مقالة منهجية

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس في الموقع استخدام أسلوب TUNEL

DOI:

10.3791/52211

⸱

ديسمبر 16, 2014

 , 
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا الفيديو التشريح ومعالجة الأنسجة والتقسيم ووضع العلامات على TUNEL المستند إلى التألق لعضلة الهيكل العظمي للفأر. كما يصف طريقة للتحليل شبه الآلي لوضع العلامات على TUNEL.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT) ديوكسي أوريدين ثلاثي الفوسفات (dUTP) وسم نهاية النيك (TUNEL) هي طريقة استخدام إنزيم TdT لإرفاق شكل موسوم من dUTP تساهميا بنهايات 3 'من فواصل الحمض النووي المزدوجة والمفردة الشريطة في الخلايا. إنها طريقة موثوقة ومفيدة للكشف عن تلف الحمض النووي وموت الخلايا في الموقع. يصف هذا الفيديو تشريح ومعالجة الأنسجة والتقسيم ووضع العلامات على TUNEL القائم على التألق لعضلة الهيكل العظمي للفأر. كما يصف طريقة القياس الكمي لإشارة TUNEL شبه الآلية. تؤثر ميزات الأنسجة الطبيعية المتأصلة وظروف معالجة الأنسجة على قدرة إنزيم TdT على تسمية الحمض النووي بكفاءة. قد تضيف معالجة الأنسجة أيضا تألقا ذاتيا غير مرغوب فيه يتداخل مع اكتشاف إشارة TUNEL. لذلك ، من المهم تحديد طرق معالجة الأنسجة ووضع العلامات TUNEL تجريبيا والتي ستؤدي إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى للقياس الكمي اللاحق. يوفر الاختبار القائم على التألق الموصوف هنا طريقة لاستبعاد إشارة الفلورسنت الذاتي عن طريق طرح القناة الرقمية. يعد اختبار TUNEL ، المستخدم مع تقنيات معالجة الأنسجة والضوابط المناسبة ، طريقة كمية سريعة نسبيا وقابلة للتكرار للكشف عن موت الخلايا المبرمج في الأنسجة. يمكن استخدامه لتأكيد تلف الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج كآليات مرضية ، ولتحديد أنواع الخلايا المصابة ، وتقييم فعالية العلاجات العلاجية في الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز (TDT) dUTP وضع العلامات نهاية نيك (TUNEL) هو عملية استخدام انزيم TDT إرفاق dUTP إلى 3 'ينتهي من مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل DNA يكسر 12،23. وذكرت وطريقة TUNEL للكشف عن الخلايا والحمض النووي الضرر لأول مرة منذ أكثر من 20 عاما من قبل Gavrieli وآخرون. 1،12،24. ومنذ ذلك الحين تم تقييمها والأمثل في الأعمال التحضيرية الأنسجة المختلفة 7،23،27،40. وقد استخدم TUNEL لدراسة موت الخلايا الناجم عن نقص التروية من الخلايا العصبية 6،14،29 والعضلية 43،44، excitotoxic المواد موت الخلايا العصبية 30،31، وكما العلامات البيولوجية في علاج التهاب المفاصل 39. كما تم استخدامه كعامل النذير وعلامة الخلايا السرطانية في مختلف السرطانات البشرية 2،3،15،32،37،38،42.

