم. بعد كل قياس، ووضع الحيوانات في قفص مع الغذاء والمياه الإعلانية بالمال وبالشهرة أيضا ووضع القفص في غرفة الحيوان المعتدلة. الموت ببطء الحيوانات عن طريق التخدير الأول مع 2٪ الأيزوفلورين حتى الحيوانات لم تعد تستجيب للمس، ثم الموت ببطء مع ثاني أكسيد الكربون لمدة 5-10 دقيقة، مما يجعلتأكد من أن الحيوانات توقف التنفس تماما ويحدث تيبس الميت.
    5. تشريح الفئران وفقا لبروتوكولات القياسية والتي يمكن تقييمها على الانترنت (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) وصورة الأجهزة.
    6. تقييم نتائج القياس وفقا لتعليمات الشركة الصانعة التي كتبها خصم لأول مرة مضان العام للحيوانات (unmixing) ثم المناطق إسناد من الفائدة للتألق ذاتي (من اليسار الساق الخلفية مع المياه المالحة) ومضان المستهدفة من منطقة ملتهبة (الساق الخلفية اليمنى مع زيموزان-A).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تغليف من تركيزات عالية من الأصباغ الفلورية مثل NIRF صبغ DY676-COOH المستخدمة هنا في الداخل مائي من الجسيمات الشحمية يؤدي إلى مستوى عال من مضان التبريد. تبريد مضان، وهي ظاهرة شهدت مع العديد من fluorophores في تركيز عال، يمكن استغلالها في العديد من تطبيقات التصوير الجسم الحي حيث طالب حساسية عالية وموثوقية الكشف عن المنطقة المستهدفة. استخدام الجسيمات الشحمية أيضا يوفر الحماية للصباغة الذي لا غنى عنه للتطبيقات في الجسم الحي. توصيف دقيق للالجسيمات الشحمية ضرو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

