يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ككل نهج Bioreporter خلية لتقييم النقل والتوافر الحيوي للملوثات العضوية في أنظمة غير المشبعة المياه

10.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52334

⸱

ديسمبر 24, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ, 2Department of River Ecology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

في هذه المقالة

ملخص

ووضعت كله فحص bioreporter زنزانة مع بوركهولدريا sartisoli RP037-mChe للكشف عن الكسور من الملوثات العضوية (أي fluorene) المتاحة للتدهور البكتيري بعد النقل النشط من قبل فطر سد المسام المليئة الهواء في نظام نموذجي غير المشبعة بالمياه.

الملخص

التوافر البيولوجي للملوثات هو شرط أساسي للتحلل البيولوجي الفعال في التربة. غير أن متوسط تركيز الملوثات ليس مقياسا مناسبا لتوافرها؛ يعتمد التوافر البيولوجي بدلا من ذلك على التفاعل الديناميكي لنقل الكتلة المحتمل (التدفق) للمركب إلى خلية ميكروبية وقدرة الأخير على تحلل المركب. في الأجزاء غير المشبعة بالماء من التربة ، ثبت أن الفطريات تتغلب على قيود التوافر البيولوجي عن طريق نقل وتعبئة المركبات العضوية بنشاط على مدى السنتيمترات. في حين أن مدى الانتقال القائم على الفطريات يمكن قياسه بسهولة بالوسائل الكيميائية ، فإن التحقق من التوافر البيولوجي للملوثات للخلايا البكتيرية يتطلب طريقة بيولوجية. لمعالجة هذا القيد ، اخترنا فلورين PAH (FLU) كمركب نموذجي وقمنا بتطوير نموذج مصغر غير مشبع بالماء يربط مصدر نقطة الإنفلونزا المنفصل مكانيا وبكتيريا المراسل الحيوي المهينة للإنفلونزا Burkholderia sartisoli RP037-mChe بواسطة شبكة فطرية من Pythium ultimum. نظرا لأن المراسل الحيوي يعبر عن eGFP استجابة لتدفق الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات للخلية ، يمكن مراقبة التعرض للأنفلونزا البكتيرية وتدهورها مباشرة في العوالم المصغرة عبر الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (CLSM). كشفت تحليلات CLSM والصور عن زيادة كبيرة في تعبير eGFP في وجود P. ultimum مقارنة بالضوابط التي لا تحتوي على فطريات أو إنفلونزا مما يشير إلى التوافر البيولوجي للإنفلونزا للبكتيريا بعد الانتقال بوساطة الفطريات. تم دعم نتائج CLSM من خلال التحليلات الكيميائية في عوالم مصغرة متطابقة. أثبت العالم المصغر المطور أنه مناسب للتحقيق في التوافر البيولوجي للملوثات وتصور التفاعلات بين البكتيريا والفطريات المتزامنة.

المقدمة

وذات الكثافة السكانية العالية التربة عن طريق مجموعة واسعة من الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا 1،2. لكن الأوضاع في هذه الموائل تشكل تحديا، ولا سيما من حيث توافر المياه 3. البكتيريا تحتاج بشكل دائم للبحث عن الظروف المثلى في البيئات غير المتجانسة 4، ولكن عدم وجود أفلام المياه مستمرة يسفر عن التنقل محدود 5 تعوق لهم لنشر بحرية. أيضا، يتم خفض معدلات انتشار المواد المذابة (على سبيل المثال، والمغذيات) في ظل ظروف غير المشبعة 6. وهكذا، والبكتيريا والمواد المغذية وغالبا ما يفصل جسديا وسهولة الوصول إليها المغذيات يقتصر 3. ونتيجة لذلك، يمكن لناقلات النقل للمركبات الكيميائية التي لا تتطلب المرحلة المياه مستمرة تساعد على التغلب على هذه القيود. في الواقع، قد وضعت العديد من الكائنات الدقيقة مثل الفطريات والفطريات البيضية شكل النمو الخيطية تمكينهم من النمو من خلال مساحات مليئة بالهواء المسام وبالتالي الوصول إلى وموبيLIZING أيضا المادية فصل المواد المغذية 7 و 8 المواد الكربونية لمسافات طويلة. حتى أنها قد تكون بمثابة موجهات النقل البيولوجية التي توفر السكريات ومصادر الطاقة الأخرى للبكتيريا 9. وقد تبين أيضا امتصاص والنقل في الكائنات أفطوري للملوثات العضوية مسعور مثل الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAH) في Pythium ultimum 10 أو في الفطريات مايكورهيزال arbuscular 11. منذ PAH هي الملوثات في كل مكان وسيئة للذوبان في الماء 12 في التربة، والنقل بوساطة فطر قد يساعد على زيادة التوافر البيولوجي الملوثات البكتيرية للdegraders المحتملة. في حين أن المبلغ الإجمالي للنقل الملوثات يمكن قياسها كميا مباشرة الكيميائية يعني 10، التوافر البيولوجي للملوثات نقلها بواسطة فطر المهينة البكتيريا وغيرها من الكائنات لا يمكن تقييمها بسهولة.

