يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ل السابقين فيفو نموذج لهجوم T-خلية الموجه دبقية قليلة التغصن في الدماغ الحادة شرائح

6.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52205

⸱

فبراير 5, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

في هذه المقالة

ملخص

لمعالجة آليات إزالة الميالين وموت الخلايا المبرمج العصبي في الآفات القشرية لاضطرابات إزالة الميالين الالتهابية ، يتم استخدام نماذج حيوانية مختلفة. نصف هنا نهجا خارج الجسم الحي باستخدام الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالخلايا قليلة التغصن على شرائح الدماغ ، مما يؤدي إلى موت قليل التغصن والعصب. تتم مناقشة التطبيقات المحتملة وقيود النموذج.

الملخص

موت الخلايا قليلة التغصن المصحوبة بتدمير الخلايا العصبية والمحاور هي نتائج نسيجية مرضية نموذجية في آفات المادة الرمادية القشرية وتحت القشرية في الاضطرابات الالتهابية المزيلة للميالين مثل التصلب المتعدد (MS). في هذه الاضطرابات ، تم العثور بشكل أساسي على الخلايا التائية CD8 + ذات الخصوصية المفترضة للمستضدات المرتبطة بالمايلين والخلايا الدبقية قليلة التغصن ، بحيث قد يكون موت الخلايا المبرمج العصبي في آفات المادة الرمادية تأثيرا جانبيا لهذه الخلايا. يتم إنشاء أنواع مختلفة من النماذج الحيوانية لدراسة الآليات الأساسية للعمليات الفيزيولوجية المرضية المذكورة. ومع ذلك ، على الرغم من أنها تحاكي بعض جوانب مرض التصلب العصبي المتعدد ، إلا أنه من المستحيل تشريح الآلية الدقيقة والمسار الزمني لموت الخلايا العصبية "الجانبية". لمعالجة هذه الدورة ، نعرض هنا بروتوكولا لدراسة الآليات والاستجابة الزمنية للتلف العصبي بعد هجوم الخلايا التائية CD8 + الموجه بقليل التغصن. لاستهداف غمد المايلين والخلايا قليلة التغصن فقط ، يتم نقل الخلايا التائية CD8 + الخاصة بقليلة التغصن المنشطة في المختبر إلى شرائح دماغ معزولة بشكل حاد. بعد فترة حضانة محددة ، يمكن تحليل تلف المايلين والخلايا العصبية في مناطق مختلفة ذات أهمية. ستتم مناقشة التطبيقات المحتملة والقيود المفروضة على هذا النموذج.

المقدمة

موت الخلايا قليلة التغصن وتدمير غمد المايلين المصحوب بفقدان الخلايا العصبية والمحاور هي نتائج مرضية نموذجية في آفات المادة الرمادية لدى الأفراد الذين يعانون من التصلب المتعدد (MS) 1،2. يمكن تقسيم الآفات القشرية حتى الآن إلى ثلاثة أنواع فرعية مختلفة2: الآفات تحت القشرة وداخل القشرة البيضاء والقشرية. بالمقارنة مع لويحات المادة البيضاء ، تتميز التسللات بغلبة الخلايا التائية CD8 + ، مما يشير إلى دورها الحاسم المحتمل في التهاب المادة الرمادية3. علاوة على ذلك ، يمكن العثور على توسعات قليلة النسيلة في الدم والسائل الدماغي النخاعي (CSF) وداخل الآفات الالتهابية للخلايا التائية CD8 + نفسها4-6.

تماشيا مع هذا ، من المفترض أن الخلايا التائية CD8 + قد تكون محددة لبروتينات المايلينالمختلفة 7،8. في الواقع ، تم العثور على الخلايا التائية CD8 + بالقرب من الخلايا قليلة التغصن وأغماد المايلين9،10 التي تظهر تعبير معقد التوافق النسيجي الكبيرالأول 11 وبالتالي قد تكون مسؤولة عن فقدان غمد المايلين. غالبا ما تظهر هذه العملية جنبا إلى جنب مع تلف الخلايا العصبية والمحورية "الجانبية" الواسع النطاق داخل المادة الرمادية للجهاز العصبي المركزي (CNS)1،2. في الواقع ، يتم إحداث الموت المباشر وغير المباشر لخلايا الدبقية قليلة التغصن والخلايا العصبية بواسطة الخلايا التائية CD8 + عبر آليتين مختلفتين: (أنا) تورم غشاء الخلية وتمزقه بسبب تكوين حبيبات سامة للخلايا بعد إطلاق البيرفورينات والجرانزيم و (ثانيا) الربط بمستقبلات Fas أو عرض FasL على سطحها8،12،13.

