جيل من الخلايا T CAR للعلاج بالتبني في سياق ورم أرومي دبقي مستوى الرعاية

ورم أرومي دبقي (GBM) هو ورم خبيث في الدماغ الأولية الأكثر شيوعا وغير قاتلة دائما. فشل استئصال الجراحي إلى جانب معيار غير محددة من العلاج الكيميائي الرعاية والعلاج الإشعاعي للقضاء تماما الخلايا الخبيثة، مما أدى إلى التكهن الكئيب أقل من 15 شهرا في المرضى الذين يعانون من هذا المرض ^1. في المقابل، العلاج المناعي يقدم نهجا دقيقا لاستهداف الخلايا السرطانية على وجه التحديد، وبالتالي لديه القدرة لتكون بمثابة منصة علاج فعال للغاية مع تقليص خطر التعرض للسمية ضمانات ^2-4. خلايا T هندستها خارج الحي للتعبير عن مستقبلات المستضد خيالية (سيارات) تقدم استراتيجية متعددة الجوانب لالورم المناعي. يتم إنشاء السيارات عن طريق دمج المنطقة المتغيرة خارج الخلية من الأجسام المضادة مع خلية واحدة أو أكثر داخل الخلايا T يشير جزيء (ق)، وذلك بدلا من كامل طول التوافق النسيجي الرئيسي المعقدة (MHC) -restricted T الخلايا مستقبلات ^5. هذا النمط من مثل الأجسام المضادة مستضد recognitiعلى يسمح للخلايا T مستضد معين رد الفعل على الاعتراف والاستجابة لمستضدات الأورام في غياب MHC ويمكن تكييفها لمستضد ذخيرة لانهائية تقريبا.

وقد أظهرت خلايا CAR T المهندسة ضد مجموعة متنوعة من مستضدات الأورام فعالية قبل السريرية ووعد المتميز في العيادة ^6-9. على وجه التحديد، في سياق GBM، وهي تستهدف CAR منصة الخلايا T عامل نمو البشرة مستقبلات البديل الثالث (EGFRvIII)، أعربت طفرة ورم محددة على سطح الخلية ^10، وقد تبين لإطالة بقاء في الحاملة للدبقي الفئران ^11. وعلى الرغم من تعدد استعمالاتها، ومع ذلك، فإن فائدة سريرية من CAR العلاج بالتبني لم تتحقق بالكامل، ويرجع ذلك جزئيا إلى كبت المناعة المرتبط الورم والتهرب المناعة ^12-16 وكذلك التحديات في إنشاء وصيانة خلايا T مستضد معين في الجسم الحي. يمكن الاستفادة من مستوى الرعاية (SOC) مع العلاج المناعي يحتمل التغلب على العديد من هذه لترالمقلدة، مما أدى إلى تعزيز فعالية في كل من الإعداد قبل السريرية والسريرية.

SOC لمرحلة ما بعد استئصال-GBM يتكون من temozolomide جرعة عالية (TMZ)، وهو DNA وكيل مؤلكل ^17، وأشعة الدماغ كله (معهد البنك الدولي) ^1. يفترض هذه العلاجات إلى تضافر مع اللقاحات الورم عبر upregulation من ورم MHC التعبير ^18-20 وسفك المستضدات من قبل الخلايا السرطانية الميتة ^{17،19،21،22.} في الواقع، إضافة TMZ ^20،23 أو ^18،24 معهد البنك الدولي يؤدي إلى تعزيز فعالية مضادة للورم من العلاجات القائمة على جهاز المناعة في الإعداد قبل السريرية. وعلاوة على ذلك، مثل العديد من مبحث المعالجة الكيميائية السامة للخلايا غير محددة، ومن المعروف TMZ أن تسبب النظامية ^25،26 اللمفاويات، والتي يمكن الاستدانة كوسيلة لتكييف المضيف لمنصات العلاج بالتبني ^27-29. وقد تبين lymphodepletion TMZ بوساطة لتعزيز وتيرة وظيفة الخلايا T مستضد معين، مما يؤدي إلى زيادة فعالية من adopمنصة العلاج موانع ضد الأورام داخل الجمجمة ^30. في سياق العلاج CAR، يخدم lymphodepletion كوسيلة لتكييف المضيف من قبل كل من خفض عدد القامع الذاتية خلايا تي ^31، ويحفز انتشار استتبابي ³² عن طريق تقليل المنافسة على السيتوكينات ^33، وبالتالي تعزيز النشاط انتيتومور ^11،34. نظرا للعلاقة تعاونية بين GBM SOC والعلاج المناعي المنصات، وتقييم رواية العلاجات بالتبني ومنصات لقاح في سياق SOC أمر بالغ الأهمية لاستخلاص استنتاجات ذات مغزى بشأن فعالية.