يعرض بروتوكول التالية طريقة لتقييم أثر myceليا على التوافر البيولوجي الملوثات إلى degraders البكتيرية بطريقة مباشرة. لأنها تتيح جمع المعلومات عن تأثير الزماني المكاني من الملوثات الميكروبية على النظم الإيكولوجية. نحن تصف كيفية إنشاء نظام مصغر غير المشبعة تفصيلا محاكاة واجهات بين الهواء والماء في التربة عن طريق ربط مصدر نقطة PAH فصل جسديا مع bioreporter البكتيريا PAH المهينة عبر ناقلات النقل أفطوري. لأنه يتم استبعاد النقل الجوي، وتأثير النقل على أساس أفطوري على الهيئة العامة للإسكان التوافر الحيوي للبكتيريا يمكن دراستها بطريقة معزولة. في مزيد من التفاصيل، تم تطبيق ثلاثة عصابة PAH fluorene، الكائن فطر Pythium ultimum وbioreporter بكتيريا بوركهولدريا sartisoli RP037-mChe 13 في الاجهزة مصغرة وصفها. بكتيريا B. شيد sartisoli RP037-mChe أصلا لدراسة تدفقات فينانثرين إلى الخلية 14 وتعرب عن تعزيز الأخضر البروتين الفلوري (EGFP) نتيجة لتدفق الهيئة العامة للإسكان لالخلية، في حين أن الاستشعاع الأحمر يتم التعبير عن mCherry جوهري. وترد معلومات مفصلة عن بناء مراسل كتبها TECON وآخرون 13 في الاختبارات الأولية، وكشف البكتيريا لا السباحة وفقط بطيئة للغاية القدرة يحتشدون. كان قادرا على الهجرة ببطء على خيوط من Pythium ultimum عند تطبيقه كما وقف كثيفة على الجزء العلوي من خيوط. منذ جزءا لا يتجزأ من البكتيريا في الاغاروز في البروتوكول التالي، لم الهجرة على خيوط لا يحدث.

باستخدام متحد البؤر المجهري المسح الضوئي ليزر (CLSM)، والبكتيريا bioreporter يمكن تصور مباشرة في عوالم مصغرة والتعبير عن EGFP يمكن قياسها كميا بالنسبة لكمية من الخلايا (متناسبة مع إشارة mCherry) مع مساعدة من يماغيج البرمجيات. وهذا يسمح بمقارنة التوافر البيولوجي نوعيا في سيناريوهات مختلفة (أي أعلى أو أقل). تم العثور على FLU أن يكون بيولوجيا بعد نقل فطر من قبل P. ultimum (أي أنهكان أعلى مما كانت عليه في المراقبة السلبية). وعلاوة على ذلك، يصف بروتوكول كيفية تحديد المبلغ الإجمالي النقل بوساطة فطر عبر الوسائل الكيميائية وللتحقق من التوافر البيولوجي الملوثات باستخدام الألياف الزجاجية المغلفة السيليكون (الألياف SPME) في عوالم مصغرة متطابقة. النتائج باستخدام هذا الإعداد مصغرا وقد نشرت ومناقشتها لمزيج من P. ultimum، fluorene وB. sartisoli RP037-mChe 15. هنا، يكمن في التركيز على وصف طريقة مفصلة وتحديد المخاطر المحتملة للبروتوكول لتوفير هذه المعرفة لتطبيقات أخرى محتملة. قد تنطوي على مزيد من التطبيقات الفطرية المختلفة والأنواع البكتيرية (على سبيل المثال، من المواقع الملوثة)، وغيرها من الملوثات (مثل مبيدات الآفات) أو الملوثات إمدادات (على سبيل المثال، والتربة الذين تتراوح أعمارهم بين).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد أطباق، والشرائح والحضانة الغرف

  1. إعداد المواد التالية لكل مصغرة: البلاستيك واحد كبير بيتري أسفل الطبق (د = 10 سم)، واحدة المعدلة (انظر الخطوة 1.2) صغير من البلاستيك بيتري أسفل الطبق (د = 5 سم) مع أغطية واحد العد غرفة الشريحة مع ثلاثة تجاويف.
  2. أخذ العدد المطلوب من بتري أجزاء أسفل الطبق (د = 5 سم). إزالة جزء من أسنانها مع منشار لتناسب بالضبط شريحة (26 ملم طول الحافة). لتعقيم النظام، نقع بيتري قيعان طبق والأغطية في الايثانول 70٪ O / N وتجفيفها لمدة 2 ساعة على الأقل في خزانة تدفق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تخزين أطباق بتري في وعاء من البلاستيك مختوم بإحكام، والتي أيضا قد تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة.
  3. مسح العدد المرغوب فيه من الشرائح مع 70٪ من الإيثانول والهواء تجفيفها. التفاف الشرائح في رقائق الألومنيوم ووضعها في الفرن دثر لمدة 5 ساعة على 450 درجة مئوية لإزالة التلوث المحتملة.
  4. إعداد غرف الزجاج الحضانة مع الأغطية. تنظيف مع 70٪ من الإيثانول وفضح غرف مفتوحة لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة على الأقل في خزانة التدفق.
    ملاحظة: desiccators كبيرة (قطرها حوالي 30 سم) مع الأغطية يمكن أن تستخدم لهذا الغرض؛ كل مجفف قد إيواء ما يصل إلى عشرة الاجهزة مصغرة.

2. إعداد وسائل الإعلام والثقافات

  1. لتشغيل 20 عوالم مصغرة بالتوازي مع ذلك، الحصول على 100 ​​مل من تعديل تريبتون-الخميرة المتوسطة (MTY) 14، وحوالي 150 مل من 21C الحد الأدنى من المتوسط ​​16 (MM)، و 5 مل من الحد الأدنى من المتوسط ​​أجار (MMA؛ 0.5٪، ث / ت)، وثلاثة لوحات أجار البطاطس سكر العنب (PDA؛ 1.5٪، ث / ت) لP. ultimum، وأربع لوحات فارغة، واحدة لوحة PDA يحتوي على 2 ملغ L -1 سيكلوهيكسيميد، وأربع لوحات الاغاروز (3٪، ​​ث / ت) التي تحتوي على 0.3 غرام مل -1 الكربون المنشط و 40 ملغ من الانفلونزا في 2 أجزاء ملغ.
  2. إعداد MTY تحتوي على 50 ملغ L -1 من الكانامايسين (كانامايسين هو اشتراطاتإد للحفاظ على EGFP مراسل البلازميد) وMM تحتوي على 10 ملي خلات للزراعة البكتيرية. استخدام MM دون خلات لإعداد 0.5٪ MMA اللازمة لتجميد البكتيريا في عوالم مصغرة وتصب لوحات (كل 20 مل) من 1.5٪ PDA لزراعة Pythium ultimum ومصغرة الاجهزة.
  3. تطعيم بعض خيوط من P. ultimum على ثلاث لوحات PDA الطازجة واحتضان في الظلام في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. ثم تأكد من أن لوحات هي متضخمة بشكل كامل من قبل أفطورة الطازجة ورقيق.
  4. بدء ثقافتين من B. sartisoli RP037-mChe في 50 مل من MTY من الأسهم الجلسرين. احتضان عند 30 درجة مئوية مع 230 دورة في الدقيقة حركة قارورة دوارة O / N.
  5. كثافة ثقافة التدبير البصرية (OD) في 578 نانومتر، وأجهزة الطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة (لB. sartisoli RP037-mChe، وOD المتوقع 578 حوالي 1.0 والخلايا هي في مرحلة الأسي). تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايافي كمية مناسبة من MM للتوصل الى OD 578 من 0.4. تطعيم 20 مل من MM تحتوي على 50 ملغ L -1 كانامايسين مع 400 ميكرولتر من الخلايا معلق. احتضان عند 30 درجة مئوية مع 230 دورة في الدقيقة حركة قارورة دوارة O / N.
  6. قياس OD 578 من ثقافة في MM (لB. sartisoli RP037-mChe، وOD المتوقع 578 حوالي 0.2 والخلايا هي في مرحلة مبكرة الأسية). ثقافة الطرد المركزي في 2،000 x ج لمدة 10 دقيقة وإعادة تعليق الخلايا في كمية مناسبة من MM للتوصل الى OD 0.4. مزيج 50 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 500 ميكرولتر من الحارة، السائل MMA في 2 مل أنابيب وتخزينها في 50 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدام 150 ميكرولتر من الخلايا في MMA لكل مصغرة.
  7. صب لوحات من agarose هلام يحتوي على الكربون المنشط. تذوب الاغاروز (3٪، ث / ت) في الماء المقطر مزدوجة. تخلط جيدا مع الكربون المنشط (0.3 مل ز -1) وتصب الخليط في البلاستيك أطباق بتري(د = 10 سم).

3. مصغر تركيب

ملاحظة: وصفت الإعداد مصغرة الكامل تخطيطي في الشكل (1) يرجى الرجوع إلى الشكل 1 لجميع الخطوات الفردية التالية. الخطوات التالية تصف إعداد عينة (SAM) مع ناقلات النقل أفطوري وثلاثة الاجهزة الرقابية المختلفة (AIR CON، CON NEG، CON POS). ملخص لجميع الاجهزة مختلفة يمكن العثور عليها في الجدول 1.

  1. خذ العدد المرغوب فيه من أطباق بتري والشرائح ويعرضهم لضوء الأشعة فوق البنفسجية في إطار مجلس الوزراء تدفق لمدة 30 دقيقة.
  2. وضع طبق صغير بيتري داخل واحدة كبيرة وتناسب الشريحة من خلال الفجوة في طبق بتري الصغيرة. أخذ عينة واحدة لتعليق الخلية الدافئ في MMA وإضافة 150 ميكرولتر في تجويف الأوسط من شريحة واحدة. كرر هذه الخطوة حتى تجاويف الأوسط من جميع الشرائحمليئة MMA. الانتظار 5 دقائق لMMA لترسيخ.
  3. استخدام 1 سم الفلين حفار لكمة من بقع دائرية من لوحة PDA فارغة. وضع التصحيح واحد على مسافة 2 مم المقبل إلى MMA داخل طبق بتري الصغيرة. هذا إضافة إلى تعزيز النمو أفطوري في الإعداد (PDA 3 في الشكل 1).
  4. قطع بقع PDA المنحنية كحواجز الميكانيكية. استخدام طبق بتري الصغيرة الجزء السفلي نظيفة ومعقمة واضغط عليه في لوحة PDA. استخدام ملعقة لخفض حلقة أخرى أصغر حجما على مسافة 0.5 سم في أجار مما يؤدي الى الدائري PDA.
    1. قطع قطعة، والذي يناسب بالضبط إلى الفجوة في طبق بيتري صغير في إعداد مصغرة ووضعه داخل فجوة في أعلى الشريحة. تأكد من أن المسافة بين MMA والجدار PDA دائري حوالي 2 مم. إغلاق غطاء طبق بيتري صغير الضغط عليه برفق في حاجز PDA.
    2. كرر الخطوات من 3.4 و 3.4.1 مع لوحة PDA تحتوي على 2 ز L -1من سيكلوهيكسيميد.
      ملاحظة: هذا هو الإعداد السيطرة للنقل الجوي (CON AIR) نحو الخلايا bioreporter، حيث يتم تحول دون فطر كتبها سيكلوهيكسيميد ولا كسا الأرض MMA.
  5. استخدام 1 سم الفلين حفار لكمة من بقع دائرية لوحة PDA فارغة. استخدام 0.5 سم الفلين حفار آخر لقطع منتصف التصحيح الأول. ضع الناتجة صغيرة PDA الدائري على مسافة 1 ملم المقبل لحاجز PDA (PDA 1 في الشكل 1).
  6. إضافة 2 ملغ من FLU في حفرة من PDA 1. استخدام 1 سم الفلين حفار لقطع بقع دائرية من لوحات PDA متضخمة مع P. ultimum ووضع التصحيح واحد (PDA 2 في الشكل 1) أسفل أسفل على عصابة PDA بحيث حصيرة أفطوري يواجه بلورات FLU.
    1. كرر الخطوة السابقة دون إضافة بلورات FLU.
      ملاحظة: هذا هو الإعداد السيطرة سلبي (CON NEG) لتحديد الخلفيةمضان من خلايا bioreporter.
  7. استخدام 1 سم الفلين حفار لكمة من بقع دائرية من أجار التي تحتوي على الكربون المنشط. وضع أربعة بقع في كل الإعداد مصغرا لمزيد من الانخفاض في تركيز FLU الغازي (الشكل 1).
  8. إعداد مراقبة إيجابية (CON POS). إضافة بعض بلورات FLU إلى 200 ميكرولتر من تعليق خلية MMA ووضعها في تجويف واحد من شريحة فارغة.
  9. وضع طبق بتري (د = 10 سم) مع بعض مسحوق الكربون المنشط على الجزء السفلي من غرفة الحضانة لتقليل تركيز FLU الغازي في الغرفة. أيضا، ضع 4-5 50 مل الأكواب بالماء المعقم على الجزء السفلي للحفاظ على الرطوبة العالية في الغرفة.
    1. نقل الاجهزة مصغرا إلى غرف حضانة واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 96 ساعة. مكان عينات بشكل عشوائي في غرف النمو المختلفة لاستبعاد آثار الموقع.
      ملاحظة: هذه المرة ا ف ب حضانةتبحر إلى P. طلائعيات بيضية ultimum. أنها قد تكون مختلفة عن غيرها من الكائنات.