تم إنشاء أنواع مختلفة من النماذج الحيوانية لدراسة الآلية الأساسية للعمليات المذكورة. في هذا الصدد ، يمكن نقل الخلايا التائية CD8 + المعدة الخاصة بالمستضدات الذاتية ذات التعبير المستحث في الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي ، مثل الخلايا الدبقية قليلة التغصن أو الخلايا النجمية ، بالتبني لتحليل الموت العصبي والمحوري "الجانبي" في المادة الرمادية لاحقا14،15. يعد إجراء مثل هذه التجارب في الجسم الحي مساعدة كبيرة لتقليد بعض الجوانب الفيزيولوجية المرضية لمرض التصلب العصبي المتعدد ، ومع ذلك ، فإن هذا النهج غير مناسب لحل الآلية الأساسية والحركية للتلف المحوري وموت الخلايا المبرمج العصبي.

للتغلب على هذه القيود ، تم إنشاء نهج خارج الجسم الحي لدراسة الآليات والمسار الزمني لموت الخلايا العصبية بعد هجوم الخلايا التائية CD8 + الموجه بالخلايا قليلة الغرض. نظرا لأن الخلايا قليلة التغصن فقط وبالتالي إنتاج غمد المايلين يجب أن تستهدفها الخلايا المناعية ، يتم استخدام خلايا OT-I المحظورة من الفئة الأولى ، وتفاعل البيضا (OVA)16. يتم نقل هذه الخلايا لاحقا إلى شرائح دماغية تم الحصول عليها من الفئران التي تعبر بشكل انتقائي عن OVA في الخلايا قليلة التغصن (فئران ODC-OVA)17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

كل التجارب باستخدام الفئران يجب أن يتم تنفيذ وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية منها رعاية الحيوانات واستخدامها.

1. التعليقات العامة للتجارب ماوس

  1. الحفاظ على الفئران تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض وتمكينهم من الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
    ملاحظة: من المهم استخدام الفئران السن والمطابقة الجنس في المجموعات التجريبية لأنماط المناعية يمكن أن تختلف مع تقدم العمر والجنس.

2. CD8 + T-خلايا إعداد وتفعيل OVA محددة (OT-I)

  1. أداء تحفيز خلايا OT-I T كما هو موضح أدناه 5 أيام قبل إعداد شرائح الدماغ.
    ملاحظة: 5 × 10 5 المستجيب تنشيط CD8 + OT-I T-خلايا (CD8 + T-خلايا الفئران المعدلة وراثيا الاعتراف فقط الببتيد OVA 257-264 في سياق جزيئات MHC-I) وهناك حاجة لكل شريحة تركيز 5 × 10 5 تم اختيار التجربةحليف واحدة الأمثل لصالح جيدة التفاعل خلية خلية أخرى أن الخلايا تبدأ يهاجرون إلى شريحة، وفي الوقت نفسه، كمية من الخلايا ليست مرتفعة جدا للحث على رد فعل مبالغ فيه السماح خلية واحدة العد 8،18.
  2. إعداد المتوسطة لزراعة OT-I T-الخلايا. تكملة 500 مل DMEM مع 5٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 10 ملي HEPES، 2 مم L-الجلوتامين، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية و 25 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. تخزين المتوسطة في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. إزالة الطحال من OT-I الفئران المعدلة وراثيا وفقا لمرجعية 16. نقلها إلى متوسطة على استعداد.
  4. توليد تعليق خلية واحدة من يهرس الطحال من خلال 70 ميكرومتر مصفاة وأجهزة الطرد المركزي تعليق في 300 x ج لمدة 5 دقائق، 4 ° C.
  5. احتضان تعليق الخلية مع 5 مل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) عازلة (150 ملي NH 4 CL، 10 ملي KHCO 3، 0.1 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 7.3) لمدة 5 دقائق لليز خلايا الدم الحمراء.
  6. وقف incubatiعلى مع 10 مل المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح أعلاه.
  7. تمييع تعليق خلية في المتوسط ​​وحساب الأرقام. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3 × 10 7 خلايا / جيد في لوحة 12-جيدا ومنهم الوزراء من قبل الحضانة مع OVA 257-264 (SIINFEKL، 1 نانومتر) وانترلوكين 2 (IL-2) (500 وحدة دولية / مل) ل 5 أيام.
  8. بعد 4 أيام، إضافة IL-2 عند تركيز 500 وحدة دولية / مل مرة أخرى.
  9. وبعد أن التحفيز، وتنقية OT-I T-الخلايا من التعليق الخلية باستخدام مجموعة مختارة الماوس السلبي القائم CD8 + T عدة عزل خلايا التالية تعليمات الشركة الصانعة. ويستند تنقية على استنزاف جميع CD8 + غير الخلايا باستخدام مزيج من الأجسام المضادة ضد CD4، CD11b، CD11c و، CD19، CD45R (B220)، CD49b (DX5)، CD105، MHC من الدرجة الثانية، تير-119، وTCRγ / δ التي يتم بعد ذلك التخلص منها باستخدام أعمدة المغناطيسية لشطف من CD8 + T-خلايا النقاء.
    ملاحظة: الخطوات الهامة في هذا proceduيشار إلى إعادة كتبها المصنوعات: من المهم أن رد الفعل ينطوي على الخلايا واحد فقط لأن وجود كتل يمكن منع العمود خلال الخطوة شطف. عد من الخلية قبل إضافة كوكتيل Byotin المهم للحصول على درجة نقاوة العينة ويجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء على الجليد للحد من الارتباطات الأجسام المضادة غير محددة.

3. إعداد الحاد الدماغ شرائح والمشارك الثقافة مع OT-I T-خلايا

  1. قبل إعداد الدماغ الحاد شرائح 19، وإعداد placedine محلول ملحي الفسيولوجية الجليد الباردة باستخدام 200 ملي السكروز، 20 أنابيب ملي، و 2.5 ملي بوكل، 1.25 ملي ناه 2 PO 4، 10 ملي MgSO 4، 0.5 CaCl 2 و 10 ملي سكر العنب والسائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) باستخدام 125 مم كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 1.25 ناه 2 PO 4، 24 ملي NaHCO 3، 2 ملي MgSO 4، 2 مم CaCl 2، 10 ملم سكر العنب. ضبط درجة الحموضة من كل حل ل7.35 كتبها النقيبز هيدروكسيد الصوديوم. قبل ضبط درجة الحموضة من ACSF، لا بد من فقاعات الحل مع خليط من 95٪ O 2 و 5٪ CO 2.
  2. قبل تبريد الحلول.
  3. تخدير 8 - 10 أسابيع الفئران القديم (على سبيل المثال، C57BL / 6 عن السيطرة أو المعدلة وراثيا ODC-OVA الفئران 17 مع استنشاق باستخدام 5.0٪ الأيزوفلورين، 5.0٪ هالوثان أو حقن 100 ملغ / كغ الكيتامين و 10 ملغم / كغم من وزن الجسم عن طريق زيلازين الملكية الفكرية انتظر للتخدير واستخدام قرصة أخمص القدمين إلى تقييم مستوى التخدير واقطع رؤوسهم في آن واحد. الموت ببطء الفئران وفقا لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام معايير لجنة للقتل الرحيم.
  4. ضع الماوس في موقف بطني. تطهير فروة الرأس وقطع sagittally. فتح عظم الجمجمة sagitally، وإزالة الدماغ بسرعة مع مساعدة من مغرفة وإصلاحه على لوحة من vibratome باستخدام الغراء.
  5. ملء لوحة مع استعداد placedine محلول ملحي الفسيولوجية الجليد الباردة.
  6. قطع 300 ميكرون شرائح الاكليلية مع vibratome.
    ملاحظة: هذا الإجراء هو أعلمن لتسفر قابلة للحياة عينات الأنسجة سليمة مناسبة للدراسات الخلوية وظيفية في غضون فترة زمنية لا يقل عن 8 ساعة 19-21. وبالفعل، وبعد هذه الفترة الزمنية، بدءا بالفعل بعد 6 ساعات، وإعداد يظهر انخفاض الجودة، وهي التغيرات في الخصائص الأساسية والوظيفية مثل عمل الجيل المحتملين والانتشار.
  7. بعد باجتزاء، ونقل شريحة واحدة على الفور في كل بئر من لوحة 12-جيدا مليئة ACSF.
  8. إضافة بعناية 5 × 10 5 خلايا OT-I T لكل شريحة.
  9. احتضان شرائح لمدة تصل إلى 8 ساعات في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).
  10. بعد فترة الحضانة، وشرائح الحصاد وتضمين عليها باستخدام أكتوبر مجمع الأنسجة تيك وتجميدها في النيتروجين السائل. تخزينها في -20 ° C لمزيد من الدراسات النسيجية لمثل تقييم بنية الخلايا العصبية (على سبيل المثال، وذلك باستخدام مكافحة MAPII أو أضداد synaptophysin) أو موت الخلايا المبرمج (على سبيل المثال، وذلك باستخدام معاداة كاسباس 3 الأجسام المضادة والمعادية للNeuN المضادةالهيئات) وفقا للإجراءات القياسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد مرور فترة الحضانة من شرائح الدماغ مع CD8 + T-خلايا الموجه دبقية قليلة التغصن، قليلة التغصن وكذلك الخلايا العصبية تخضع لموت الخلايا المبرمج (أرقام 2A و 1C، على التوالي). علامات النسيجية من موت الخلايا المبرمج (على سبيل المثال، كاسباس 3، في Tunel) يمكن أقرب الكشف بعد 3 ساعات من الحضانة. لا ينبغي أن يكون فترة حضانة أطول من 8 ساعات لضمان نوعية جيدة من الإعداد والنتائج استنساخه. الخلايا أفكارك ويمكن الاطلاع على جميع أنحاء شريحة مع رجحان في المنا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد وصفت نماذج حيوانية مختلفة على مدى العقود الماضية لمعالجة الميزات المرضية من الاضطرابات المزيل للالتهابات مثل MS. في الجسم الحي وتستخدم على نطاق واسع الماوس والفئران نماذج لمحاكاة السمات الفيزيولوجية المرضية للمرض، أي تحليل النتائج المترتبة على عمليات إزالة الميالين وعودة الميالين والحلقات المختلطة من الالتهاب وتنكس عصبي. ومع ذلك، فقط نهج المجراة سابقا يسمح لتشريح الآليات الكامنة بالضبط.

إعدا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المركز متعدد التخصصات للأبحاث السريرية (IZKF) مونستر (SEED 03/12 ، SB) ، Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128 ، TP B6 إلى S.G.M. ME3283 / 2-1 إلى SGM) وبواسطة Medizinische Forschung و Münster (I-BI111316 و SB و SGM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12-بئر لوحةكورنينج3513
2-ميركابتو إيثانولجيبكو31350-010
2-ميثيل بوتانروث3927.1
70 & مايكرو ؛ م مصفاةفالكون352350
CaCl2< / sub>Merck1.02382.0500كلوريد الكالسيوم
CD8+< / sup>-عزلكيت Miltenyi Biotech130-090-859
D (+) -glucoseMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021دافئ في 37 درجة ؛ حمام مائي C قبل الاستخدام
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151مصل عجل الجنين
GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500كلوريد البوتاسيوم
KHCO3< / sub>SigmaP9144كربونات هيدروجين البوتاسيوم
L-GlutamineGibco35050-038
MgSO4< / sub>Merck1.05886.0500كبريتات المغنيسيوم
كلوريد الصوديومSigma31434كلوريد
الصوديومNaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500فوسفات هيدروجين الصوديوم
NaHCO3Merc1.06329.0500كربونات هيدروجين الصوديوم
هيدروكسيد الصوديومميرك1.09137.1000هيدروكسيد الصوديوم
NH4ClSigma213330كلوريد الأمونيوم
الأحماض الأمينية غير الأساسيةجيبكو11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbumin
PIPESSigmaP6757
السكروزميرك1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

المراجع

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD8
ل السابقين فيفو نموذج لهجوم T-خلية الموجه دبقية قليلة التغصن في الدماغ الحادة شرائح
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.