في هذا البروتوكول، ونحن الخطوط العريضة لطريقة لتوليد وإدارة وريدية من خلايا T CAR EGFRvIII محددة الفئران جنبا إلى جنب مع TMZ ومعهد البنك الدولي في الفئران الحاملة الأورام داخل الجمجمة EGFRvIII إيجابية (انظر الشكل رقم 1 لجدول زمني العلاج). لفترة وجيزة، مصنوعة خلايا T CAR السابقين الجسم الحي من قبل تنبيغ فيروسات. الكلى الجنينية البشرية (HEK) 2و transfected 93T الخلايا باستخدام مجمع DNA / الدهون (التي تحتوي على ناقلات CAR والبلازميدات PCL للبيئة) لإنتاج الفيروس، الذي يستخدم بعد ذلك لتنبيغ splenocytes الفئران تنشيط التي يتم حصادها وتربيتها بشكل متواز. خلال جيل CAR، وتدار المضيفين الفئران تحمل الأورام داخل الجمجمة EGFRvIII إيجابية مجزأة كامل الدماغ إشعاع الأشعة السينية والعلاج TMZ النظامية في جرعات مماثلة لSOC السريري. ثم يتم تسليم CAR T الخلايا عن طريق الوريد إلى المضيفين lymphodepleted.

يتم وصف الإجراء التالي في سبع مراحل منفصلة: (1) إدارة Temozolomide إلى الفئران، (2) كامل التشعيع الدماغ من الفئران الحاملة للورم، الحاملة للورم (3) ترنسفكأيشن، (4) استئصال الطحال والخلايا التائية إعداد و(5 ) تنبيغ، (6) ثقافة خلية CAR T والحصاد، و (7) إدارة خلية CAR T إلى الفئران الحاملة للورم. وتتألف هذه المراحل من العديد من الخطوات التي تمتد 6-7 أيام ويتم تنفيذ متزامن.

ويستند هذا البروتوكول على التصميم التجريبي حيث يتم التعامل مع الفئران 10 10 ⁷ CAR T خلايا لكل منهما. هذا يعني أنه لن تكون هناك حاجة إلى 10 ⁸ خلايا T CAR. وينبغي المبالغة في تقدير العائد بنسبة 5 × 10 ⁷ -1 × 10 ⁸ إلى حساب الخسارة في قدرتها على البقاء. يتم تحجيم البروتوكول التالي لإنشاء حوالي 200 × 10 ⁶ خلايا. ثم تدار الخلايا عن طريق الوريد إلى الإناث C57BL / 6 الفئران مع 9 يوم أنشئت الأورام EGFRvIII إيجابي مسانج داخل الجمجمة، وضعت من نجمي KR158B أو B16 خطوط الخلايا القتامي القائمة. بالتزامن مع CAR T الجيل خلية، وتدار الفئران الحاملة للورم جرعات ذات الصلة سريريا من lymphodepletive TMZ (60 ملغ / كلغ) ومعهد البنك الدولي (16.5 غراي).

واستمرت الفئران ولدت في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض في المركز الطبي لجامعة ديوك (DUMC). أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل معهد جامعة ديوكآل رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. إدارة Temozolomide إلى الفئران الحاملة للورم

أيام من 0 إلى 4:

1. حساب عدد من الفئران ليتم حقنه ومضاعفة هذا بنسبة 0.5 لتحديد حجم محلول TMZ المطلوبة (على سبيل المثال، 30 الفئران X 0.5 مل = 15 مل TMZ) وإضافة 1.5 مل إلى هذا الحجم لحساب امتداد (16.5 مل TMZ ).
2. مضاعفة هذا الحجم الإجمالي بنسبة 3 ملغ / مل لتحديد وزن مجفف بالتجميد TMZ المطلوبة (على سبيل المثال، 16.5 × 3 = 49.5 ملغ TMZ). تزن هذه إلى المخروطية 50 مل.
   تنبيه: TMZ سامة عن طريق الإستنشاق والبلع، وملامسة العينين والجلد والأغشية المخاطية و. التشاور مع السلامة المؤسسة المهنية و / أو صحة البيئة وقسم العافية للتوصيات بشأن الحد من مخاطر التعرض.
3. مضاعفة الحجم الإجمالي بنسبة 0.15 لتحديد حجم ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) الحاجة (على سبيل المثال، 16.5 X0.15 = 2.475 مل DMSO). فلتر تعقيم هذا الحجم من DMSO (بالإضافة إلى 2 مل إضافية لحساب امتداد) من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر في أنبوب العقيمة. إضافة 2.475 مل من DMSO العقيمة إلى مسحوق TMZ.
4. وضع حل TMZ / DMSO في كوب من الماء على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. مرة واحدة يتم حله TMZ تماما، ينبغي أن تصبح الحل أصفر شاحب اللون. إذا كان هذا الحل يصبح وردي، ثم تتحلل وTMZ، ويجب أن يكون مستعدا حل جديد مع الكثير جديدة من TMZ.
5. حساب حجم مناسب من المياه المالحة عقيمة حاجة بضرب 0.85 من الحجم الكلي (0.85 X 16.5 مل = 14.025 مل المالحة). إضافة 15 مل من محلول ملحي معقم إلى مخروطي 50 مل. في حين TMZ هو حل في DMSO، المالحة الحرارة إلى 65 درجة مئوية.
6. دوامة الحل / DMSO TMZ لضمان أن مسحوق TMZ يذوب تماما وإضافة المالحة تحسنت إلى حل / DMSO TMZ ببطء.
7. مباشرة بعد التحضير، ويتم تحميلها بشكل كامل 15 × 1 مل السلين سيرينجوفاق مع حل TMZ للإدارة إلى 4 أيام أنشئت الورم الحاملة للفئران.
8. كرر هذا الإجراء في الأيام من 1 إلى 4 ليصبح المجموع خمس إدارات TMZ.

2. الجامع الدماغ التشعيع من الفئران الحاملة للورم

أيام من 2 إلى 4:

1. الطاقة على irradiator الأشعة السينية والسماح لها الاحماء إلى الجهد الكامل. تأكد من أن المرشح المناسب في مكان والمدخلات الجهد المناسب والإعدادات الحالية (الشكل 2A).
   ينبغي تحديد قياس الجرعات من irradiator مسبقا لتحديد الإعدادات الجهد وتخطيط الشبكة (الشكل 2A، B) الاقتضاء: ملاحظة.
2. حساب طول الوقت ما هو ضروري أن يؤدي إلى 5.5 غراي إشعاع الأشعة السينية. على سبيل المثال، إذا تم تسليمها الأشعة السينية بمعدل 2 غراي / دقيقة، ثم 2.75 دقيقة ضروري لتقديم ما مجموعه 5.5 غراي. إدخال المدة الزمنية المناسبة.
   ويقدم الجدول 2 الماوس معهد البنك الدولي جرعات ملاحظة:الثانية في حكمهم السريرية في البشر. في سياق الاورام الدبقية عالية الجودة، ومجزأة 60 غراي معهد البنك الدولي (2 الكسور غراي، 5 أيام / الأسبوع لمدة 6 أسابيع) هو المعيار السريري للرعاية، وما يعادل الفئران المستخدمة هنا هي 16.5 غراي (5.5 غراي × 3).
3. يعد حل الطازجة من الكيتامين / زيلازين للتخدير النظامية بإضافة 2 مل و 1 مل الكيتامين زيلازين إلى 17 مل المالحة مثل أن الحل النهائي هو 10 ملغ / مل الكيتامين و 1 ملغ / مل زيلازين.
4. وزن الفئران وإدارة 10 ميكرولتر من الكيتامين / زيلازين البريتونى لكل غرام من وزن الجسم مثل أن الحيوانات تلقي جرعة من الكيتامين في 100 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم من زيلازين. الفئران يجب مخدرا بالكامل ويتنفس بشكل واضح في غضون 2 دقيقة من الكيتامين الإدارة / زيلازين.
5. للحفاظ على رطوبة العيون في الحيوانات مخدرا، وفرك بلطف كمية صغيرة من الدموع الاصطناعية مرهم على كل عين.
6. وضع الفئران مخدرا على الشبكة بحيث رؤساء والمتمركزة في المنطقة التي تستقبل أعلى للأشعة X فيتوتر (الشكل 2B، C). الحجم الهيئات درع من الرقبة إلى أسفل مع بشكل مناسب أنابيب من الرصاص لمنع النظامية تسليم الأشعة السينية (الشكل 2D).
7. وضع الفئران وضعه تحت شعاع الأشعة السينية مثل أن الليزر تدل على نقطة محورية في شعاع الأشعة X هو في تنسيق (0،0) على تخطيط الشبكة. بدء تسليم الأشعة السينية.
8. عندما التسليم الأشعة السينية كاملة، وإزالة الحيوانات من irradiator ومكان على وسادة التدفئة الدافئة. لا إيواء الحيوانات مخدرا مع الحيوانات واعية حتى استعاد وعيه الحيوانات كافية للحفاظ على رقود القصية. مرة واحدة يمكن للحيوانات الحفاظ على رقود القصية، ضع الحيوانات واعية مرة أخرى في أقفاصها المناسبة.
9. كرر هذا الإجراء في أيام 3 و 4 ليصبح المجموع ثلاث جرعات مجزأة من الإشعاع.