منذ الجسيمات الشحمية ويمكن أيضا أن تكون بمثابة نظم توفير الأصباغ الفلورية، وتمكين التصوير من الأمراض المستهدفة. تغليف من تركيزات عالية من الأصباغ الفلورية مثل الصبغة NIRF، DY676-COOH المستخدمة هنا، يؤدي إلى ارتفاع مستوى التبريد مضان من صبغ شرك. تبريد مضان، وهي ظاهرة شهدت مع العديد من fluorophores في تركيز عال يمكن استغلالها في العديد من تطبيقات التصوير الحي، حيث طالب حساسية عالية وموثوقية الكشف عن المنطقة المستهدفة. استخدام الجسيمات الشحمية أيضا يوفر الحماية للصب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المنح الألمانية للبحوث HI-698 / 10-1 وRU-1652 / 1-1. نشكر دورين مايو للحصول على المساعدة الفنية ممتازة والشركة DYOMICS محدودة، جينا لدعمهم الرقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات شرائح تستخدم محلول التألق < td colspan = "4" >Animals < / قوي>
<قوي>مواد ومعدات لتحضير الجسيمات الشحمية< / قوي >
البيض فوسباتيديل كولينأفانتي القطبية الدهون840051Pتذوب في الكلوروفورم وتخزن في قوارير زجاجية (214 مجم / مل)
الكوليسترولسيجماC8667تذوب في الكلوروفورم وتخزن في قوارير زجاجية (134 مجم / مل)
1،2-distearoyl-sn< / em>-glycero-3-phosphoethanolamine-N< / em>-[ميثوكسي (بولي إيثيلين جلايكول) -2000] (ملح الأمونيوم)AvantiPolar Lipids880120Pتذوب في الكلوروفورم وتخزن في قوارير زجاجية (122 مجم / مل)
1،2-ديولويل-sn< / em>-glycero-3-phosphoethanolamine-N< / em>- (7-nitro-2-1 ، 3-benzoxadiazol-4-yl) (ملح الأمونيوم)Avanti Polar Lipids810145Pتذوب في الكلوروفورم وتخزن في قوارير زجاجية (2 مجم / مل)
Sartorius MC1 (د = 0.01 مجم)Sartorius AGResearch RC 210 Pالمستخدمة لوزن الدهون الفوسفورية
RotavaporB & uuml ؛ تشي Labortechnik AGR-114تستخدم لترطيب فيلم الفوسفوليبيد
حمام الماءBü تشي Labortechnik AGR-481تستخدم لترطيب فيلم الفوسفوليبيد
وحدة تحكم الفراغB & uuml ؛ يستخدم تشي Labortechnik AGB-720لترطيب فيلم الفوسفوليبيد
VacoboxB & uuml ؛ يستخدم chi Labortechnik AGB-177لترطيب مبرد الدورة الدموية لفيلم الفوسفوليبيد
LAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230المستخدم لترطيب فيلم الفوسفوليبيد
DY-676-COOHDyomics GmbH676-00يذوب في 10 ملي مولار تريس ويخزن المخزون عند -20 درجة ؛ C
Tris- (Hydroxymethyl)-aminomethanApplichemA1086عازلة 10 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.4
TrichlormethanCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2المستخدمة لتحضير الجسيمات الشحمية
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hالمستخدمة لتحضير الجسيمات الشحمية
Vortex Genie 2 (كوب منبثق ، رقم 146-3011-00) شركةScientific Industries Inc.SI-0256المستخدمة لإعداد الجسيمات الشحمية
Sephadex G25 متوسطة   ؛تستخدم GE Healthcare Europe GmbH17-0033-01لتنقية الجسيمات الشحمية
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002لتدمير الجسيمات الشحمية لقياس كمية الصبغة
LiposoFast-BasicAvestin Inc.تستخدم لبثق الجسيمات الشحمية غشاء
مرشح البولي كربونات ، 100 نانومتر (غشاء Whatman Nucleopore Trans Etch ، NUCLEPR PC 19 مم ، 0.1 U)VWRالمستخدم في بثق الجسيمات الشحمية عبر LiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG Labtechالمستخدم في تحديد كمية الصبغة
Zetasizer Nano ZSMalvernالمستخدم لتحديد حجم الجسيمات الشحمية وإمكانية الزيتا
أجهزة الطرد المركزي الفائقة تستخدم Beckmann Coulter GmbHXL 80لتركيز العينات
RotorBeckmann Coulter GmbHSW 55 TIالمستخدمة لتركيز العينات
المواد والمعدات لتقييم الجسيمات الشحمية والتصوير البصري < / قوي >
Zymosan-A من Saccharomyces cereviciaeSigmaZ4250-250MGالمستخدمة لتحريض الالتهاب
محلول ملحي متساوي التوتر (0.9٪)Fresenius GmbHPZN-2159621يستخدم لتخفيف مبخر Zymosan-A
IsofluraneOhmeda Isotec 4المستخدم لتخدير
IsofluraneActavis GmbH & nbsp ؛PZN-7253744تخدير
Thermo Mat Pro 20 WLucky Reptile61202-HTP-20يستخدم للحفاظ على دفء أثناء التخدير
Omnican-F (حقن 1 مل)  براونPZN-3115465يستخدم للتطبيق تحت الجلد والوريد للمجسات كريم
العين بانثينولجينافارمPZN-3524531يستخدم لمنع جفاف عيون أثناء التخدير
محلول ملحي مخزن هانكسمختبرات PAA / Biochrom AGL2045مع Mg2 + و Ca2 + و فينول أحمر. لتخفيف المجسات وغسل الخلايا
غرفة 8 آبار ،354108BD Biosciencesلزراعة الخلايا متبوعة بالفحص المجهري ؛
قوارير زراعة الخلاياGreiner BioOne
وسائط زراعة الخلاياGibco (Life Technologies GmbH)
مصل عجل الجنين Invitrogen
Poly-L-Lysine (0.01٪ ، 50 & nbsp ؛ مل)SigmaP4832تستخدم لطلاء شرائح غرفة زراعة الخلايا
Mountant PermafluorThermoScientific   ؛S21022-3حل تركيب للفحص المجهري
Hoechst-33258AppliChemصبغة الحمض النووي للفحص المجهري
Hera-SafeHeraeus Instrumentsمنضدة عمل معقمة تستخدم لزراعة الخلايا
HERA خليةHeraeus Instrumentsحاضنة تستخدم لزراعة الخلايا
LSM510-MetaZeissالمستخدمة في الفحص
المجهري متحد البؤرMaestro-TM في الجسم الحي نظام التصوير الفلوريCRi ، يستخدم Woburnللتصوير الفلوري لكامل الجسم للحيوانات الصغيرة
مقياس الطيف الضوئي (Ultrospec 4300 pro UV) GEHealthcareالمستخدمة لقياس
مقياس الطيف الفلوري للامتصاص (Jasco FP-6200)جاسكوالمستخدمة لقياس انبعاث
الفئران NMRI (8-12 أسبوعا ، ذكر)Elevage Janvier ، فرنساتستخدم لتجارب الالتهابات

المراجع

  1. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  2. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
  3. Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
  4. Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
  5. Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
  6. Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
  7. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
  8. Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
  9. Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
  10. Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
  11. Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
  12. Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
  13. Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
  14. Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
  15. Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
  16. Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
  17. Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
  18. Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
  19. Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
  20. Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
  21. Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
  22. Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
  23. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
  24. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
  25. Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
  26. New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
  27. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
  28. Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
  29. Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
  30. Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
  31. Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
  32. Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
  33. Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
  34. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14(2005).
  35. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  36. Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
  37. Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
  38. Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
  39. Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
  40. Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
  41. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
  42. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
  43. Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التغليف الليبوزوميالفلورة بالأشعة تحت الحمراء القريبةالتصوير الحيالالتقام البلعميترطيب الغشاء الليبيديالتنقية بالبثقالقياسات الطيفيةالوذمة المستحثة بالزيموزانالليبوزومات المبيجيلة
مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل في فيفو التصوير الضوئي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.