4. متحد البؤر الليزر الضوئي المجهر

  1. ومن الناحية المثالية استخدام الإعداد CLSM مع المجهر تستقيم.
    ملاحظة: قد يتم تجهيزه مع الليزر التقليدية التي تقدم على سبيل المثال، 488، 561 و 633 نانومتر للخطوط الإثارة أو مع مصدر الليزر الأبيض الانضباطي.
  2. استخدام الإعدادات التالية لمجموعة من الصور: الإثارة: 490 نانومتر (EGFP) و 585 نانومتر (mCherry) في كثافة الليزر المناسبة (الإثارة في وقت واحد)؛ نطاقات الانبعاثات: 500-550 نانومتر (EGFP) و605-650 نانومتر (mCherry)؛ عدسة الهدف: 63X NA 0.9 immersible التي المياه (بسبب المسافة العمل الطويلة)؛ حجم الخطوة ض مداخن: 0.5 ميكرون.
  3. مفتوحة إعداد مصغرة واستخدام مشرط لإزالة PDA 1 و 2 و 3 و حاجز PDA. وضع زلة غطاء زجاجي على أعلى من MMA واضغط برفق لإزالة فقاعات الهواء. جبل الشريحة على خشبة المسرح المجهر. إضافة قطرات من الماء على رأس عشرالبريد زلة تغطية واستخدام إعدادات mCherry لإيجاد خلايا bioreporter في العينة.
  4. الحصول على لمحة سريعة عن العينة وتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء باستخدام توهج المفرط تحت طاولة البحث لأحمر (mCherry) والأخضر (EGFP) القناة. اختيار موقف عشوائي على عينة لتحليل bioreporter مضان.
    ملاحظة: قد تظهر خيوط تألق ذاتي في حدود الانبعاثات bioreporter (على سبيل المثال، تألق ذاتي الأخضر) 17. تأكد من تحديد المناطق دون خيوط إذا كان هذا هو الحال.
  5. تحديد وتسجيل مداخن Z-لكل منصب في المنطقة الخضراء (EGFP) والأحمر (mCherry) القناة. تجنب التبييض من العينة عن التعرض الطويل لضوء epifluorescence أو ضوء الليزر.
    1. كرر الخطوة السابقة لمدة عشر، ومواقف عشوائية موزعة بالتساوي.
  6. كرر جميع الخطوات باستخدام نفس الإعدادات لجميع العينات من مسار اختبار (SAM)، CON AIR، CON NEG وCON POS.