3. ترنسفكأيشن

اليوم -1:

1. إعداد وسائل الاعلام D10 بإضافة 50 مل مصل بقري جنيني (FBS) إلى 500 مل من Dulbecco وModified النسر المتوسطة (DMEM).
2. إعداد T وسائل الاعلام الخلية (TCM) وذلك بإضافة 5.5 مل L-الجلوتامين، 5.5 مل البيروفات الصوديوم، 5.5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 5.5 مل pencillin / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا) إلى 500 مل سائل الإعلام RPMI-1640. المقبل، إضافة 550 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول و 550 جنتاميسين ميكرولتر. وأخيرا، إضافة 50 مل FBS.
3. الحصاد في المختبر خلايا HEK293T تربيتها ويرتفع الى تركيز 7.5 × 10 ⁶ خلية / مل في وسائل الإعلام D10.
4. لوحة 10 مل سائل الإعلام D10 وإضافة 1 مل من HEK293T تعليق خلية في كل من 16 × 10 سم بولي-D-ليسين (PDL) لوحات المغلفة.
5. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.

اليوم 0:

6. استبدال وسائل الإعلام مع 10 مل D10 جديدة على الأقل 30 دقيقة قبل بنقل العدوى إلى خلايا.
7. تحديد مقدار ناقلات البلازميد، PCL للبيئة ناقلات، وliposomal ترنسفكأيشن كاشف اللازمة لترنسفكأيشن بضرب عدد من لوحات + 1 (16 + 1 = 17) بنسبة 14.1 ميكروغرامناقلات بلازميد (14.1 × 17 = 239.7 ميكروغرام)، 9.9 ميكروغرام PCL للبيئة ناقلات (9.9 × 17 = 168.3 ميكروغرام)، و 60 ميكرولتر liposomal ترنسفكأيشن الكاشف (60 × 17 = 1،020 ميكرولتر). يجب أن تكون جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة قبل إعداد الحلول.
8. تسمية أنبوبين ألف وباء في أنبوب A، إضافة 239.7 ميكروغرام ناقلات البلازميد و168.3 ميكروغرام PCL للبيئة متجه إلى (1.5 × 17) مل خفض المصل تعديل النسر المتوسط ​​(RS-MEM). في أنبوب B، إضافة 1020 ميكرولتر liposomal كاشف ترنسفكأيشن إلى (1.5 × 17) مل RS-MEM.
9. احتضان A و B على حدة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
10. خلط A و B معا بلطف (دوامة لمدة 1-2 ثانية أو عكس عدة مرات)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل الدهون / مجمع DNA.
11. إضافة الدهون / DNA انخفاض مجمع الحكمة أن خلايا HEK293T في صحن 10 سم.
12. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعة أو بين عشية وضحاها (لا تتجاوز 24 ساعة).
13. بعد 6-8 ساعة الحضانة، واستبدال المتوسطة مع 12 مل من TCM جديدة لإنتاج الفيروسي. هذه الوسائط مطليوسوف تستخدم في يوم 2 كما طاف الفيروسي لخلايا T التنبيغ.

4. استئصال الطحال وT إعداد خلية

اليوم 0:

1. صب 10 مل من TCM إلى 50 مل المخروطية ومكان على الجليد لجمع الطحال.
2. تضحية العدد المناسب من الحيوانات عن طريق CO ₂ الخنق وقطع الرؤوس الثانوي: مكان الحيوانات في قفص تلقي CO ₂ بمعدل تدفق 10-30٪ قفص حجم / دقيقة، وفقا لتوجيهات الجمعية الأمريكية للطب البيطري (لا يمكن لأكثر من 5 حيوانات يكون ضحى في وقت واحد) حتى ينهي التنفس ولمدة دقيقتين بعد ذلك. إزالة الحيوانات من غرفة CO ₂ وقطع رأس.
   ملاحظة: واحد الطحال من 6-12 أسبوع من العمر الإناث C57BL / 6 الماوس سوف تسفر حوالي 4،5-5 × 10 ⁷ splenocytes. هنا، سوف تحصد 4 الطحال لحوالي 200 × 10 ⁶ خلايا.
3. وضع الماوس بحيث جانبها الأيمن يواجه ما يصل، ورذاذ مع الايثانول 70٪. مع ملقط، والاستيلاء على أضعاف رقيقة من الجلد تحت القفص الصدري الأيسر وقطع شق طفيف مع مقص. قشر يعود الجلد، وانتزاع بعناية أضعاف رقيقة من الغشاء البريتوني مع ملقط، وقطع على تجويف صغير.
4. الطحال هو، ممدود، الجهاز الأحمر الداكن صغيرة تشبه حبة بالارض. بدقة والاستيلاء على الطحال مع ملقط والمكوس عن طريق خفض بعيدا النسيج الضام المحيطة بها. وضع الطحال رفعه إلى المخروطية التي تحتوي على 10 مل من TCM على الجليد.
5. صب الطحال أكثر من 70 ميكرون خلية شبكة مصفاة وتفصيل كتبها يهرس مع نهاية حادة من داخل حقنة 5 مل لتوليد تعليق خلية واحدة. وينبغي تصنيف كحد أقصى اثنين من الطحال في شبكة مصفاة.
6. استخدام كمية صغيرة من TCM لغسل بعناية مصفاة التالية تفصيل لجمع أي splenocytes المتبقية. تجميع كل الطحال مصنفة في تعليق خلية واحدة. جلب الحجم النهائي إلى 50 مل مع TCM لغسل واحد لد تدور في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
7. يعد حل من 1X العازلة تحلل عن طريق إضافة 5 مل 10X العازلة تحلل إلى 45 مل ماء معقم. للقضاء على خلايا الدم الحمراء، بيليه resuspend في 5 مل من 1X العازلة تحلل في الطحال في المخروطية 50 مل، ويمزج جيدا بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا. إذا تتجاوز 5 الطحال، واستخدام أنبوب الطرد المركزي 250 مل. وضع المخروطية أو أنبوب الطرد المركزي في 37 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق.
8. إزالة رد فعل تحلل من حمام الماء وإضافة TCM في نسبة 1: 1 مع تحلل العازلة لتحييد رد فعل. غسل من خلال الدوران في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
9. نضح وطاف Resuspend بيليه بالكامل في TCM (2 مل / الطحال، 8 مل مجموعه لمدة 4 الطحال) من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
10. عدد الخلايا من خلال إضافة 10 ميكرولتر من تعليق خلية إلى 190 ميكرولتر التريبان الأزرق (01:20 تمييع). مضاعفة عدد التي تم الحصول عليها في واحدة من الساحات الشبكية أربعة بنسبة 20 × 10 × ⁴ الحجم الإجمالي (8 مل) للحصول على عدد الخلايا الكلي (على سبيل المثال، 125 خلايا × 20 × 10 ⁴ 6 splenocytes).
11. تمييع الخلايا إلى تركيز 2 × 10 ⁶ خلية / مل في TCM، على أن تستكمل مع 2 ميكروغرام / مل كونكانافالين ألف (كونا) و 50 وحدة دولية / مل المؤتلف الإنسان انترلوكين 2 (rhIL-2). وهكذا، على 200 × 10 ⁶ splenocytes، إضافة 92 مل سائل الإعلام إلى 8 مل الخلايا، 200 ميكروغرام كونا، و 5،000 وحدة دولية rhIL-2.
12. إضافة 2 مل الخلايا إلى كل بئر من نسيج الثقافة 24-جيدا لوحات المعالجة، مثل أن 4 × 10 ⁶ الخلايا في كل بئر (على سبيل المثال، 100 مل من خلايا سيتطلب حوالي 4 لوحات).
13. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.

5. تنبيغ

يوم 1:

1. احسب عدد ثقافة غير الأنسجة تعامل 24 لوحات جيدا اللازمة لالتنبيغ عن طريق ضرب عدد من الطحال تحصد 2 (هناك حاجة إلى 8 لوحات لمدة 4 الطحال).
2. التالي، وحساب حجم المطلوب من المؤتلف فبرونيكتين الإنسان جزء (RHFF) حلاللازمة لوحات معطف بضرب (إجمالي عدد الآبار + 3) × 0.5 مل (8 لوحات × 24 = 192 بئرا + 3 = 195) × 0.5 = 97.5 مل مل.
3. إعداد 97.5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على RHFF بتركيز 25 ميكروغرام / مل بضرب الحجم الإجمالي بنسبة 25 ميكروغرام (97.5 × 25 = 2437.5 ميكروغرام). إضافة هذه الكمية من RHFF إلى 97.5 مل PBS.
4. تعامل معطف الثقافة غير الأنسجة 24 لوحات جيدا بإضافة 0.5 مل PBS / RHFF حل لكل بئر.
5. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

يوم 2:

6. تفريغ حل PBS / RHFF من ثقافة غير الأنسجة المعالجة بمبيدات 24 لوحات جيدة.
7. إضافة 1 مل / جيد الزلال 2٪ المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
8. إزالة BSA التي تقلب بحزم لوحة. غسل بإضافة 2 مل PBS.
9. جمع طاف الفيروسي عن طريق تحويل وسائل الإعلام من كل HEK293T PDL لوحة في أنبوب 250 مل الطرد المركزي وتدور 10 دقيقة في 500 ز س.
10. نقل بعناية الفيروسي سوpernatant إلى الطازج 250 مل أنبوب الطرد المركزي، ويجري التأكد من عدم تعكير صفو بيليه الخلية التي ربما تكون قد تشكلت.
11. إضافة TCM جديدة لطاف الفيروسية مثل أن الحجم النهائي هو 3 مل أكثر من المبلغ المطلوب للآبار RHFF المغلفة. على سبيل المثال، على 192 بئرا RHFF المغلفة، وجلب حجم طاف الفيروسي إلى 192 + 3 = 195 مل مل.
12. إزالة splenocytes مثقف من الحاضنة و resuspend من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا من 2 - 3 مرات في كل بئر. نقل إلى المخروطية 250 مل. إذا باستخدام ماصة متعدد القنوات، وذلك باستخدام خزان معقم مسبق لنقل سيساعد على تسريع هذه الخطوة. عد كما هو موضح سابقا وتدور في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
13. إضافة rhIL-2 لطاف الفيروسي بتركيز 50 وحدة دولية / مل. على سبيل المثال، إضافة 50 × 195 = 9،750 وحدة دولية إلى 195 مل من طاف الفيروسي-2 rhIL.
14. و resuspend splenocytes في طاف الفيروسي في 1 × 10 ⁶ خلية / مل
15. إضافة 1 مل / بئر خلية طحالية تعليق لRHFF المغلفة 24 لوحات جيدا.
16. تدور لمدة 90 دقيقة وفقا للإعدادات التالية: 770 x ج، والتسارع = 4، والفرامل / تباطؤ = 0، 32 ° C.
17. يعد حل TCM مع 50 وحدة دولية / مل rhIL-2. على سبيل المثال، وإعداد TCM 200 حل عن طريق إضافة 10،000 وحدة دولية rhIL-2. إضافة 1 مل من rhIL-2 / TCM إلى كل بئر بعد الطرد المركزي.
18. الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.

6. CAR T خلية الثقافة والحصاد

أيام 3 و 4:

1. إذا خلايا T تحقيق> 80٪ التقاء، يمكن تقسيم الخلايا (هذا يحدث عادة بعد يوم 3 أو 4 أيام). لتقسيم الخلايا، الماصة بلطف صعودا وهبوطا في كل بئر 2-3 مرات، والتحرك 1 مل من كل بئر في آبار جديدة من 24-جيدا لوحة جديدة تعالج الأنسجة الثقافة. ثم، إضافة 1 مل من TCM الطازجة مع 50 وحدة دولية / مل IL-2 إلى كل هذا جيدا أن الحجم النهائي هو 2 مل في جميع الآبار.
2. إذا الخلايا لا تصل> 80٪ التقاء، إجراء تغيير وسائل الاعلام نصف قبل pipetting ببطء قبالة 1 مل من وسائل الإعلام من أعلى كل بئر. تجنب دisturbing خلايا استقر على الجزء السفلي أثناء إزالة وسائل الإعلام. إضافة 1 مل من TCM الطازجة تحتوي على 50 وحدة دولية / مل rhIL-2.

يوم 5:

3. Resuspend الخلايا T CAR من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا 3 مرات في كل بئر ونقل إلى 250 مل أنبوب الطرد المركزي. تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
4. طاف نضح تماما من دون إزعاج بيليه. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، عد الخلايا كما هو موضح سابقا، ويغسل مع برنامج تلفزيوني للمرة الثانية. A CAR العائد خلية T نموذجي هو حوالي 1 × 10 ⁶ خلايا لكل بئر (8 لوحات خلايا × 24 = 192 بئرا × 10 ⁶ CAR T).
5. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني بتركيز 5 × 10 ⁷ / مل لحقن 1 × 10 ⁷ في حجم 200 ميكروغرام (على سبيل المثال، عن 192 × 10 ⁶ خلايا CAR T، وغسلها بيليه resuspend في 3.84 مل PBS).

7. CAR إدارة خلية T إلى الفئران الحاملة للورم

يوم 5:

1. TRANSPOخلايا غ على الجليد لمنشأة الحيوان للحقن في الوريد. تحميل 500-1،000 ميكرولتر إلى حقنة الأنسولين مع 27-31 G إبرة، وضمان أن جميع فقاعات وطرد.
2. الاستيلاء على الماوس عند قاعدة الذيل ووضع في أنبوب رادع.
3. سحب الذيل مشدود مع الوريد تواجه صعودا، وأنسل من الإبرة حوالي 1-2 ملم تحت الجلد في الوريد عن طريق إدراج ذلك بالتوازي مع الوريد الذيل. طرد ببطء 200 ميكرولتر في الوريد. إذا تم إدخال الإبرة بشكل صحيح في الوريد، فإن حجم التدفق بسهولة في. وإلا لن يكون هناك مقاومة، وسوف تحتاج الإبرة إلى إزالتها من الذيل وإعادة إدراجها بشكل صحيح.

يتم إنشاؤها CAR T الخلايا عن طريق التنبيغ مع EGFRvIII CAR فيروسات ناقلات 11. هذه النواقل، MSGV1، وقد وضعت من متجه SFGtcLuc_ITE4 35، والذي يحتوي على الفيروس الخلايا الجذعية الفئران (MSCV) يكرر الطرفية طويلة، والممتدة المنطقة هفوة والمغلف الموقع لصق (لصق المانحة، والتنمية المستدامة، ولصق متقبل، سا)، والفيروسية إشارة التعبئة والتغليف (ψ). وCAR EGFRvIII تحتوي على مكافحة EGFRvIII سلسلة واحدة جزء البشري متغير (scFv) 139، جنبا إلى جنب مع CD8TM الفئران والمناطق داخل الخلايا CD28، 4-1BB، وCD3ζ، تم استنساخ في ناقلات فيروسات المصب الموقع جنة التحقيق الوطنية السودانية (الشكل 3) .

وبعد التنبيغ، وخلايا T CAR يمكن كميا وphenotyped التدفق الخلوي. خلايا T EGFRvIII CAR يمكن تصور مع لوحة 2-لون تتألف من streptavidin-فيكوإيريترين (SA / PE) -conjugated biotynlated متعدد القسيمات المستمدة EGFRvIII ومكافحة CD3 FITC. استخدام الثقافة والتنبيغ على البروتوكول الاضافيوصف ocols هنا، نلاحظ بشكل روتيني CAR التعبير بين 55-70٪ من splenocytes الفئران (الشكل 4A) 11. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن تكون سيارات الملون للتعبير باستخدام F الماعز مكافحة الإنسان (أ ب ') الأجسام المضادة الثانوية الابتدائية 2-البيوتين وSA / PE التي وصفت سابقا 36. خلايا T CAR يمكن phenotyped أبعد من خلال إضافة أخرى الأجسام المضادة fluorescently المسمى إلى لوحة CAR اللونين. على سبيل المثال، وتلطيخ لCD8 CD4 وتبين أن 70٪ من السيارات transduced هي خلايا CD8 + T، في حين أن 20٪ من خلايا CD4 + T (الشكل 4B). وقد ثبت خلايا T CAR مع هذا الملف التعبير لحركة المرور بسهولة إلى الدماغ وعلاج الأورام داخل الجمجمة.

