مقالة منهجية

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس في الموقع استخدام أسلوب TUNEL

DOI:

10.3791/52211

⸱

ديسمبر 16, 2014

 , 
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا الفيديو التشريح ومعالجة الأنسجة والتقسيم ووضع العلامات على TUNEL المستند إلى التألق لعضلة الهيكل العظمي للفأر. كما يصف طريقة للتحليل شبه الآلي لوضع العلامات على TUNEL.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT) ديوكسي أوريدين ثلاثي الفوسفات (dUTP) وسم نهاية النيك (TUNEL) هي طريقة استخدام إنزيم TdT لإرفاق شكل موسوم من dUTP تساهميا بنهايات 3 'من فواصل الحمض النووي المزدوجة والمفردة الشريطة في الخلايا. إنها طريقة موثوقة ومفيدة للكشف عن تلف الحمض النووي وموت الخلايا في الموقع. يصف هذا الفيديو تشريح ومعالجة الأنسجة والتقسيم ووضع العلامات على TUNEL القائم على التألق لعضلة الهيكل العظمي للفأر. كما يصف طريقة القياس الكمي لإشارة TUNEL شبه الآلية. تؤثر ميزات الأنسجة الطبيعية المتأصلة وظروف معالجة الأنسجة على قدرة إنزيم TdT على تسمية الحمض النووي بكفاءة. قد تضيف معالجة الأنسجة أيضا تألقا ذاتيا غير مرغوب فيه يتداخل مع اكتشاف إشارة TUNEL. لذلك ، من المهم تحديد طرق معالجة الأنسجة ووضع العلامات TUNEL تجريبيا والتي ستؤدي إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى للقياس الكمي اللاحق. يوفر الاختبار القائم على التألق الموصوف هنا طريقة لاستبعاد إشارة الفلورسنت الذاتي عن طريق طرح القناة الرقمية. يعد اختبار TUNEL ، المستخدم مع تقنيات معالجة الأنسجة والضوابط المناسبة ، طريقة كمية سريعة نسبيا وقابلة للتكرار للكشف عن موت الخلايا المبرمج في الأنسجة. يمكن استخدامه لتأكيد تلف الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج كآليات مرضية ، ولتحديد أنواع الخلايا المصابة ، وتقييم فعالية العلاجات العلاجية في الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز (TDT) dUTP وضع العلامات نهاية نيك (TUNEL) هو عملية استخدام انزيم TDT إرفاق dUTP إلى 3 'ينتهي من مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل DNA يكسر 12،23. وذكرت وطريقة TUNEL للكشف عن الخلايا والحمض النووي الضرر لأول مرة منذ أكثر من 20 عاما من قبل Gavrieli وآخرون. 1،12،24. ومنذ ذلك الحين تم تقييمها والأمثل في الأعمال التحضيرية الأنسجة المختلفة 7،23،27،40. وقد استخدم TUNEL لدراسة موت الخلايا الناجم عن نقص التروية من الخلايا العصبية 6،14،29 والعضلية 43،44، excitotoxic المواد موت الخلايا العصبية 30،31، وكما العلامات البيولوجية ف....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وصفها في هذا البروتوكول وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة 26. وتمت الموافقة على البروتوكول (MO13M391) من قبل لجنة جامعة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز.

1. حديثي الولادة ماوس النحر، تشريح، والتثبيت

  1. التضحية ماوس الأطفال حديثي الولادة عن طريق CO 2 الاستنشاق.
  2. قطع على الفور من على hindlimb فوق ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع تلطيخ ناجحة، يجب أن تكون-TUNEL إيجابي إشارة مشرق بما فيه الكفاية لعزل من تألق ذاتي من خلال وضع عتبات كثافة. الأجسام TUNEL إيجابية في التكبير المنخفض قد تظهر أجزاء غير منتظمة كما مشرق في العضلات والهيكل العظمي (الشكل 1A). ومع ذلك، في أعلى التكبير، وبعض الكائنات TUNEL الإيجابي مع التشكل أفكارك الكلاسيكي ينبغي أن تراعى، إذا كان نوع موت الخلايا المعنية هو موت الخلايا المبرمج (الشكل 1B). مراقبة إيجابية (المضافة الدناز) يجب أن تظهر وفيرة-TUNEL إيجابي.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك طريقة لكشف وتحليل كمي DNA المرتبط ضرر الخلايا في الماوس العضلات والهيكل العظمي وصفها. ويشمل الإجراء الحصاد الأنسجة، TUNEL تلطيخ، واقتناء الصور الرقمية، وتحليل الصور. هناك حاجة إلى إمدادات وأدوات النسيجية المشتركة، وTUNEL عدة التجارية الخاصة أمر ضروري. بنود المعدات الكبيرة الأساسية اللازمة لناظم البرد، المجهر epifluorescent مع القدرة الصورة الرقمية، ونظام الكمبيوتر لتحليل الصور.

وينبغي أن يكون المجرب علم الم.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH-NINDS RO1-NS065895 ومنحة NIH-NINDS 5-F31-NS076250-02.

نشكر مرفق مجهر JHU SOM على استخدام جهاز التبريد.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفاتعلوم المجهر الإلكتروني19202بالنسبة للإجراءات الموضحة هنا ، تم تحضير محلول 4٪ طازجا من المسحوق. يمكن استخدام بارافورمالدهايد من أي مورد. يجب تخزين محلول الفورمالديهايد المحضر في درجة حرارة 4 درجات ؛ C ويجب عدم استخدامه بعد تاريخ انتهاء صلاحيته (حتى عدة أشهر). بارافورمالدهيد مادة مسرطنة وسم عن طريق الاستنشاق وملامسة الجلد. يرجى اتباع الاحتياطات المحددة في MSDS عند التعامل مع بارافورمالدهايد.
السكروزسيجماS0389يستخدم لحماية الأنسجة بالتبريد قبل التجميد. يمكن استخدام السكروز من أي مورد.
O.C.T. مركبالأنسجة - Tek4583وسيط التضمين للتقطيع بالتبريد.
تم استخدام CryostatLeicaCM 3050SA Leica CM3050S cryostat للمستحضرات الموضحة هنا. أي ناظم ناتج البرد قادر على قطع 10 مو ؛ يمكن استخدام أقسام م.
شرائح زجاجية ، 25 × 75 × 1 ممفيشر12-552-3شرائح من أي مورد.
الجيلاتينSigmaG-9391الجيلاتين لتعزيز التصاق قسم الأنسجة بالشرائح الزجاجية. لطلاء الشرائح الزجاجية بالجيلاتين ، قم بإذابة 2.75 جم من الجيلاتين و 0.275 جم من شب الكروم في 500 مل من الماء المقطر ، دافئا إلى 60 درجة ؛ ج ، اغمس الشرائح لعدة ثوان ، واتركها تجف. يمكن استخدام الجيلاتين من أي مورد. بدلا من ذلك ، يمكن شراء شرائح مغلفة بالجيلاتين.
كبريتات البوتاسيوم الكروم (III) دوديكاهيدرات (شب الكروم)Sigma243361الكروم إلى محلول الجيلاتين لتعزيز التصاق الأنسجة على الشرائح الزجاجية. إنه مادة مسرطنة محتملة وسم عن طريق الاستنشاق وملامسة الجلد. يرجى اتباع الاحتياطات المحددة في MSDS عند التعامل مع شب الكروم.
كاشف التصاق الأنسجة VectabondVector LabsSP-1800ركيزة اختيارية لتحسين التصاق الأنسجة بالشرائح الزجاجية ؛ يمكن استخدام الشرائح المطلية بالجيلاتين بدلا من ذلك.
Tween20SigmaP9416منظف يستخدم لاختراق الأنسجة. يمكن استخدام Tween20 من أي مورد.
Triton X100SigmaT8787منظف يستخدم لاختراق الأنسجة. يمكن استخدام Triton X100 من أي مورد.
طقم الكشف عن موت الخلايا المبرمج TACS 2 TdT in الموقع < / em> مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمجTrevigen4812-30-Kمجموعة تجارية لوضع العلامات على TUNEL القائمة على الفلورة.
DNase / nucleaseTrevigen4812-30-K(مضمن مع المجموعة)
DNase / nucleaseTrevigen4812-30-K(مرفق مع المجموعة)
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4Amresco780اصنع 1x PBS للغسيل والتخفيفات. يمكن استخدام PBS من أي مورد.
مياه خالية من DNaseجودة بيولوجية351-029-131يمكن استخدام المياه من أي مورد.
Hoechst 33258Sigma94403صبغة نووية. يمكن استخدام أي صبغة نووية فلورية زرقاء. كصبغة ملزمة للحمض النووي ، فإن Hoechst مادة مسرطنة مشتبه بها ويجب التعامل معها بمعدات واقية لتقليل ملامسة الجلد.
يمكن استخدام Parafilm MMultiple807أي فيلم آخر كاره للماء أو زلة غطاء. متوفر من موردين متعددين.
أي مجهر فلوري مزود بكاميرا رقميةقادر على التقاط التألق الأحمر والأخضر والأزرق رقميا في قنوات منفصلة.
وسائط Vectashield المضادة للتلاشيVector LabsH-1000Antifade Media من أي مورد.
أغطية زجاجية ، سمك رقم 1مختبرات أبحاث الدماغ2222-1زلات غطاء من أي مورد. أصغر حجم 22 × 22 مم يكفي لأقسام أرجل الفأر حديثي الولادة.
طلاء الأظافرتيد بيلا114-8يستخدم لإغلاق أغطية. يمكن استخدام طلاء الأظافر من أي مورد (بما في ذلك تجار التجزئة العاديين). تجنب استخدام طلاء الأظافر مع اللون أو الإضافات التي قد تعكس الضوء أثناء التصوير الفلوري.
يمكن استخدام يستخدم يضاف شب buffer يمكن استخدام يمكن استخدام يمكن استخدام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue c....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة