مقالة منهجية

تقييم تأثير التعرض المتكرر من عضوي النمط 3D الشعبي والأنف زراعة الأنسجة نماذج لكامل دخان السجائر

11.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52325

⸱

فبراير 12, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

في هذه المقالة

ملخص

الهدف من هذا البروتوكول هو تعريض نماذج أنسجة الشعب الهوائية والأنف ثلاثية الأبعاد العضوية البشرية لدخان السجائر السائد (CS) في واجهة الهواء السائل. ثم يتم التحقيق في تأثير CS على الأنسجة باستخدام مقايسة نشاط السيتوكروم P450 ، وقياس ضرب الأهداب ، ونهج بيولوجيا الأنظمة.

الملخص

دخان السجائر (CS) له تأثير كبير على بيولوجيا الرئة وقد يؤدي إلى تطور أمراض الرئة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن أو سرطان الرئة. لفهم الآليات الأساسية لتطور المرض ، سيكون من المهم فحص تأثير التعرض ل CS مباشرة على أنسجة الرئة. ومع ذلك ، يصعب تنفيذ هذا النهج في الدراسات الوبائية لأن أخذ عينات أنسجة الرئة معقد وغازي. بدلا من ذلك ، يمكن لنماذج زراعة الأنسجة أن تسهل تقييم تأثيرات التعرض على أنسجة الرئة. تم استخدام مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد المغمورة ، مثل ثقافات الخلايا الظهارية للقصبات الهوائية البشرية الطبيعية (NHBE) ، تقليديا لهذا الغرض. ومع ذلك ، لا يمكن تعريضهم مباشرة للدخان بطريقة مماثلة لحالة التعرض في الجسم الحي. تعكس نماذج زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد المطورة مؤخرا بشكل أفضل الوضع في الجسم الحي لأنه يمكن زراعتها في واجهة الهواء والسائل (ALI). جوانبهم القاعدية مغمورة في وسط الثقافة. في حين أن جوانبها القمية معرضة للهواء. علاوة على ذلك ، فإن مزارع الأنسجة العضوية التي تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا ، تمثل بشكل أفضل فسيولوجيا الأنسجة في الجسم الحي. في هذا العمل ، يتم توضيح استخدام نظام التعرض في المختبر لتعريض نماذج الشعب الهوائية والأنسجة الأنفية العضوية البشرية إلى CS السائد. تم قياس تواتر الضرب الهدبي ونشاط السيتوكروم P450s (CYP) 1A1 / 1B1 لتقييم التأثيرات الوظيفية ل CS على الأنسجة. علاوة على ذلك ، لفحص التعديلات التي يسببها CS على المستوى الجزيئي ، تم إنشاء ملامح التعبير الجيني من الأنسجة بعد التعرض. لوحظت زيادة طفيفة في نشاط CYP1A1 / 1B1 في الأنسجة المعرضة ل CS مقارنة بالأنسجة المعرضة للهواء. كان نهج بيولوجيا الأنظمة القائم على الشبكة والنسخ قويا بما يكفي لإثبات التغيرات التي يسببها CS في التمثيل الغذائي للأجانب الحيوي والتي كانت مشابهة لتلك التي لوحظت في الخلايا الظهارية القصبية والأنفية التي تم الحصول عليها من المدخنين.

المقدمة

تتعرض الرئتان بشكل مباشر ومستمر للهواء المستنشق الذي قد يحتوي على مواد سامة متنوعة مثل الملوثات ومكونات دخان السجائر (CS). تعد دراسة تأثير التعرض لتلك المواد السامة على أنسجة الجهاز التنفسي أكثر إفادة عندما يتم إجراؤها بطريقة تشبه التعرض في الجسم الحي. بالمقارنة مع مزارع الخلايا المغمورة ثنائية الأبعاد الكلاسيكية (على سبيل المثال ، الخلايا الظهارية القصبية البشرية الطبيعية (NHBE)) ، فإن نماذج الأنسجة العضوية ثلاثية الأبعاد تلخص بشكل أفضل الجوانب المورفولوجية والفسيولوجية والجزيئية لظهارة مجرى الهواء البشري في الجسم الحي1،2: تحتوي نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد على تنوع أنواع الخلايا التي لوحظت في الجسم الحي، بما في ذلك الخلايا الظهارية المتمايزة والخلايا المهدبة وغير المهدبة وخلايا الكأس والخلايا القاعدية. لديهم تقاطعات ضيقة وظيفية ويظهرون نمطا ظاهريا هدبيا للمخاط 1-3. علاوة على ذلك ، يمكن زراعة الثقافات على غشاء مسامي قابل للاختراق ، في واجهة هواء سائلة ، مما يسمح بالتعرض المباشر للهباء الجوي في الجانب القمي (بينما يكون الجانب القاعدي الجانبي مغمورا في وسط الاستزراع) 3-5. أفاد دفوراك وزملاؤه أن ملامح التعبير الجيني لنماذج أنسجة الشعب الهوائية كانت مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها من تنظيف الشعب الهوائية البشرية 3. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر ماتيس وزملاؤه أن استجابات نماذج الأنسجة هذه ل CS كانت مشابهة للاختلافات التي لوحظت بين الخلايا الظهارية القصبية التي تم الحصول عليها من المدخنين والخلايا التي تم الحصول عليها من غير المدخنين 6. أخيرا ، نظرا لأنه يمكن زراعة نماذج أنسجة الشعب الهوائية لمدة تصل إلى عدة أشهر 4،5 ، فمن المحتمل أن تستخدم لفحص آثار التعرض طويل الأمد لعناصر الاختبار.

تقييمات السمية الخلوية هي معلمات شائعة يتم قياسها بعد الإهانات الكيميائية أو لتقييم سمية مركبات أو مخاليط معينة. على سبيل المثال ، يمكن قياس سلامة الغشاء عن طريق اختبار مضيء ويسمح بقياس التأثير السام للخلايا المعتمد على الجرعة على ثقافة الخلية 7. ومع ذلك ، لتقييم التأثيرات الفيزيولوجية المرضية للمركبات بتركيزات شبه سمية ، يجب قياس المعلمات الأخرى. على سبيل المثال ، تضمن سلامة الأنسجة التي يتم تحديدها باستخدام اختبار المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) وظيفة التقاطعات الضيقة وتراقب اضطراب الطبقة الظهارية 8،9. يسمح تكرار الضرب الهدبي أيضا بقياس التأثيرات المرتبطة ب CS على أنسجة الجهاز التنفسي. يعد تكرار الضرب الطبيعي لبطانة الأهداب المتاخمة للجهاز التنفسي العلوي والسفلي أمرا مهما للحماية من التهابات مجرى الهواء 10. تحتوي كل من الخلايا الظهارية العمودية المهدبة في ظهارة الجهاز التنفسي على 200-300 أهداب تنبض بتردد معين للقضاء على العوامل المعدية أو الجسيمات المستنشقة المحاصرة في المخاط المنبعث من خلايا الكأس المتناثرة 11. يحتوي CS على مواد كيميائية قد تمنع الضرب الهدبي 12 ، مما يؤدي إلى تقليل حماية الجهاز التنفسي. يوضح هذا العمل أنه يمكن قياس الضرب الهدبي في نماذج الأنسجة العضوية. يسمح هذا النهج بتقييم ما إذا كانت الخلايا الظهارية تظهر وظيفتها الطبيعية في ثقافة الأنسجة العضوية. ينشط CS أيضا استجابات التمثيل الغذائي للأجانب الحيوي في الجهاز التنفسي لاستقلاب مكونات دخان التبغ 13. يمكن قياس نشاط إنزيمات التمثيل الغذائي الغريبة للمرحلة الأولى ، CYP1A1 و CYP1B1 ، لنماذج الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، كما ورد سابقا ، يمكن قياس التعبير الجيني العالمي في نماذج أنسجة الشعب الهوائية العضوية 6،14،15. يتم الاستفادة من نهج بيولوجيا البيانات النسخية والأنظمة القائمة على الشبكة لتقييم تأثير CS على التمثيل الغذائي للأجانب الحيوي 15.

يتم تفصيل المنهجيات المستخدمة لتعريض نماذج الأنسجة الهوائية والأنفية ثلاثية الأبعاد العضوية إلى CS السائد باستخدام نظام التعرض في المختبر ولقياس استجابات الأنسجة لهذا التعرض مقارنة بالتعرض للهواء النقي (التحكم).

البروتوكول

1. الثقافة من الأنسجة عضوي النمط الشعبي الثقافة نموذج

ملاحظة: تم شراء نماذج الأنسجة اعادة تشكيل وكما تدرج التي هي جاهزة للاستخدام. بدلا من ذلك، يمكن وضع الثقافة من الخلايا الأولية كما هو موضح على سبيل المثال كارب وزملاؤه 16. بعد استلام الأنسجة في التعبئة والتغليف المعقم، والتعامل مع الأنسجة دائما عضوي النمط الإنسان تحت ظروف معقمة.

  1. إضافة 0.7 مل من قبل تحسنت (37 ° C) فحص المتوسط ​​إلى كل بئر من لوحة 24 معقمة جيدا جديدة تحت غطاء محرك السيارة.
  2. إزالة التعبئة والتغليف من الأنسجة تحت غطاء محرك السيارة، ونقل إدراج زراعة الأنسجة لإعداد لوحة 24 بئر جديد (هو موضح في الخطوة 1.1 أعلاه).
  3. صيانة والثقافة الأنسجة في حاضنة عند 37 درجة مئوية (5٪ CO 2، 90٪ الرطوبة).
  4. استبدال المتوسطة كل أيام 2.
  5. خلال تغيير المتوسطة، فحص الأنسجة تحت المجهر الخفيفة للتأكد من أنهم هم contaminatiمجانا على وأنه لا يوجد أي تسرب من المتوسط.

2. دخان السجائر (CS) التعرض باستخدام نظام التعرض في المختبر

  1. قبل ثلاثة أيام من التجارب التعرض، وغسل الجانب قمية من زراعة الأنسجة مع 200 ميكرولتر من مستنبت.
  2. في يوم من التعرض، وإذا تم التخطيط لقياس الهدبية الضرب قبل التعرض، والتعامل مع الأنسجة لقياس الهدبية الضرب كما هو موضح في القسم 3.
  3. قبل تدفئة الغرفة المناخية للفي المختبر نظام التعرض وحدة القاعدة زراعة إلى 37 درجة مئوية. ملء وحدة قاعدة زراعة مع 17.5 مل من المتوسط ​​في كل صف.
  4. إزالة الأنسجة من الحاضنة ووضعها تحت غطاء محرك السيارة لنقل إدراج زراعة الأنسجة من لوحة الثقافة إلى وحدة قاعدة زراعة في المختبر نظام التعرض. بالإضافة إلى ذلك، تغطية وحدة قاعدة زراعة مع غطاء زجاجي.
  5. نقل الأنسجة في غرفة المناخية للفي المختبر التعرض التنفسيم التعرض للالتيار CS.
  6. إذا تم تجهيز المختبر في نظام التعرض مع توازن دقيق، انشاء الكريستال الكوارتز توازن دقيق قبل تشغيل التعرض لقياس ترسب الجسيمات في الوقت الحقيقي من الدخان على بلورة الكوارتز باستخدام برنامج توازن دقيق.
    1. استبدال بلورات في وحدات توازن دقيق متصلة كل صف من نظام تخفيف / التوزيع.
    2. ربط الوحدة توازن دقيق لبرنامج توازن دقيق. تعيين حجم القياس إلى الصفر في البرنامج.
  7. فضح الأنسجة وفقا للإجراء التجريبي (على سبيل المثال، كما في الشكل 1).
    ملاحظة: قبل التعرض، والسجائر المرجعية (3R4F) هي مشروطة بين 7 و 21 يوما تحت ظروف خاضعة للرقابة في 22 ± 1 ° C والرطوبة النسبية 60 ± 3٪ وفقا لمعيار ISO 3402 17.
    1. توليد دخان السجائر (على سبيل المثال، من 3R4F السجائر) باستخدام 30 منفذا التدخين دائري ماخالمعهد الوطني للإحصاء وفقا للنظام المكثف وزارة الصحة الكندية: دخان السجائر على طول بعقب القياسية، أي ما يقرب من 35 ملم في 55 مل نفخة أكثر من 2 ثانية، ومرتين دقيقة و 8 ثانية الوقت مضخة العادم.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، يخفف من التيار CS بحيث الجرعة ليست سامة جدا. في النتائج المعلنة هنا، تم تخفيفه الدخان إلى 16٪ (المجلد / المجلد).
    2. استخدام 60٪ مرطب الهواء لعينات التحكم (يتعرض الهواء).
    3. فضح الأنسجة لمدة 6-7 دقيقة (أي.، 1 السجائر أو المعرضة للهواء) في المختبر في نظام التعرض
    4. وضع أنسجة الظهر في الحاضنة عند 37 درجة مئوية (5٪ CO 2، 90٪ الرطوبة) لمدة 1 ساعة.
    5. كرر الخطوات من 2.7.3 و2.7.4 ثلاث مرات أكثر.
  8. في نهاية التجربة التعرض، ووقف البرنامج توازن دقيق. يقوم البرنامج بإنشاء ملف يحتوي على جميع القياسات جنبا إلى جنب مع تمثيل رسومي للترسب الجسيمات.
  9. نقل مرة أخرى أنسجة من زراعة ببورصة عمان حدة لوحة الثقافة. وضع الأنسجة مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية (5٪ CO 2، 90٪ الرطوبة) حتى القياسات لنقاط النهاية مختلفة في بعد التعرض للنقاط زمنية محددة.

3. قياس الهدبية الضرب

ملاحظة: وفقا لخطة التجريبية (الشكل 1)، وسجل الهدبية الضرب قبل التعرض ومباشرة بعد التعرض.

  1. إزالة لوحات زراعة الأنسجة من الحاضنة وتركهم تحت غطاء محرك السيارة في RT لمدة 30 دقيقة لتحقيق الاستقرار في الضرب أهداب.
  2. وضع الأنسجة تحت المجهر الضوئي متصلا البرامج CiliaMetrix.
  3. تسجيل الفيلم والتردد (في هيرتز) من الضرب الهدبية. قياس وتيرة كل ثانية 3 لمدة 1 دقيقة.
  4. العودة الأنسجة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية (5٪ CO 2، 90٪ الرطوبة).

4. بطريق الظهارة المقاومة الكهربائية (طير) قياس

ملاحظة: يتم إجراء قياس طير 3 أيام قبل و48 ساعة بعد التعرض تحت غطاء محرك السيارة تحت ظروف معقمة باستخدام عود الكهربائي (STX-2) متصلا voltohmmeter.

  1. إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة إلى السطح القمي للأنسجة الشعب الهوائية الإنسان.
  2. بدوره على آلة EVOMX. غسل القطب مع الحل الايثانول 70٪.
  3. غسل القطب مع مستنبت.
  4. قياس المقاومة (Ω) عن طريق إدراج الكهربائي في المتوسط ​​على الجانب قمية من زراعة الأنسجة دون لمس الأنسجة.
  5. كرر الخطوة 4.4 خمس مرات للحصول على قياسات quintuplicate.
  6. بعد القياسات، وإزالة بلطف المتوسطة من الجانب قمية من مزارع الأنسجة باستخدام الشافطة.
  7. العودة الثقافات الأنسجة إلى الحاضنة في في 37 ° C (5٪ CO 2، 90٪ الرطوبة) للزراعة.

5. السيتوكروم P450 (CYP) 1A1 / 1B1 Activiتاي

  1. قبل بدء الدراسة، وإعداد كشف كاشف وسيفيرين عن طريق نقل محتويات زجاجة من المخزن المؤقت إعادة المناسب لزجاجة العنبر التي تحتوي على كاشف كشف وسيفيرين (وفقا لتعليمات الشركة الصانعة). مخزن aliquots من 2 مل في -20 ° C لمدة أقصاها 1 الشهر.
  2. لمدة 48 ساعة بعد التعرض الوقت، واحتضان الأنسجة لمدة 48 ساعة بعد التعرض CS عند 37 درجة مئوية.
  3. تدفئة كشف كاشف وسيفيرين لRT.
  4. احتضان إدراج الأنسجة لمدة 3 ساعة أو O / N مع الركيزة وسيفيرين-CEE (المخفف في الساعة 1:50) في مستنبت القاعدية.
  5. نقل 50 ميكرولتر من مستنبت من كل الأنسجة تضاف إلى مبهمة 96-جيدا لوحة luminometer البيضاء في RT.
  6. إضافة 50 ميكرولتر من الكشف وسيفيرين الكاشف إلى كل بئر لبدء رد فعل الانارة.
  7. احتضان لوحة في RT لمدة 20 دقيقة.
  8. قراءة التألق باستخدام luminometer.
    ملاحظة: لluminometer، استخدم وقت تكامل ،25-1 ثانية لكل بئر كمبدأ توجيهي.

6. استخراج الحمض النووي الريبي.

  1. قبل جمع إدراج الأنسجة عضوي النمط 3D، وإعداد 1) مربع مع الثلج الجاف، 2) كمية كافية من ريش (واحد لكل إدراج 3D)، 3) الباردة PBS دون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم، 4) واحد 25 مل الزجاج الماصة، و 5 ) الإبر زجاجية معقمة الانقاذ.
    1. أنابيب التسمية مليئة الخرز من السيراميك لالمجانسة عينات الخلوية الصلبة وإضافة 700 ميكرولتر من Qiazol.
    2. بدوره على الجهاز التنفسي.
    3. جمع لوحة من إدراج الأنسجة عضوي النمط 3D من الحاضنة.
    4. غسل كل إدراج على لوحة 3 مرات مع PBS الباردة. بين يغسل، ونضح PBS مع الإبرة الزجاج. بعد غسل الثالث، نضح مع برنامج تلفزيوني وبطانات لمنع جفاف إدراج.
    5. لكل من إدراج لوحة، وقطع غشاء إدراج (التي إدراج الأنسجة 3D يقيم) حتى membrانو تقع شقة أسفل على النصل.
    6. نقل الأنسجة (جنبا إلى جنب مع غشاء إدراج) من شفرة إلى أنبوب التجانس وصفت بشكل مناسب والمسمار غطاء على أنبوب، التخلص منه ودوامة عليه.
    7. تجميد العينة في الثلج الجاف وتخزينها في -80 ° C أو الاستمرار في استخراج الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: قبل استخراج الحمض النووي الريبي، تسمية جميع الأنابيب والأعمدة وفقا لتصميم العشوائية (إن وجد). إعداد جميع الكواشف وفقا لتوصيات الشركة الصانعة وإخراج عينات من -80 ° C الفريزر وذوبان الجليد لهم على الجليد حتى يتم مطلق أنها تماما.
  2. التجانس
    1. عينات طحن مع المجانسة صك بشأن 6000 هرتز لمدة 45 ثانية. كرر إذا كانت العينات ليست متجانسة بشكل صحيح وترك عينات لمدة 5 دقائق على RT.
    2. إضافة 140 ميكرولتر الكلوروفورم لعينة ودوامة لمدة 10-15 ثانية.
    3. نقل طاف من أنبوب إلى أنبوب التجانس قفل المرحلة ويهز علىthermoshaker لمدة 2 دقيقة في الساعة 1400 دورة في الدقيقة وRT.
    4. وعلاوة على ذلك احتضان عينات لمدة 2 دقيقة في RT والعينات الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. هطول الأمطار RNA، وغسل والتعليق وتنقية في QIAcube.
    1. نقل المرحلة المائية العليا في أنبوب جديد 2 مل.
    2. تحميل كافة الكواشف اللازمة في الروبوت استخراج وفقا لصحيفة بروتوكول الشركة المصنعة، حدد البروتوكول المناسب، تعيين حجم شطف (30 ميكرولتر) وتشغيل الروبوت الاستخراج.
    3. عندما يتم الانتهاء المدى، وإزالة محولات الدوار والحفاظ على أنابيب شطف فورا عند 4 درجة مئوية لمزيد من التحليل أو في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
  4. مراقبة الجودة من الحمض النووي الريبي معزولة
    1. تحديد كمية من الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام القارئ للأشعة فوق البنفسجية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. تحقق من جودة وسلامة RNA RNA باستخدام ميكروفلويديك جل المستندة إلى مختبر على رقاقة وقارئ للأشعة فوق البنفسجية، لجنة التنسيق الإداريةأوردينج لتعليمات الشركة المصنعة.

7. ميكروأري سير العمل

ملاحظة: العملية الموضحة أدناه وتركز على طريقة لكيت Affymetrix GeneChip عالية الإنتاجية 3'IVT اكسبرس، والذي يستخدم لتخليق هدفا للالتهجين على خراطيش التعبير الجيني Affymetrix 3 "بدءا من إعداد RNA إلى استخدام مجمع نظام مناولة السائل (على سبيل المثال، pipetting ل، تمييع، والاستغناء، أو دمج).

  1. إعداد
    1. بطريقة عشوائية عينات لتجنب الآثار دفعة واحدة. عدد العينات التي تتم معالجتها بواسطة دفعات هو 1-96، بما في ذلك واحد الإيجابي (التجاري البشري RNA العالمي مرجع) والسلبية واحد (ريبونوكلياز المياه مجانا) مراقبة لكل دفعة.
    2. بدء تركيب الهدف باستخدام 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع في 3 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه. 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع، واستخدام 16 ساعة الحضانة.
  2. RNA التضخيم
    1. إعداد POLY-A RNA ارتفاع في حل سيطرة على التخفيف التسلسلي للبولي-A RNA المالية مع بولي-A تحكم التخفيف المخزن المؤقت:
      1. للتخفيف 1، وإعداد 2 ميكرولتر بوليا الأسهم السيطرة في 36 العازلة تخفيف ميكرولتر.
      2. للتخفيف 2، وإعداد 2 ميكرولتر من التخفيف 1 في 98 ميكرولتر من العازلة التخفيف.
      3. للتخفيف 3، 4 إعداد ميكرولتر من التخفيف 2 في 196 ميكرولتر من العازلة التخفيف.
      4. للتخفيف 4، وإعداد 20 ميكرولتر من التخفيف 3 في 180 ميكرولتر من العازلة التخفيف.
    2. تمييع RNA في ريبونوكلياز المياه مجانا للحصول على تركيز 33.3 نانوغرام / ميكرولتر.
    3. إضافة 2 ميكرولتر من الحل السيطرة بوليا إلى 3 ميكرولتر من إجمالي عينة الحمض النووي الريبي مباشرة في 96 لوحة جيدا. يتم تنفيذ هذه الخطوة من قبل نظام مناولة السائل.
    4. إعداد نظام مناولة السائل والتوليف الهدف. وضع لوحات على الروبوت. ضع كل الكواشف المطلوبة ومعدات المختبرات على سطح السفينة. الروبوت سوف يبدأ الإجراء عن طريق إعداد المناسبهmastermixes الإلكترونية واحتضان العينات في الآلي كتلة PCR التحكم فيها عن بعد.
    5. أولا مراقبة الجودة تحقق: السيطرة على عملية التضخيم
      1. إذا كانت نوعية آرنا مقبولة، نفذ الخطوة تجزئة بإضافة إلى كل عينة 8 ميكرولتر من تجزئة 5X عازلة (يتم تنفيذ هذه الخطوة من قبل نظام مناولة السائل). خلاف ذلك، نفذ الخطوة السابقة مرة أخرى بدءا من الحمض النووي الريبي. استخدام مجزأة آرنا على الفور أو تخزين غير مخفف ومجزأة آرنا في -20 درجة مئوية (-70 درجة مئوية أو للتخزين على المدى الطويل).
      2. إجراء تحليل مراقبة الجودة الثاني عن طريق التقاط عشوائيا 12 عينة في لوحة ونقل 1 ميكرولتر على نظام قائم على microfluidics هلام للتحقق من كفاءة تجزئة.
  3. إجراء التهجين
    1. مسح الباركود رقاقة وتسجيل كل عينة في برنامج الشركة المصنعة وفقا للتعليمات.
    2. تحضير مزيج التهجين كمايلي لرد فعل واحد وإضافته إلى 33 ميكرولتر من آرنا مجزأة والمسمى: 4.2 ميكرولتر من السيطرة قليل النوكليوتيد B2 (3nM)، 12.5 ميكرولتر من 20x والضوابط التهجين حقيقية النواة، 25 ميكرولتر من 100٪ DMSO، 125 ميكرولتر من العازلة 2X التهجين و 50 ميكرولتر من H 2 O عن الحجم النهائي من 216.7 ميكرولتر
      ملاحظة: هجن، وغسل ومسح الضوابط الإيجابية والسلبية قبل معالجة العينات.
    3. قبل الرطب مجموعة مع 200 ميكرولتر من مزيج ما قبل التهجين الواردة في عدة التهجين غسل وصمة عار.
    4. وضع رقاقة في التهجين وضع الفرن على 45 درجة مئوية و 60 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة.
    5. في غضون ذلك، تفسد لوحة (التي تحتوي على النهائي كوكتيل مزيج التهجين) في كتلة PCR في 99 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. إزالة هذا المزيج ما قبل التهجين من مجموعة واستبدالها مع 200 ميكرولتر من هدف التهجين كوكتيل (عينة واحدة لكل شريحة).
    7. وضع مجموعة في hybridization وضع الفرن على 45 درجة مئوية لمدة 16 ساعة (O / N) مع سرعة دوران 60 RPM.
  4. الغسيل وتلطيخ
    1. تشغيل "FLUIDICS" من شريط القوائم البرمجيات. في مربع الحوار FLUIDICS، حدد وحدة في المصالح (1 - 4)، ثم حدد البرنامج Prime_450 لجميع الوحدات. وضع أنابيب لغسل العازلة (أ) في زجاجة (400 مل)، وللغسل B الاحتياطي في زجاجة (200 مل)، وكذلك لmilliQ المياه في زجاجة (500 مل).
    2. وفي وقت لاحق، اتبع الإرشادات شاشة LCD. رفع الإبر ووضع 600 ميكرولتر وصمة عار كوكتيل 1 (SAPE الحل ميكس) و 600 ميكرولتر وصمة عار كوكتيل 2 (الضد الحل ميكس) التي تحتوي على أنابيب microcentrifuge في مناصب رقم 1 ورقم 2، و 900 ميكرولتر عقد صفيف حل العازلة في موقف # 3.
    3. بعد O / N الحضانة في الفرن، ونضح كوكتيل من رقاقة وملء ميكروأري مع 250 ميكرولتر غسل العازلة A. تعيين رقاقة المناسب لكل وحدة، حدد البروتوكول FS450-001 وتشغيل كل مومصح، بعد التعليمات التي تظهر على الشاشة. هذه العملية تستغرق 90 دقيقة.
    4. مرة واحدة تدل على شاشة LCD رسالة "إخراج خرطوشة"، وإزالة رقاقة وتفقد إذا كان هناك أي فقاعات. إذا فقاعات موجودة، وملء مجموعة تماما مع صفيف عقد العازلة. تطبيق ملصقات على الحاجز لتفادي أي تسرب في الماسح الضوئي وتنظيف نافذة ميكروأري قبل التحميل في الماسح الضوئي.
  5. المسح الضوئي.
    1. الاحماء الماسح الضوئي. تحميل رقاقة في الملقم الآلي من الماسح الضوئي وبدء المسح الضوئي.
      ملاحظة: بعد ~ 12 دقيقة لكل رقاقة، يتم إنشاء ملف .CEL في رقاقة.
    2. التحقق من الصورة ومحاذاة الشبكة (إذا لزم الأمر) الى مكان الحادث لتحديد الخلايا التحقيق.
      ملاحظة: وقد قدم مجموعة البيانات إلى Arrayexpress (رمز الانضمام = E-MTAB-1721).

8. النظم القائمة على شبكة تحليل الأحياء لتقييم الأثر

  1. معالجة البيانات ميكروأري.
    ملاحظة: تكنولوجيا المعلومات لتم تنفيذ طرق التهديف د باستخدام إصدار بيئة الإحصائية R 2.14.
    1. فتح جلسة R 18 وتحميل affy 19، gcrma، وحزم affyPLM تثبيتها بواسطة تشغيل الأوامر: مكتبة (affy)> مكتبة (gcrma)> مكتبة (affyPLM)
    2. قراءة ملفات البيانات الخام تشغيل الأمر: data.affybatch <-ReadAffy ("المسار إلى المجلد حيث يتم تخزين الملفات CEL")
    3. Substract تصحيح الخلفية والمعلمين quantile لتوليد مجموعة التحقيق القيم التعبير باستخدام حزمة gcrma، عن طريق تشغيل الأمر: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. مراقبة الجودة.
    1. توليد المؤامرات تدهور RNA مع الأمر: درجة <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. استخراج معامل المنحدر تدهور RNA تشغيل الأمر: منحدر = درجة $ المنحدر
    3. مؤامرة معامل الانحدار وتحديد القيم المتطرفة الممكنة.
    4. توليد n استخدم وRLE المؤامرات تشغيل الأوامر التالية: PSET <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (PSET)> n استخدم (PSET).
    5. تحديد ما إذا كانت بعض boxplots ولدت والقيم المتطرفة: تعتبر مجموعة ناشز إذا 2 على الأقل من مقاييس QC 3 موضح أدناه تحيد من المصفوفات الأخرى:
      - درجة $ المنحدر هو يختلف عن درجة متوسط ​​$ المنحدر
      - n استخدم مؤامرة: تعتبر مجموعة ناشز إذا انخفض الربع العلوي أدناه 0.95 أو أقل الربع فوق 1.05، أي إذا كان boxplot هي تماما فوق 1.05 أو كليا دون 0.95.
      - RLE مؤامرة: تعتبر مجموعة ناشز إذا كان متوسط ​​توزيع RLE أكبر من 0.1 أو أصغر من -0.1.
    6. إذا تم التعرف على مجموعة كما عزلاء، ثم تجاهل، والبدء من جديد من الخطوة 8.1.2.
    7. تناسب نموذج الخطي العام للبيانات للتناقضات محددة من الفائدة (أي.، ومقارنات بين "المعالجة" والظروف "السيطرة") توليد القيم P الخام لكل مسبار تعيين على ميكروأري، التي يمكن أن تكون furtلها تعديلها باستخدام الإجراء Benjamini-هوشبرج من حزمة Limma. اختر probeset في الجينات للحفاظ على كممثل لجين لإجراء المزيد من التحليلات كما هو موضح في 20.
      ملاحظة: تم احتساب عامل عرقلة (لوحة التعرض) من تصميم التجربة في نموذج لمعالجة البيانات.
  3. التحليل القائم على الشبكة.
    ملاحظة: يتم وصف هذه الطريقة كما نفذت هنا بالتفصيل في مارتن وآخرون. (في المراجعة في المعلوماتية الحيوية BMC).
    1. لكل مقارنة البشرى من الفائدة، تبدأ من حسابها (log2-) أضعاف التغييرات (العلاج مقابل السيطرة) لكل جينة تحت شبكة (من الخطوة 8.2).
    2. حساب قعت مصفوفة Laplacian L من شبكة محددة من قبل L (ط، ي) = - علامة (ط ~ ي) ث (ط، ي) في حالة وجود حافة الوزن ث (ط، ي) بين العقدة i و j، L (ط، ي) = درجة (ط) هو درجة المرجح لi و L (ط، ي) = 0 آخر. الوزن ث (ط، ي) تساوي 1 إذا i و j هي في العمود الفقري وث (ط، ي) = 1 / ن اذا كنت غير عقدة العمود الفقري وي هو واحد من ن neighb لهاالأملاح في طبقة النص.
    3. حساب درجات العمود الفقري التي كتبها f = L3-1L2Tx حيث L3 هو مصفوفة فرعية من L إلى العقد العمود الفقري وL2 هو مصفوفة فرعية من L التي تتوافق مع العقد طبقة النسخي والعمود إلى العقد العمود الفقري الصفوف
    4. حساب قعت Laplacian، Q، شبكة محددة من قبل الشبكة العمود الفقري حيث يتم عكس كل الدلائل الحافة.
    5. حساب النتيجة NPA التي كتبها NPA = fTQf.
    6. حساب فترة الثقة، العمود الفقري حافة التقليب ف قيمة ونسخة طبقة التقليب ف القيمة.
      ملاحظة: (. على سبيل المثال، والاختلاف البيولوجي بين العينات في المجموعة التجريبية) وبالإضافة إلى فترات الثقة من عشرات NPA، والتي تمثل الخطأ التجريبي، وقد استمدت إحصاءات رفيق لوصف خصوصية النتيجة NPA إلى الأحياء وصفه في الشبكة. لأن NPA هو شكل من الدرجة الثانية من التغييرات أضعاف، التباين لها يمكن حسابها على أساس أضعاف التغير المتوقع ضدariances. مشتق فاصل ثقة في وقت لاحق باستخدام نظرية النهاية المركزية. نفذت اختبارين التقليب 21 حيث لأول مرة، ليقيم إذا كانت النتائج محددة للأدلة الأساسي (أي.، الجينات أضعاف تغييرات) في النموذج، مما يؤدي إلى التقليب P ذات القيمة (الرمز بواسطة * O في الأرقام عندما P -value <0.05). ثانيا، لتقييم ما إذا كانت طبقة "قضية والنتيجة" شبكة ساهمت بشكل كبير في اتساع اضطراب شبكة (الرمز بواسطة K * في الأرقام عندما P-قيمة <0.05).
    7. النظر في شبكة كما تتأثر علاج إذا كان فاصل الثقة لا يحتوي الصفر واثنين التقليب ف القيم <0.05.
    8. حساب العقد الرائدة التي تعرف بأنها العقد الرئيسية في العمود الفقري المساهمة تصل إلى 80٪ من النتيجة NPA.

النتائج

في نتائج المبينة أدناه، وكانت الأنسجة عضوي النمط الخلايا الظهارية الإنسان الأساسية معزولة عن صحي وعدم التدخين، والجهات المانحة القوقازية وكان يعاد تشكيلها باستخدام الخلايا الليفية 15.

3D الشعب الهوائية ونماذج الأنسجة الأنفية
في الشعب الهوائية في المختبر ونماذج عضوي النمط الأنف تشبه على المستوى الخلوي والجهاز التنفسي ظهارة الإنسان (الشكل 2).

التعرض CS
الشعب الهوائية عضوي ونماذج الأنسجة الأنفية يمكن أن يتعرض مرارا وتكرارا لتعميم CS في واجهة الهواء السائل. وصفت الإجراء التجريبي التعرض لدخان المستخدمة في النتائج يتضح هنا في الشكل 1.

تسجيل الهدبية الضرب
وسجلت أهداب الضرب في الأنسجة المعرضة للهواء كما هو موضح في الفيديو. وارتبط التعرض CS مع انخفاض وتيرة الهدبية الضرب: ذروة أقوى لوحظ حولولم يلاحظ 4 هرتز في الشام المكشوفة وقبل التعرض لفترة أطول بعد التعرض CS (الشكل 3). وهذا من شأنه خفض سرعة جعل أهداب الضرب أقل كفاءة لإزالة المخاط والعوامل المعدية (22).

قياس طير وCYP1A1 / النشاط 1B1
وقد تم قياس طير 48 ساعة بعد التعرض الماضي لضمان الأنسجة لا تزال الوظيفية. تم قياس CYP1A1 / 1B1 النشاط أيضا 48 ساعة بعد نهاية التعرض كما هو موضح في الشكل رقم 1. وكانت القيم طير في الأنسجة CS تتعرض-لا تختلف كثيرا بالمقارنة مع الأنسجة المعرضة للهواء مؤكدا أنه لا يوجد أي تأثير السامة للخلايا كبير من الدخان في هذا التركيز. في 48 ساعة بعد التعرض، CYP1A1 / 1B1 نشاط الأنسجة وزادت قليلا، مما يشير إلى زيادة متواضعة من آلية الدفاع الأنسجة بعد التعرض (الشكل 4).

ملامح التعبير الجيني والنظم القائمة على شبكة ثنائية نهج ology لدراسة تأثير التعرض CS على تغيير الأيض أجنبي بيولوجيا
تم جمع الأنسجة في 48 ساعة نقاط الوقت بعد التعرض لل. وفي وقت لاحق، تم إجراء تحليل ميكروأري لتوليد ملامح التعبير الجيني للCS- والأنسجة المعرضة للهواء. تم التحقيق تأثير التعرض CS على عملية التمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا باستخدام نهج بيولوجيا النظم القائمة على شبكة الاستدانة من ملامح الجينات التعبير وكما ذكرت في وقت سابق 15. باستخدام نهج بيولوجيا النظم القائمة على شبكة يدل على أن آثار التعرض CS على مستوى العقد العمود الفقري في نموذج الشبكة الأيض أجنبي بيولوجيا كانت مرتبطة بشكل رائع بين في التجارب المختبرية ومجموعات البيانات الجسم الحي (الشكل 5). في المقابل، على مستوى كل فرد التغييرات الجينات التعبير، لوحظت الارتباطات الفقيرة بين في المختبر (CS-تتعرض مقابل المعرضة للهواء) والحية (المدخنين مقابل غير المدخنين).

r.within صفحة = "دائما"> figure-results-1
الشكل 1. إجراء تخطيطي من التعرض المتكرر للCS إلى نماذج الأنسجة الشعب الهوائية عضوي النمط المختصرات:. CYP، السيتوكروم P450s. CS، ودخان السجائر. طير، المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة.

figure-results-2
الشكل 2. عضوي الشعب الهوائية والأنف نماذج زراعة الأنسجة الظهارية. الكرتون توضح الشعب الهوائية (A)، والأنف (ب) زراعة الأنسجة إدراج في واجهة الهواء السائل. نماذج في المختبر الواردة الخلايا المهدبة هو مبين في طبقة قمية من الهيماتوكسيلين ويوزين الخلايا الملون (C للالشعب الهوائية، D لالأنف) كما ذكرت سابقا 15. وكان نماذج مثقف بالاشتراك مع الخلايا الليفية التي تعتبر مهمة لنمو وتمايز الخلايا الظهارية (المشار إليها السهام). تلطيخ علامات النسب مجرى الهواء: P63 (E للالشعب الهوائية، F عن طريق الأنف) وMuc5AC (G للالشعب الهوائية، H لالأنف) وترد كما ذكرت سابقا 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
تم قياس الشكل 3. سيليا الضرب التردد. سيليا تردد الضرب (البرازيلي) في المعرضة للهواء وثقافة قبل وبعد التعرض. انخفضت كان ينظر الاتحاد البرازيلي بعد التعرض CS (وتظهر نتائج تمثيلية من اثنين إدراج كما تكرار 1 (R1) وتكرار 2 (R2)).

إعلان / 52325 / 52325fig4.jpg "/>
الشكل 4. قياس CYP1A1 / النشاط CYP1B1 وتير. بانيلس اليسار تشير إلى النشاط CYP1A1 / CYP1B1 في الشعب الهوائية (A)، والأنف (B) نماذج الأنسجة. لوحات اليمين تشير إلى قياس طير في الشعب الهوائية (C)، والأنف (D) نماذج الأنسجة. وأظهرت وسائل ± SD. الاختصارات: CS، ودخان السجائر. CYP، السيتوكروم P450. طير، المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة. RLU، وحدة luminescense النسبية.

figure-results-4
واستخدمت الشكل النظم القائمة على شبكة 5. نهج الأحياء لتقييم تأثير CS التعرض في سياق عملية الأيض أجنبي بيولوجيا، والتغيرات في مستويات التعبير الجيني لحساب تفعيل العقدة العمود الفقري للنموذج الشبكة أجنبي بيولوجيا الأيض (A) قوية> كما ورد في منشور السابق 15. ويوضح الشكل على اليمين مفهوم الكمي من العقد العمود الفقري، والمعروف أيضا باسم "قيمة العمود الفقري شبكة التفاضلي،" باستخدام نهج NPA. والأشكال البيضاوية الزرقاء تمثل النشاط من العقد العمود الفقري (أي.، وطبقة وظيفية) والكرات الخضراء تمثل التعبير عن الجينات (أي.، وطبقة النسخي). آثار التعرض CS في أنسجة الشعب الهوائية عضوي النمط (في المختبر، CS-تتعرض مقابل المعرضة للهواء) وتمت مقارنة في ح 48 من تال للتعرض لتلك التدخين على الشعب الهوائية الظهارية البشرية التي جمعتها القصبات والأنف الظهارية التي كتبها burshing على المحارة أدنى (GSE16008 ) (في الجسم الحي، مقابل المدخنين غير المدخنين) (B). إدراجات، والارتباط من التعبير الجيني يتغير بين في التجارب المختبرية ومجموعات البيانات الجسم الحي. الاختصارات: CS، ودخان السجائر. NPA، شبكة اضطراب السعة.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

هنا، لقد أثبتنا مدى انطباق الشعب الهوائية عضوي النمط البشري ونماذج الأنسجة الأنفية لتقييم تأثير التعرض المتكرر CS. كبديل لالتجارب على الحيوانات، تم تطوير عدد من النظم التعرض لتقييم السمية من التعرض الهباء الجوي في المختبر (على سبيل المثال، Vitrocell، Cultex، أليس، وما إلى ذلك). يمكن أيضا أن تستخدم هذه الوحدات التعرض لتقييم سمية الملوثات المحمولة جوا، والجسيمات المحمولة جوا، والجسيمات النانوية، وما إلى ذلك وفي هذه الدراسة، استخدمنا نظام Vitrocell التي يمكن أن تستوعب ما يصل إلى 48 عينات مختلفة في وقت واحد، مما يتيح للتجارب على نطاق أوسع وانخفاض التباين بين العلاجات. لكل التعرض الهباء الجوي في المختبر، وخطر التلوث زراعة الأنسجة يبقى خطرا كبيرا الذي يتطلب معالجة دقيقة من مزارع الأنسجة في جميع أنحاء التجارب التخفيف.

قياس ترسب الجسيمات في الوقت الحقيقي على توازن دقيق خلال البريدالتجربة xposure تسمح لمراقبة أن جرعات CS المتولدة من نظام التعرض هي مطابقة للتوقعات. لضمان دقة من ترسب الجسيمات قياس و الضبط لقياس عبر الإنترنت بشكل صحيح قبل التعرض غير critial، على سبيل المثال، ووضع مقياس ل0. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الاختلاف بين المناطق في توازن دقيق (سم 2) و إدراج زراعة الأنسجة (0.33 سم 2)، ونحن تعديل الحساب النهائي إلى منطقة إدراج الثقافة: 33٪ فقط من ترسب على توازن دقيق تعكس ترسب الفعلي في إدراج الثقافة.

قياس طير للتأكد من وظيفة حاجز ضيق تقاطع وتقييم اختلال طبقة الطلائية هو إجراء سهل نسبيا لتنفيذ، والتي نشرنا عنها هنا. ومع ذلك، لأن الشعب الهوائية والأنف نماذج الأنسجة تحتوي على خلايا كأس يتخلل المنتجة للمخاط، يحتاج غسل قمي التي يتعين القيام بها قبل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف طيرurement. غسل قمي أمر بالغ الأهمية لأن وجود طبقة المخاط وتباين لها سمك يمكن التحيز قياس طير، interferring مع تأثير التعرض CS. هذه الفكرة هي في الاتفاق مع ما جاء عن Hilgendorf والزملاء، والتي تأثرت نفاذية كاتشو-2 خلايا من الرئيسين زراعة مع خط الخلية القدح المنتجة للمخاط HT29 23. يحتاج المخاط ليتم غسلها قبل قياس طير، لأن غسل قمي الحق قبل التعرض قد تتداخل مع ردود الأنسجة لCS. لذلك، يتم إجراء قياس قبل ثلاثة أيام من التعرض، وليس صحيحا قبل التعرض.

نحن أظهرت أن النشاط CYP1A1 / CYP1B1 يمكن قياسها من نماذج ثقافة عضوي النمط بعد التعرض CS على الرغم من أن النشاط تم زيادة متواضعة فقط من قبل CS. هذه إشارة ضعيفة يمكن تضخيمها من قبل حضانة أطول من الركيزة CYP1A1 / 1B1 (أي.، وسيفيرين-CEE)، على سبيل المثال ل24 ساعة (لا تظهر البيانات). واحدة من القيود المفروضة على قياس النشاط CYP في العمل الحالي هو غياب التطبيع إلى مستوى البروتين CYP أو إلى عدد خلايا، والتي يمكن أن تؤخذ بعين الاعتبار للدراسات المستقبلية للتأكد من أن تغيير على نشاط الإنزيم لا يتأثر قبل تغيير أي من مستوى البروتين أو عدد خلايا.

أبلغنا أن التعرض CS تحول دون الهدبية الضرب في كل من الأنف ونماذج الأنسجة الشعب الهوائية. وقد أجريت ملاحظات مماثلة في نماذج الثدييات وغير الثدييات متنوعة 12. لالهدبية الضرب القياس، وضمان أن يتم التعامل مع الأنسجة ويعامل بطريقة مماثلة أمر بالغ الأهمية، على سبيل المثال إذا تم تنفيذها تغيير المتوسطة، فإنه ينبغي تطبيق لجميع العينات. ذكرت Sutto وزملاؤه أن الرقم الهيدروجيني أثرت على الهدبية الثدييات الضرب تردد 24. وهكذا، عند المقارنة بين الضرب الترددات بين الخلايا المعالجة مع مختلف على compunds / مخاليط، ودرجة الحموضةوينبغي النظر في تعديل للحد من تقلب القياس الهدبية الضرب. وعلاوة على ذلك، فإن درجة الحرارة التي يجري القياس أمر بالغ الأهمية أيضا كما تردد من الهدبية الضرب قطرات مع تناقص درجات الحرارة. للحد من تقلب الواجب لهذه التغييرات، حاضنة مرحلة أعلى، مجهزة درجة الحرارة، CO 2، ومراقبة الرطوبة واستخدمت في هذه الدراسة. على الرغم من هذا، لاحظنا أن الهدبية الضرب الترددات في أنسجة الشعب الهوائية بعد التعرض CS كان متغير بدرجة كبيرة (أي، زيادة في إدراج واحد وخفض في إدراج أخرى)، مما يوحي بأن الضرب الهدبي هو الحق مضطرب للغاية بعد التعرض. في المقابل، لاحظنا غياب قابلة للقياس الترددات الهدبية الضرب في أنسجة الأنف بعد التعرض CS، مما يشير إلى أن الاستجابة للأنسجة الأنف هي أكثر حساسية ومتسقة. ويتفق ذلك مع نشر السابق تبين أن الأنسجة الأنفية لديها قدرة أقل على إزالة السموم كمامقارنة مع القصبات الهوائية 25.

وأخيرا، فإننا أظهرت أن التعبير الجيني التنميط من الشعب الهوائية عضوي النمط ونماذج الأنسجة الأنفية تتعرض لCS يمكن أن تثبت لها تأثير على التمثيل الغذائي للCS أجنبي بيولوجيا. ومن المثير للاهتمام، وتغيير لوحظ في التمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا في الشعب الهوائية والأنف عضوي النمط في نماذج المختبر تتعرض لCS أن تشبه الوضع في الجسم الحي في المدخنين كما تمت مناقشته بمزيد من التفصيل في منشور السابق 15. ليحلل التعبير الجيني، وذلك باستخدام أداة الروبوتية يجعل تحليل الإنتاجية العالية ممكن. وعلاوة على ذلك، ويزيد من معالجة الروبوتية التلقائي مزيد من الاتساق ودقة النتائج التعبير الجيني. ومع ذلك، كان جمع سريع من عينات الأنسجة حاسم لتجنب تدهور RNA خلال استخراج الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا معالجة RNA والنهج transcriptomic الموصوفة هنا يتم تطبيقها على عينات الأنسجة في الجسم الحي.

الإفصاحات

وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل فيليب موريس الدولية.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر موريس سميث ومارجا Talikka لاستعراضها من المخطوطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MucilAir- الخلايا الليفية البشرية-الشعب الهوائيةEpithelix S & aacute ؛ rl ، جنيف ، سويسراhttp://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture MediumEpithelix S & aacute ؛ rl ، جنيف ، سويسراhttp://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELLVITROCELL systems GmbH ، Waldkirch ، ألمانياhttp://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R =
3R4F السجائر المرجعيةجامعة كنتاكيhttp://www2.ca.uky.edu/refcig/
تدخين دائري 30 منفذا SM2000Philip Morris ، Int.
كاميرا وبرامج CiliaMetrixLa Haute & Eacute; cole de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland
Leica DMIL microscope Leica, Heerbrugg, سويسرا
مصدر ضوء LEDTitan أداة مستلزمات, الجاموس ، نيويورك
Chopstick Electrode STX-2World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter أدوات الدقة العالميةhttp://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
كاشف الكشف عن لوسيفيرين  
أداة MagNA Lyser  روشhttp://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
الكلوروفورم سيجما ألدريتشhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=
QIAcube Qiagen9001882
NanoDropThermo Scientifichttp://www.nanodrop.com/
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilenthttp://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip إنتاجية عالية 3 ' IVT Express KitAffymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G Affymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G
آلة

المراجع

  1. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).
  3. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).
  4. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).
  5. Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicolog. 244, 66-76 (2008).
  6. Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).
  7. Cho, M. -H., et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).
  8. Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research. Journal of Allerg. 2012, 11(2012).
  9. Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazi. , 19-24 (2010).
  10. Chhin, B., et al. Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy. PLoS genetic. 5, e1000422(2009).
  11. Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro. Front Me. 7, 486-491 (2013).
  12. Talbot, P. In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents. Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).
  13. Port, J. L., et al. Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract. Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).
  14. Hoeng, J., et al. A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances. Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).
  15. Iskandar, A. R., et al. Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues. Biomed Res In. 2013, 512086(2013).
  16. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).
  17. ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing. , International Organization for Standardization. (1999).
  18. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , The R Core Team. (2011).
  19. Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips. BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).
  20. Hermida, L., et al. Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data. BMC genomic. 14, 514(2013).
  21. Thomson, T. M., et al. Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models. Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).
  22. Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke. Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).
  23. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).
  24. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).
  25. Zhang, X., et al. Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium. Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة الأنسجة ثلاثية الأبعاد ذات التنظيم العضويالواجهة الهوائية السائلةالتعرض لدخان السجائرتردد ضربات الأهدابنشاط سيتوكروم P450تقنية المصفوفات الدقيقةبيولوجيا الأنظمة القائمة على الشبكاتنماذج القصبات والأنفنظام التعرض في المختبر
تقييم تأثير التعرض المتكرر من عضوي النمط 3D الشعبي والأنف زراعة الأنسجة نماذج لكامل دخان السجائر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.