تم حساب الجرعة Temozolomide على أساس الوزن الحيوان جرعات Temozolomide بناء على الجرعة الإجمالية من 60 ملغ / كغ: الجدول 1.

الجدول 2: جرعات الإشعاع تعادل بيولوجيا ذات الصلة سريريا تم حساب جرعات الإشعاع وفقا لBED = D [1+ د / (α / β)]، حيث D = الجرعة الكلية، جرعة D = مجزأة، وα / β = 2). ويرد الجرعة الإجمالية تدار كما معهد البنك الدولي إلى المضيف الفئران من حيث عشرجرعات كسور البريد تسليمها والجرعة الإنسان مستمدة من النموذج من قبل أولئك الكسور الجرعة. لأغراض نموذج، يظهر أيضا الورم الخبيث من أجلها BED هو المعيار الرعاية.

يبدأ الجدول الزمني للعلاج من ورم الفئران الحاملة وخارج الحي الجيل CAR المتزامنة معيار العلاج الكيميائي الرعاية وأشعة الدماغ كله بعد 4 أيام زرع الورم (A): الشكل 1. وخلال هذه الفترة الزمنية، يتم إنشاء خلايا T CAR ومثقف خارج الحي (B) وتسليمها بعد دورة كاملة من تكييف المضيف.

الشكل 2: تخطيط والإعدادات للتسليم الإشعاع.يتم تسليم أشعة X وفقا لقياس الجرعات من 320 كيلو فولت و 10 أمبير، مع مدة متغيرة اختيارها وفقا لالجرعة المطلوبة (A). مجال البؤري للإشعاع الأشعة X هو ضيقة 2.5 سم المنطقة. يتم ترتيب الحيوانات مخدرا وفقا لشبكة (B) بحيث رؤوسهم تكمن في مجال أعلى كثافة الأشعة السينية، (C) يبين وجهة نظر من واحدة من نهاية شعاع الأشعة السينية. يمكن ما يقرب من 4 الحيوانات ستكون تحت irradiator خلال دورة واحدة من إدارة الأشعة السينية وفقا لهذا تخطيط الشبكة (B، D). ويستخدم الرصاص أنابيب لحماية الجسم، ولم يتبق سوى رؤوسهم يتعرض لمعهد البنك الدولي (D).

الرقم 3: تعديل SFGtcLuc_ITE4 فيروسات ناقلات، MSGV1، واستخدمت لالتنبيغ وتوليد خلايا T CAR و.إدراج CAR EGFRvIII تحتوي على مكافحة EGFRvIII سلسلة واحدة جزء البشري متغير (scFv) 139، جنبا إلى جنب مع CD8TM الفئران، CD28، 4-1BB، وCD3ζ المناطق داخل الخلايا، يحيط بها الفئران الفيروس الخلايا الجذعية (MSCV) يكرر محطة الطويلة (LTR ). المنبع من إدراج CAR هي المنطقة هفوة الموسعة والموقع لصق المغلف (لصق المانحة، والتنمية المستدامة، ولصق متقبل، سا)، وإشارة التعبئة والتغليف الفيروسية (ψ).

الشكل (4): يتم التعبير عن سيارات EGFRvIII على سطح خلايا T 48 ساعة التالية التنبيغ، كانت ملطخة خلايا T للتعبير عن سطح سيارات EGFRvIII باستخدام متعدد القسيمات تتألف من LEEKKGNYVVTDHC-K (البيوتين) -NH 2 / streptavidin-PE. كانت ملطخة أيضا خلايا T Untransduced من نفس المانحة كوسيلة لمراقبة سلبية. وتظهر البيانات أن عدد خلايا T CAR (المحور الصادي) إيجابية لستاining من قبل متعدد القسيمات-PE مترافق EGFRvIII (محور س)، بوابات على CD3 + الخلايا كعلامة خلية T، حيث تم العثور التعبير لتكون 60.9٪ (A). خلايا T CAR الملون لCD4-PerCP-Cy5.5 وCD8-APC تظهر ملف تعريف تعبير عن 21.7٪ و 70.9٪ على التوالي (B).

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.