    7. 5. تحليل صورة

    ملاحظة: لتحليل الحمراء (mCherry) والأخضر (EGFP) مضان في أكوام-Z سجلت، من بين خيارات أخرى البرمجيات الحرة يماغيج 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) يمكن أن يكون المستخدمة.

    1. تأكد من تثبيت البرنامج المساعد logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
    2. ملف مفتوح في يماغيج. حدد "قنوات تقسيم" وقناة خضراء قريبة. استخدام الماكرو "منطقة mCherry" على النحو المنصوص عليه ملف التعليمات البرمجية التكميلي لتحديد مجال مضان أحمر في ض المكدس. ضبط الإعدادات المفضلة في الماكرو (المشار إليها بالخط العريض).
      1. الإخراج هو جدول مع بكسل محسوبة فوق عتبة (وما فوق الحد الأدنى لحجم المعرفة) في كومة Z-.
        ملاحظة: إن مجموع كل القيم هو العدد الإجمالي للبكسل الحمراء (منطقة) في المكدس.
    3. ملف مفتوح في يماغيج. حدد "قنوات تقسيم" والقناة الحمراء وثيقة. استخدام الماكرو 216؛ EGFP كثافة العمليات "على النحو المنصوص عليه ملف التعليمات البرمجية التكميلي لقياس كثافة مضان أخضر في كومة Z-. ضبط الإعدادات المفضلة في الماكرو (المشار إليها بالخط العريض).
      1. الإخراج هو جدول مع شدة متوسط ​​ومساحة كل الكائنات الخضراء فوق عتبة (وما فوق الحد الأدنى لحجم المعرفة) في ض المكدس. لحساب كثافة إجمالية قدرها بكسل الخضراء في المكدس، تتضاعف كل يعني كثافة من المنطقة المقابلة.
    4. حساب EGFP الحث النسبي (EGFP يختلط):
      figure-protocol-1 (1)
      ملاحظة: بما أن يتم التعبير عن mCherry جوهري، فإن القيمة الناتجة من EGFP يختلط هي مقياس نسبي لكمية EGFP التي أعربت عنها كمية معينة من الخلايا. يرجى الرجوع أيضا إلى الجدول رقم 3 للمزيد من المعلومات عن حساب EGFP يختلط.
    TLE "> 6. الكمي الكيميائية

    ويمكن أيضا أن تستخدم الاجهزة مصغرا لأداء الكمي الكيميائي للكميات FLU translocated مع أو بدون بالوعة الملوثات اللاأحيائي: ملاحظة.

    1. التفاف 15 قارورة مل الزجاج، 1 مل قارورة GC / MS وتدرج في رقائق الألومنيوم. ملء تبخر الأطباق مع نا 2 SO 4؛ وضع كل شيء في الفرن دثر لمدة 5 ساعة على 450 درجة مئوية لإزالة التلوث المحتملة. تخزين داخل نا 2 SO 4 من مجفف تفعيلها.
    2. قطع PDMS ألياف الزجاج المطلي إلى 0.5 سم طول. غسل الألياف عن طريق هز أربع مرات 2 ساعة في الميثانول النقي. تكرار غسل الخطوات آخر أربع مرات مع الماء عالى النقاء وتخزين الألياف نظيفة في الماء عالى النقاء في قارورة زجاجية محكمة الغلق.
    3. إعداد 1.5 L التولوين / الأسيتون (3: 1، V / V) تحتوي على 10 ميكروغرام L -1 فينانثرين-د 10.
    4. تنفيذ الخطوات 1 و 2 و 3 من البروتوكول. إعداد عوالم مصغرة من دون بيورخلايا eporter لدراسة النقل FLU (SAM (-) وCON AIR (-)) ومع الخلايا bioreporter (SAM) للتحقق من تدهور FLU.
      1. اختياري (بدون خلايا bioreporter): مكان ثلاثة PDMS المغلفة الألياف الزجاجية. (وعادة ما تستخدم للتجارب SPME) كما الاصطناعي وقابلة للقياس الملوثات داخل بالوعة MMA من SAM (-) باستخدام ملقط غرامة.
      2. إزالة الألياف الزجاجية باستخدام ملقط غرامة ونقل كل واحد إلى GC / MS قارورة مع إدراج.
      3. إضافة 200 ميكرولتر من التولوين ويهز عموديا O / N وتحليل عبر GC / MS. استخدام الإعدادات الواردة في الجدول 2.
    5. نقل MMA من تجويف الوسط في كوب 15 مل قارورة وإضافة حوالي ثلاث ملاعق من نا 2 SO 4. تخلط جيدا باستخدام ملعقة وإضافة 10 مل من المذيب. دوامة الخليط ويهز أفقيا O / N في الظلام.
      1. نقل 1001؛ لتر من العينة إلى GC / MS قارورة مع إدراج. إضافة 10 ميكرولتر من أسينافثيلين-د 08 (10 ملغ L -1) وتحليل عبر GC / MS باستخدام نفس البرنامج كما هو موضح في 6.4.3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد تم بالفعل نشر النتائج المعروضة هنا في وقت سابق 15. يرجى الرجوع إلى مقالة للنقاش الميكانيكية والبيئية التفصيلية.

بعد تسجيل صورة عبر CLSM، ويمكن إجراء الإسقاط كثافة الحد الأقصى باستخدام برنامج المجهر منها أو يماغيج للحصول على انطباع بصري الأول من نموذج والضوابط (الشكل 2). وفي وقت لاحق، قد يكون المتوقع أن مجموعات البيانات بشكل مختلف من أجل إظهار الميزات ذات مغزى من قبل البرامج التصور ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أثبتت الإعداد مصغرة عرض مناسب لدراسة التوافر البيولوجي للمواد الكيميائية فصل مكانيا للكائنات بعد امتصاص ونقل بواسطة فطر مهينة. يتم منع المحتملين النقل طور الغاز من مركبات طيارة جزئيا ويمكن تصور الخلايا البكتيرية bioreporter دون إعداد العينات تفصيلا وبالتالي مع الحد الأدنى من اضطراب في نظام حساس. في نفس الوقت، والتحليل الكيميائي للعينة يمكن أن تتم بسهولة والسماح لمراقبة جيدة من النتائج المكتسبة والكمي لنقل الكلي. ومع ذلك، بعض النقاط يجب أن تكون مدروسة بعناية قبل وأثناء تنفيذ التجرب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصلحة مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يتم الاعتراف بتمويل من مؤسسة البيئة الألمانية (DBU). يشكر المؤلفون Ute Kuhlicke على المساعدة الفنية في تحليل CLSM و Birgit Würz و Rita Remer و Jana Reichenbach للمساعدة التجريبية الماهرة. يود المؤلفون بشكل خاص أن يشكروا البروفيسور جان رويلوف فان دير مير والدكتور روبن تيكون على المناقشة المثمرة وتوفير سلالة المراسل الحيوي. يساهم في برنامج أبحاث "المواد الكيميائية في البيئة" (CITE) التابع لجمعية هيلمهولتز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المجهر متحد البؤرLeicaTCS SP5X, LAS AF - الإصدار 2.6.1; أو ما يعادلها من CLSM
GC HP 7890 Series GC و Agilent 5975C MSDAgilentيمكن استخدام GC / MS مكافئ
العمود الشعري J& W 121-5522                         Agilent
Cork حفارفيشر Scientific12863952أو أي غطاء آخر
زلاتMarienfeld107222عالية الأداء ، رقم 1.5H
GC / MS instertsWICOMWIC 47080
GC / MS قوارير 2 ملWICOMWIC 41150
أغطية / حاجز لقوارير الغطاء اللولبيDIONEX49463 / 049464 
أغطية قوارير GC / MSWICOMWIC 43948 / B
Objective SlidesMenzelعادي
PDMS الألياف الزجاجية المطليةPolymicro Technologies، Inc.V (PDMS) = 13.55   ؛ ±   0.02  ومايكرو. l  m-1< / sup>
أطباق بتري صغيرة / كبيرةGreiner633-102 / 628-102
قوارير غطاء لولبي 40 ملDIONEX48783يمكن استخدام قوارير زجاجية أخرى
قوارير غطاء لولبي 60 ملDIONEX48784يمكن استخدام قوارير زجاجية أخرى
Acenaphthylene d08< / sub>Dr. EhrenstorferC 20510100
Acetoneكارل روث9372.2
الكربون المنشطسيجما ألدريتش242276-1 كجم
أغاروزكارل روث2267.4
فلورينفلوكا46880
كبريتات كاناميسينكارل روثT832.250 مجم ل<سوب>-1< / سوب>
ميثانولكارل روثP7171
<قوي>الحد الأدنى المتوسط: < / قوي> 100 مل <قوي>محلول 1< / قوي> + 25 مل <قوي>محلول 2< / قوي> + 5 مل <قوي>الحل 3< / قوي> إعلان 1,000 مل أكوا dest
Solution 1< / strong>