وتوجد طرق بديلة لالحمض النووي من التلف والكشف عن موت الخلايا، ولكن لديهم التحديات التقنية والمحاذير. النشاف الجنوبي يمكن أن تستخدم لquantifذ الحمض النووي من التلف في الأنسجة لست] كاملة 7،9-11، ولكن هذه الطريقة لا توفر الدقة المستوى الخلوي ويصعب قياسها كميا. الفحص المذنب هو طريقة خلية القاعدة البديل الذي يتطلب استخراج نواة من خلايا الحفاظ 4،20،28،36. على الرغم من أن الفحص المذنب يعمل بشكل جيد على خلايا معزولة مثقف، هو أكثر صعوبة لإعداد نواة سليمة من أنسجة العضلات والهيكل العظمي 8،21. كما هو الحال مع اللطخة الجنوبية، ومقايسة المذنب لا يقدم معلومات الخلية من نوع محددة من كله جناسة الأنسجة العضلية. وثمة بديل آخر لطريقة TUNEL هو المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد احد الذين تقطعت بهم السبل DNA 25،33،41 أو ضد البروتينات التي تشارك في الحمض النووي ردا الضرر وموت الخلايا مسارات (مثل البروتين p53، H2AX، وcaspases) 13،17،22،40. مثل هذه الأساليب القائمة على الأجسام المضادة تتطلب توصيف دقيق للالأجسام المضادة والأجسام المضادة خصوصية ممتازة لانتاج نسبة عالية الإشارة إلى الخلفية. حتى عندما المواصفاتالأجسام المضادة IFIC موجودة، وأنها قد تتطلب تمسخ من البروتين الهدف من خلال إجراءات استرجاع مستضد 34،35. ونحن نناقش هنا، استرجاع مستضد في نتائج الأنسجة العضلية في تألق ذاتي عالية بشكل غير مقبول. وخلافا للطرق البديلة، TUNEL يحقق DNA الضرر الكشف مع إشارة عالية وخلفية منخفضة، والنوعية الممتازة التي يمكن اختبارها مع ضوابط بسيطة الإيجابية والسلبية، اختراق الأنسجة الجيدة التي لا تتطلب استرجاع مستضد، والدقة المستوى الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة TUNEL يستغرق حوالي 4 ساعات لإكمال، في حين أن الطرق البديلة تتطلب عادة حضانات بين عشية وضحاها.

نقوم بدراسة الهيكل العظمي موت الخلايا العضلية في نموذج الفأر من ضمور العضلات الشوكي (SMA) 10 التي تم إنشاؤها بواسطة هسيه لى وزملاؤه 16. لتحديد الخلايا أفكارك في العضلات، قمنا بتطوير طريقة التحضير الأنسجة، وتلطيخ، والكميات التي تعمل بقوة عبر skele مختلفةمجموعات العضلات التل على مختلف النقاط الزمنية التنموية في الفئران. ونحن نستخدم المتاحة تجاريا عدة TUNEL وضع العلامات ومتاحة تجاريا البرمجيات تحليل الصور. وعلينا أيضا أن تستخدم بنجاح الفحص TUNEL في تركيبة مع تلوين مناعي في الحبل الشوكي 10.

الأساليب المذكورة هنا هي مفيدة للمحققين الذين يريدون لتقييم أمراض الأنسجة، وآليات المرض، وآليات الشيخوخة، والتنموية (قبل وبعد الولادة) موت الخلايا في العضلات والهيكل العظمي. تقنية TUNEL مفيدة بشكل خاص للدراسات الحمض النووي من التلف وإصلاح وموت الخلايا في نظم نموذج حيث لا يوجد سوى مجموعة فرعية من الخلايا هي قرار مستوى المتضررين والخلوية ضروري.

هذا الفيديو يصف تشريح، معالجة الأنسجة، باجتزاء، ووضع العلامات TUNEL القائم على مضان من الماوس العضلات والهيكل العظمي. ويصف التقرير أيضا وسيلة لشبه الآلي إشارة الكميات TUNEL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وصفها في هذا البروتوكول وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة 26. وتمت الموافقة على البروتوكول (MO13M391) من قبل لجنة جامعة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز.

1. حديثي الولادة ماوس النحر، تشريح، والتثبيت

  1. التضحية ماوس الأطفال حديثي الولادة عن طريق CO 2 الاستنشاق.
  2. قطع على الفور من على hindlimb فوق الركبة. حتى اليوم ما بعد الولادة حوالي 7، وعظام الساق هي لينة بما يكفي لقطع طريق مع مقص مختبر كبيرة أو شفرة حادة وقسم في وقت لاحق على ناظم البرد.
  3. ضع hindlimb في 10 مل من الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب 15 مل.
  4. الغمر إصلاح hindlimb في امتصاص العرق ل4-24 ساعة في 4 درجات مئوية. الأنسجة الجنينية تتطلب عدة ساعات فقطالصورة للتثبيت.
    1. تجنب تثبيت أطول من 24 ساعة، وهذا قد يقلل TUNEL كفاءة الفحص.
  5. Cryoprotect في hindlimb عن طريق غمر في محلول السكروز.
    1. تغيير بارافورمالدهيد إلى 10٪ سكروز في برنامج تلفزيوني في نفس أنبوب 15 مل، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    2. التغيير إلى 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو حتى المصارف hindlimb إلى أسفل الأنبوب. الأنسجة قد يكون غادر في 30٪ سكروز لفترة أطول، شريطة أن يكون السكروز كانت عقيمة-تصفيتها.