كبريتات الأمونيومكارل روث3746.15 جم L-1  < / sup>
كلوريد المغنيسيوم × 6 & nbsp ؛ H2OCarl Roth2189.11 g L-1
نترات الكالسيوم × 4  H2< / sub>OCarl RothP740.10.5 g L-1< / sup>
Solution 2< / قوي >
فوسفات ثنائي الصوديومكارل روثP030.155.83 جم L-1< / sup>
فوسفات أحادي البوتاسيومكارل روث3904.120 جم L-1< / sup>
الحل 3< / قوي> (درجة الحموضة 6.0)
ثنائي الصوديوم EDTAMERCK10841802500.8 جم لتر < سوب>-1< / سوب>
كلوريد الحديد (II) × 4 & nbsp ؛ H2< / sub>OMERCK10386102500.3 جم L-1< / sup>
كلوريد الكوبالت (II) × 6 & nbsp ؛ H2< / sub>Oكارل روثT889.34 مجم L-1< / sup>
المنغنيز (II) كلوريد × 1 & nbsp ؛ H2< / sub>Oكارل روث4320.210 مجم L-1< / sup>
كبريتات النحاس (II)كارل روثP023.11 مجم L-1< / sup>
موليبدات الصوديوم × 2 & nbsp ؛ H2< / sub>Oكارل روث0274.13 مجم L-1< / sup> كلوريد
الزنكMERCK10881602502 مجم L-1< / sup>
كلوريد الليثيومكارل روثP007.10.5 مجم L-1< / sup>
كلوريد القصدير (II) × 2 & nbsp ؛ H2Oكارل روث4473.10.5 مجم L-1
حمض البوريكRiedel-de-Haen                         116061 مجم L-1< / sup> بروميد
البوتاسيومكارل روثA137.12 مجم L-1< / sup> يوديد
البوتاسيومكارل روث6750.12 مجم L-1< / sup>
كلوريد الباريومكارل روث4453.10.5 مجم L-1< / sup>
MMAالحد الأدنى من المتوسط + الاغاروز 0.2٪
Phenanthrene d10< / sub>Dr. EhrenstorferC 20920100
Potato Dextrose Agar: < / قوي> 24 جم L-1< / sup> مرق + باكتو أجار 1.5٪ ؛ درجة الحموضة 6.8
مرق سكر العنب البطاطسديفكو / بيكتون ديكنسون254920
باكتو أجارديفكو / بيكتون ديكنسون214040
أسيتات الصوديوم × 3 هيدر.كارل روث6779.1
كبريتات الصوديومMERCK1066495000
تولوينMERCK1083252500
mTY متوسط: < / قوي> 3 g  L-1< / sup> مستخلص الخميرة, 5 & nbsp; g  L-1< / sup> باكتو تريبتون و 50 ملي مولار
مستخلص الخميرةكلوريد الصوديوم Merck1037530500
TryptoneServa4864702
كلوريد الصوديومCarl Roth3957.1
ImageJ مع البرنامج المساعدlogi http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html و http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum< / em> سلالة 67-1تم الحصول عليها من مختبر الدكتور كريستوف كيل. قسم علم الأحياء الدقيقة الأساسي ، جامعة لوزان ، سويسرا
Burkholderia sartisoli< / em> RP037-mCheتم الحصول عليها من مختبر البروفيسور يان رويلوف فان دير مير. قسم علم الأحياء الدقيقة الأساسي ، جامعة لوزان ، سويسرا
GC لأداة

المراجع

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقايسة التقرير الحيويالمجهر البؤري الماسح بالليزرالنقل عبر الشبكة الميسيليةBurkholderia SartisoliPythium Ultimumالتوافر الحيوي للفلورينتحليل تعبير EGFPتقييم نقل الملوثاتبرنامج تحليل الصور
ككل نهج Bioreporter خلية لتقييم النقل والتوافر الحيوي للملوثات العضوية في أنظمة غير المشبعة المياه
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.