2. الأنسجة التضمين

  1. ملء المسمى تضمين العفن في منتصف الطريق مع تضمين المتوسطة.
  2. وضع hindlimb على أعلى من المتوسط ​​التضمين، مع الجانب قطع أقرب وقت ممكن لجدار واحد من العفن. بمناسبة توجه hindlimb في الخارج من القالب.
    1. تضمين عدة hindlimbs وقطع في نفس الكتلة. ومع ذلك، فمن المهم التأكد من أن كل هينموجهة dlimbs في كتلة موازية لبعضها البعض للحصول على الأقسام في مطابقة المستويات على طول محور من أطرافهم.
  3. تغطية hindlimbs مع تضمين المتوسطة. إذا hindlimbs SHIFT أثناء صب المتوسطة، وإعادة توجيه، منهم بالملقط حادة ذات الرؤوس أو المسواك.
  4. يسمح تضمين المتوسطة التسلل إلى الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  5. مكان قوالب مباشرة على الثلج الجاف أو في isopentane على الثلج الجاف لتجميد تضمين المتوسطة. تأكد للحفاظ على مستوى قوالب في جميع الأوقات وتجنب التحول من الأنسجة المضمنة.
  6. الحفاظ قوالب المجمدة في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لقطع، لمدة تصل إلى عدة أشهر.

3. Cryosectioning جزءا لا يتجزأ من أطرافه

  1. ضبط درجة الحرارة الغرفة ناظم البرد إلى -20 ° C، درجة حرارة الجسم إلى -18 ° C. ضبط درجة حرارة الكائن أسفل عند الضرورة.
  2. تتوازن كتلة الأنسجة داخل غرفة ناظم البرد لمدة 30 دقيقة على الأقل. درجة الحرارة كتلة الصحيحةerature هو أمر حاسم لقسم الجودة.
  3. قطع المقاطع العرضية في سمك 10 ميكرون أو أقل. لن يتم اختراقها أقسام سمكا بالكامل من قبل الكواشف TUNEL. استخدام لوحة مكافحة لفة، شفرات، وزاوية شفرة (عادة 5 °) الموصى بها لناظم البرد.
  4. جمع المقاطع على gelatin- أو الشرائح الزجاجية المغلفة vectabond في درجة حرارة الغرفة. وضع على الفور في مربع الشريحة على الثلج الجاف. الاحتفاظ مربع الشريحة في وعاء منفصل مع الثلج الجاف وضعت بالقرب من ناظم البرد في متناول الذراع.
    1. قطع الأجزاء المتسلسلة عرضية من خلال محور طويل من أطرافه، وتخطي 100-200 ميكرون. جمع لا يقل عن 3 أقسام المجاورة في كل مستوى التسلسلي.

4. TUNEL الفحص على أقسام Hindlimb باستخدام أدوات المتاحة تجاريا (جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر)

  1. ذوبان الجليد الشرائح مع أقسام لدرجة حرارة الغرفة، وبين عشية وضحاها الجاف أو خلال عطلة نهاية الاسبوع.
  2. ترطيب أقسام كتبها immersinز الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 2 × 10 دقيقة في جرة Coplin. الجافة مع مختبر مسح، وإزالة أكبر قدر من السائل حول القسم ممكن.
  3. أقسام Permeabilize
    1. استخدام إما غير بروتين، كاشف القائم على سابونين تجاري أو 0.5٪ Tween20 و 0.05٪ تريتون X100 في برنامج تلفزيوني.
    2. ضع الشريحة في غرفة الرطوبة. غرفة الرطوبة البسيطة هي مربع ماصة فارغة مع غطاء محكم، مع يضاف الماء ما يكفي لتغطية الجزء السفلي من مربع.
    3. ماصة كاشف كافية على الشريحة لتغطية القسم (50 ميكرولتر كافية لأطرافه الماوس حديثي الولادة). لا ماصة مباشرة على الباب، والتحريض المتكرر قد يؤدي القسم لرفع قبالة الشريحة.
    4. باستخدام ملقط حادة ذات الرؤوس، ضع مستطيل صغير من parafilm على رأس القسم لنشر قطرة من الكاشف وتغطي كامل القسم. إذا تشكل أي فقاعات تحت بارافيلم، ورفع بلطف تشغيله، الجافة، وتطبيق.
    5. احتضان الشرائح مع permeabilization كاشف لمدة 1 ساعة في غرفة الرطوبة مغطاة. إذا بدأت أقسام لرفع الخروج من الشرائح، وربما يتم تخفيض الوقت permeabilization إلى 30 دقيقة.
    6. غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني في Coplin جرة 2 × 5 دقائق. يجب المستطيلات بارافيلم تطفو إلى الأعلى، ويمكن بعد ذلك إزالتها والتخلص منها.
    7. باستخدام مختبر قضاء، وتجفيف الكثير من السائل حول أقسام ممكن.
  4. TDT بوساطة الحمض النووي كسر الوسم
    1. اتبع الإرشادات عدة لجعل 1X TDT عازلة وضع العلامات، وماصة المخزن ما يكفي من وضع العلامات على الشريحة لتغطية قسم الأنسجة (50 ميكرولتر كافية لأطرافه الماوس حديثي الولادة). احتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، تزج الشريحة في TDT عازلة وضع العلامات في جرة coplin.
    2. اتبع الإرشادات عدة لجعل TDT وضع العلامات المزيج. وتشمل هذه المجموعة الكوبالت والمغنيسيوم والمنغنيز والكاتيونات. والموجبة المنغنيز يعمل بشكل جيد على مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك العضلات والهيكل العظمي، TISS الجهاز العصبيUES والكبد والجلد والعظام.
    3. للتحكم إيجابية، إضافة الدناز (المسمى "نوكلياز" في المجموعة) إلى وضع العلامات مزيج TDT. بدلا من ذلك، قبل علاج قسم مراقبة الإيجابي مع الدناز العازلة في نوكلياز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وفقا لتعليمات الطقم. حافظ على حل الدناز وأقسام المعالجة الدناز بعيدا عن أقسام تجريبية أخرى لمنع انتقال التلوث.
    4. لسيطرة سلبية، حذف TDT انزيم من مزيج العلامات.
    5. استخدام مختبر محو لإزالة أكبر قدر من TDT عازلة وضع العلامات من الشريحة ممكن. ماصة TDT وضع العلامات مزيج على الشريحة (50 ميكرولتر لكل قسم)، وتغطي مع مستطيل جديد من parafilm، واحتضان في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. اتبع الإرشادات عدة لجعل عازلة توقف 1X. استخدام مختبر مسح لإزالة TDT وضع العلامات مزيج من الشرائح، وإضافة 200-300 عازلة توقف ميكرولتر لتغطية قسم الأنسجة، واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. آل ternatively، تزج الشريحة في المخزن توقف في جرة Coplin.
    7. غسل دقيقة الشريحة 2 × 2 في برنامج تلفزيوني. استخدام مختبر محو لإزالة PBS قدر من الشريحة ممكن.
  5. وضع العلامات الفلورية
    1. اتبع الإرشادات عدة لإعداد حل التوسيم فلوريسئين لتسمية dNTPs في فواصل DNA. حل ماصة على الشريحة (50 ميكرولتر لكل قسم)، وتغطي مع مستطيل جديد من parafilm، واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 20 دقيقة.
    2. غسل الشريحة لمدة 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني في جرة Coplin. استخدام مختبر محو لإزالة PBS أكبر قدر ممكن من الشريحة.
    3. تمييع هويشت 33258 صمة عار النووية إلى 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني وماصة على الشريحة (100-200 ميكرولتر كافية لتغطية القسم). احتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق.
    4. غسل 3X لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    5. ساترة مع antifade مضان وسائل الإعلام تصاعد وختم حواف مع طلاء الأظافر.
jove_title "> 5. اقتناء الصور الرقمية

  1. الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلورسنت التقليدية مع دابي، FITC، والمرشحات تكساس الأحمر (أو ما يعادلها). استخدام الهدف التكبير العالي (20X 40X أو) للتحقق من أن العلامات كانت ناجحة وكانت وصفت نوى (سليمة أو مجزأة). والهدف 10X كافية لتحديد الكميات من نقاط وTUNEL إيجابية.
  2. جمع الصور من تلطيخ هويشت، TUNEL تلطيخ، وإشارة autofluorescent كما ثلاث قنوات كاذبة اللون منفصلة مجتمعة في صورة واحدة. إذا كانت التسمية fluorophore TUNEL خضراء، إشارة الصورة autofluorescent في مرشح أحمر، والعكس بالعكس.
    1. منع جميع إعدادات التصوير يعادل بين الشرائح لالعتبة والكميات اللاحقة. لكل مرشح، وأوقات محددة مسبقا والتعرض قياسية، ربح، وbinning (أي binning هو أفضل)؛ لا تستخدم إعدادات التعرض أو كسب التلقائي.
    2. استخدام التجربة والخطأ للعثور على التعرض وزيادة الإعدادات التي سوف أفضل التقاط مجموعة من intensities عبر كافة الشرائح الملون. ضمان أنه لا توجد بكسل المشبعة في الصور المكتسبة، وهذه الإرادة التحيز الكميات.
  3. التقاط صور لمجموعة العضلات كامل من الفائدة. وهذا قد يتطلب عدة صور إلى أن "مخيط" معا.

تحليل 6. صورة

  1. استخدام المتاحة تجاريا برامج تحليل الصور لتحليل الصور الرقمية من النفق تلطيخ. ويظهر التحليل باستخدام البرمجيات التجارية هنا. بدلا من ذلك، برنامج يماغيج خالية من NIH يمكن استخدامها لتحليل TUNEL تلطيخ.
  2. وصمة عار قسم مجاور لقسم الملطخة TUNEL مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) واتخاذ القسم كامل الصورة الرقمية مع المجهر brightfield التقليدية. استخدام هذا H & E الصورة في تركيبة مع أطلس التشريح 5،18،19 لتتبع الهياكل التشريحية ليكون كميا.
  3. مع تحول قناة TUNEL قبالة، يدويا تتبع الخطوط العريضة للمنطقة ليكون كميا، وذلك باستخدامهويشت وقنوات تألق ذاتي للاسترشاد بها. تحويل المنطقة تتبع إلى قناع (مجموعة من بكسل اختيار ينسق ليتم تحليلها).
  4. بدوره على قناة TUNEL. باستخدام شدة العتبة وظيفة في برنامج تحليل الصور، تعيين عتبة أدنى لاستبعاد كل إشارة تألق ذاتي.
  5. تطبيق الإعدادات عتبة نفسها لجميع الصور في مجموعة الدراسة. تحويل التحديدات thresholded إلى أقنعة.
  6. لكل صورة، والجمع بين القناع منطقة العضلات وقناع TUNEL. سوف قناع تركيبة جديدة تمثل إشارة TUNEL داخل منطقة العضلات تتبع فقط.
  7. أداء قناع الكميات على القناع تركيبة لتحديد عدد الكائنات وجوه مجال إشارة TUNEL داخل منطقة العضلات تتبعها. تنفيذ هذا باستخدام وظيفة الجسيمات محلل في يماغيج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع تلطيخ ناجحة، يجب أن تكون-TUNEL إيجابي إشارة مشرق بما فيه الكفاية لعزل من تألق ذاتي من خلال وضع عتبات كثافة. الأجسام TUNEL إيجابية في التكبير المنخفض قد تظهر أجزاء غير منتظمة كما مشرق في العضلات والهيكل العظمي (الشكل 1A). ومع ذلك، في أعلى التكبير، وبعض الكائنات TUNEL الإيجابي مع التشكل أفكارك الكلاسيكي ينبغي أن تراعى، إذا كان نوع موت الخلايا المعنية هو موت الخلايا المبرمج (الشكل 1B). مراقبة إيجابية (المضافة الدناز) يجب أن تظهر وفيرة-TUNEL إيجابي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك طريقة لكشف وتحليل كمي DNA المرتبط ضرر الخلايا في الماوس العضلات والهيكل العظمي وصفها. ويشمل الإجراء الحصاد الأنسجة، TUNEL تلطيخ، واقتناء الصور الرقمية، وتحليل الصور. هناك حاجة إلى إمدادات وأدوات النسيجية المشتركة، وTUNEL عدة التجارية الخاصة أمر ضروري. بنود المعدات الكبيرة الأساسية اللازمة لناظم البرد، المجهر epifluorescent مع القدرة الصورة الرقمية، ونظام الكمبيوتر لتحليل الصور.

وينبغي أن يكون المجرب علم الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH-NINDS RO1-NS065895 ومنحة NIH-NINDS 5-F31-NS076250-02.

نشكر مرفق مجهر JHU SOM على استخدام جهاز التبريد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفاتعلوم المجهر الإلكتروني19202بالنسبة للإجراءات الموضحة هنا ، تم تحضير محلول 4٪ طازجا من المسحوق. يمكن استخدام بارافورمالدهايد من أي مورد. يجب تخزين محلول الفورمالديهايد المحضر في درجة حرارة 4 درجات ؛ C ويجب عدم استخدامه بعد تاريخ انتهاء صلاحيته (حتى عدة أشهر). بارافورمالدهيد مادة مسرطنة وسم عن طريق الاستنشاق وملامسة الجلد. يرجى اتباع الاحتياطات المحددة في MSDS عند التعامل مع بارافورمالدهايد.
السكروزسيجماS0389يستخدم لحماية الأنسجة بالتبريد قبل التجميد. يمكن استخدام السكروز من أي مورد.
O.C.T. مركبالأنسجة - Tek4583وسيط التضمين للتقطيع بالتبريد.
تم استخدام CryostatLeicaCM 3050SA Leica CM3050S cryostat للمستحضرات الموضحة هنا. أي ناظم ناتج البرد قادر على قطع 10 مو ؛ يمكن استخدام أقسام م.
شرائح زجاجية ، 25 × 75 × 1 ممفيشر12-552-3شرائح من أي مورد.
الجيلاتينSigmaG-9391الجيلاتين لتعزيز التصاق قسم الأنسجة بالشرائح الزجاجية. لطلاء الشرائح الزجاجية بالجيلاتين ، قم بإذابة 2.75 جم من الجيلاتين و 0.275 جم من شب الكروم في 500 مل من الماء المقطر ، دافئا إلى 60 درجة ؛ ج ، اغمس الشرائح لعدة ثوان ، واتركها تجف. يمكن استخدام الجيلاتين من أي مورد. بدلا من ذلك ، يمكن شراء شرائح مغلفة بالجيلاتين.
كبريتات البوتاسيوم الكروم (III) دوديكاهيدرات (شب الكروم)Sigma243361الكروم إلى محلول الجيلاتين لتعزيز التصاق الأنسجة على الشرائح الزجاجية. إنه مادة مسرطنة محتملة وسم عن طريق الاستنشاق وملامسة الجلد. يرجى اتباع الاحتياطات المحددة في MSDS عند التعامل مع شب الكروم.
كاشف التصاق الأنسجة VectabondVector LabsSP-1800ركيزة اختيارية لتحسين التصاق الأنسجة بالشرائح الزجاجية ؛ يمكن استخدام الشرائح المطلية بالجيلاتين بدلا من ذلك.
Tween20SigmaP9416منظف يستخدم لاختراق الأنسجة. يمكن استخدام Tween20 من أي مورد.
Triton X100SigmaT8787منظف يستخدم لاختراق الأنسجة. يمكن استخدام Triton X100 من أي مورد.
طقم الكشف عن موت الخلايا المبرمج TACS 2 TdT in الموقع < / em> مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمجTrevigen4812-30-Kمجموعة تجارية لوضع العلامات على TUNEL القائمة على الفلورة.
DNase / nucleaseTrevigen4812-30-K(مضمن مع المجموعة)
DNase / nucleaseTrevigen4812-30-K(مرفق مع المجموعة)
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4Amresco780اصنع 1x PBS للغسيل والتخفيفات. يمكن استخدام PBS من أي مورد.
مياه خالية من DNaseجودة بيولوجية351-029-131يمكن استخدام المياه من أي مورد.
Hoechst 33258Sigma94403صبغة نووية. يمكن استخدام أي صبغة نووية فلورية زرقاء. كصبغة ملزمة للحمض النووي ، فإن Hoechst مادة مسرطنة مشتبه بها ويجب التعامل معها بمعدات واقية لتقليل ملامسة الجلد.
يمكن استخدام Parafilm MMultiple807أي فيلم آخر كاره للماء أو زلة غطاء. متوفر من موردين متعددين.
أي مجهر فلوري مزود بكاميرا رقميةقادر على التقاط التألق الأحمر والأخضر والأزرق رقميا في قنوات منفصلة.
وسائط Vectashield المضادة للتلاشيVector LabsH-1000Antifade Media من أي مورد.
أغطية زجاجية ، سمك رقم 1مختبرات أبحاث الدماغ2222-1زلات غطاء من أي مورد. أصغر حجم 22 × 22 مم يكفي لأقسام أرجل الفأر حديثي الولادة.
طلاء الأظافرتيد بيلا114-8يستخدم لإغلاق أغطية. يمكن استخدام طلاء الأظافر من أي مورد (بما في ذلك تجار التجزئة العاديين). تجنب استخدام طلاء الأظافر مع اللون أو الإضافات التي قد تعكس الضوء أثناء التصوير الفلوري.
يمكن استخدام يستخدم يضاف شب buffer يمكن استخدام يمكن استخدام يمكن استخدام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83(2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة