يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل من الخلايا T CAR للعلاج بالتبني في سياق ورم أرومي دبقي مستوى الرعاية

20.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52397

⸱

فبراير 16, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

في هذه المقالة

ملخص

يمكن الاستفادة من التأثيرات اللمفاوية والمناعية للعلاج الكيميائي ومعيار الرعاية الإشعاعية لتعزيز الفعالية المضادة للأورام للعلاج المناعي للخلايا التائية. نحدد طريقة لتوليد الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) الخاصة ب EGFRvIII وإدارتها في سياق معيار الرعاية للورم الأرومي الدبقي.

الملخص

يقدم العلاج المناعي للخلايا التائية بالتبني استراتيجية واعدة لاستهداف الأورام الدبقية الخبيثة والقضاء عليها على وجه التحديد. يمكن هندسة الخلايا التائية خارج الجسم الحي للتعبير عن مستقبلات المستضد الخيمرية الخاصة بمستضدات الورم الدبقي (الخلايا التائية CAR). يمكن تعزيز توسع ووظيفة الخلايا التائية المستضدة المستضدة المستضدة بالتبني من خلال التأثيرات الليمفاوية والمبيدة للأورام للعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي القياسي للرعاية. نصف طريقة لتوليد الخلايا التائية CAR T التي تستهدف EGFRvIII ، وهو مستضد خاص بالورم الدبقي ، وتقييم فعاليتها عند دمجها مع نموذج الفئران لمعيار الرعاية بالورم الأرومي الدبقي. يتم تصميم الخلايا التائية عن طريق التنبيغ مع ناقل فيروسي قهقري يحتوي على جين CAR المضاد ل EGFRvIII. تخضع الحاملة للورم لتكييف المضيف من خلال دورة من تشعيع التيموزولوميد والدماغ بالكامل بأنظمة جرعات مصممة لنمذجة معيار الرعاية السريري. ثم يتم تسليم الخلايا التائية CAR عن طريق الوريد إلى المضيفين الجاهزين. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الفعالية المضادة للأورام للخلايا التائية المستضدة للمستقبلات المستضدة المستوفرة في سياق معيار الرعاية.

المقدمة

ورم أرومي دبقي (GBM) هو ورم خبيث في الدماغ الأولية الأكثر شيوعا وغير قاتلة دائما. فشل استئصال الجراحي إلى جانب معيار غير محددة من العلاج الكيميائي الرعاية والعلاج الإشعاعي للقضاء تماما الخلايا الخبيثة، مما أدى إلى التكهن الكئيب أقل من 15 شهرا في المرضى الذين يعانون من هذا المرض 1. في المقابل، العلاج المناعي يقدم نهجا دقيقا لاستهداف الخلايا السرطانية على وجه التحديد، وبالتالي لديه القدرة لتكون بمثابة منصة علاج فعال للغاية مع تقليص خطر التعرض للسمية ضمانات 2-4. خلايا T هندستها خارج الحي للتعبير عن مستقبلات المستضد خيالية (سيارات) تقدم استراتيجية متعددة الجوانب لالورم المناعي. يتم إنشاء السيارات عن طريق دمج المنطقة المتغيرة خارج الخلية من الأجسام المضادة مع خلية واحدة أو أكثر داخل الخلايا T يشير جزيء (ق)، وذلك بدلا من كامل طول التوافق النسيجي الرئيسي المعقدة (MHC) -restricted T الخلايا مستقبلات 5. هذا النمط من مثل الأجسام المضادة مستضد recognitiعلى يسمح للخلايا T مستضد معين رد الفعل على الاعتراف والاستجابة لمستضدات الأورام في غياب MHC ويمكن تكييفها لمستضد ذخيرة لانهائية تقريبا.

وقد أظهرت خلايا CAR T المهندسة ضد مجموعة متنوعة من مستضدات الأورام فعالية قبل السريرية ووعد المتميز في العيادة 6-9. على وجه التحديد، في سياق GBM، وهي تستهدف CAR منصة الخلايا T عامل نمو البشرة مستقبلات البديل الثالث (EGFRvIII)، أعربت طفرة ورم محددة على سطح الخلية 10، وقد تبين لإطالة بقاء في الحاملة للدبقي الفئران 11. وعلى الرغم من تعدد استعمالاتها، ومع ذلك، فإن فائدة سريرية من CAR العلاج بالتبني لم تتحقق بالكامل، ويرجع ذلك جزئيا إلى كبت المناعة المرتبط الورم والتهرب المناعة 12-16 وكذلك التحديات في إنشاء وصيانة خلايا T مستضد معين في الجسم الحي. يمكن الاستفادة من مستوى الرعاية (SOC) مع العلاج المناعي يحتمل التغلب على العديد من هذه لترالمقلدة، مما أدى إلى تعزيز فعالية في كل من الإعداد قبل السريرية والسريرية.

SOC لمرحلة ما بعد استئصال-GBM يتكون من temozolomide جرعة عالية (TMZ)، وهو DNA وكيل مؤلكل 17، وأشعة الدماغ كله (معهد البنك الدولي) 1. يفترض هذه العلاجات إلى تضافر مع اللقاحات الورم عبر upregulation من ورم MHC التعبير 18-20 وسفك المستضدات من قبل الخلايا السرطانية الميتة 17،19،21،22. في الواقع، إضافة TMZ 20،23 أو 18،24 معهد البنك الدولي يؤدي إلى تعزيز فعالية مضادة للورم من العلاجات القائمة على جهاز المناعة في الإعداد قبل السريرية. وعلاوة على ذلك، مثل العديد من مبحث المعالجة الكيميائية السامة للخلايا غير محددة، ومن المعروف TMZ أن تسبب النظامية 25،26 اللمفاويات، والتي يمكن الاستدانة كوسيلة لتكييف المضيف لمنصات العلاج بالتبني 27-29. وقد تبين lymphodepletion TMZ بوساطة لتعزيز وتيرة وظيفة الخلايا T مستضد معين، مما يؤدي إلى زيادة فعالية من adopمنصة العلاج موانع ضد الأورام داخل الجمجمة 30. في سياق العلاج CAR، يخدم lymphodepletion كوسيلة لتكييف المضيف من قبل كل من خفض عدد القامع الذاتية خلايا تي 31، ويحفز انتشار استتبابي 32 عن طريق تقليل المنافسة على السيتوكينات 33، وبالتالي تعزيز النشاط انتيتومور 11،34. نظرا للعلاقة تعاونية بين GBM SOC والعلاج المناعي المنصات، وتقييم رواية العلاجات بالتبني ومنصات لقاح في سياق SOC أمر بالغ الأهمية لاستخلاص استنتاجات ذات مغزى بشأن فعالية.

في هذا البروتوكول، ونحن الخطوط العريضة لطريقة لتوليد وإدارة وريدية من خلايا T CAR EGFRvIII محددة الفئران جنبا إلى جنب مع TMZ ومعهد البنك الدولي في الفئران الحاملة الأورام داخل الجمجمة EGFRvIII إيجابية (انظر الشكل رقم 1 لجدول زمني العلاج). لفترة وجيزة، مصنوعة خلايا T CAR السابقين الجسم الحي من قبل تنبيغ فيروسات. الكلى الجنينية البشرية (HEK) 2و transfected 93T الخلايا باستخدام مجمع DNA / الدهون (التي تحتوي على ناقلات CAR والبلازميدات PCL للبيئة) لإنتاج الفيروس، الذي يستخدم بعد ذلك لتنبيغ splenocytes الفئران تنشيط التي يتم حصادها وتربيتها بشكل متواز. خلال جيل CAR، وتدار المضيفين الفئران تحمل الأورام داخل الجمجمة EGFRvIII إيجابية مجزأة كامل الدماغ إشعاع الأشعة السينية والعلاج TMZ النظامية في جرعات مماثلة لSOC السريري. ثم يتم تسليم CAR T الخلايا عن طريق الوريد إلى المضيفين lymphodepleted.

يتم وصف الإجراء التالي في سبع مراحل منفصلة: (1) إدارة Temozolomide إلى الفئران، (2) كامل التشعيع الدماغ من الفئران الحاملة للورم، الحاملة للورم (3) ترنسفكأيشن، (4) استئصال الطحال والخلايا التائية إعداد و(5 ) تنبيغ، (6) ثقافة خلية CAR T والحصاد، و (7) إدارة خلية CAR T إلى الفئران الحاملة للورم. وتتألف هذه المراحل من العديد من الخطوات التي تمتد 6-7 أيام ويتم تنفيذ متزامن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ويستند هذا البروتوكول على التصميم التجريبي حيث يتم التعامل مع الفئران 10 10 7 CAR T خلايا لكل منهما. هذا يعني أنه لن تكون هناك حاجة إلى 10 8 خلايا T CAR. وينبغي المبالغة في تقدير العائد بنسبة 5 × 10 7 -1 × 10 8 إلى حساب الخسارة في قدرتها على البقاء. يتم تحجيم البروتوكول التالي لإنشاء حوالي 200 × 10 6 خلايا. ثم تدار الخلايا عن طريق الوريد إلى الإناث C57BL / 6 الفئران مع 9 يوم أنشئت الأورام EGFRvIII إيجابي مسانج داخل الجمجمة، وضعت من نجمي KR158B أو B16 خطوط الخلايا القتامي القائمة. بالتزامن مع CAR T الجيل خلية، وتدار الفئران الحاملة للورم جرعات ذات الصلة سريريا من lymphodepletive TMZ (60 ملغ / كلغ) ومعهد البنك الدولي (16.5 غراي).

واستمرت الفئران ولدت في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض في المركز الطبي لجامعة ديوك (DUMC). أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل معهد جامعة ديوكآل رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. إدارة Temozolomide إلى الفئران الحاملة للورم

أيام من 0 إلى 4:

  1. حساب عدد من الفئران ليتم حقنه ومضاعفة هذا بنسبة 0.5 لتحديد حجم محلول TMZ المطلوبة (على سبيل المثال، 30 الفئران X 0.5 مل = 15 مل TMZ) وإضافة 1.5 مل إلى هذا الحجم لحساب امتداد (16.5 مل TMZ ).
  2. مضاعفة هذا الحجم الإجمالي بنسبة 3 ملغ / مل لتحديد وزن مجفف بالتجميد TMZ المطلوبة (على سبيل المثال، 16.5 × 3 = 49.5 ملغ TMZ). تزن هذه إلى المخروطية 50 مل.
    تنبيه: TMZ سامة عن طريق الإستنشاق والبلع، وملامسة العينين والجلد والأغشية المخاطية و. التشاور مع السلامة المؤسسة المهنية و / أو صحة البيئة وقسم العافية للتوصيات بشأن الحد من مخاطر التعرض.
  3. مضاعفة الحجم الإجمالي بنسبة 0.15 لتحديد حجم ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) الحاجة (على سبيل المثال، 16.5 X0.15 = 2.475 مل DMSO). فلتر تعقيم هذا الحجم من DMSO (بالإضافة إلى 2 مل إضافية لحساب امتداد) من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر في أنبوب العقيمة. إضافة 2.475 مل من DMSO العقيمة إلى مسحوق TMZ.
  4. وضع حل TMZ / DMSO في كوب من الماء على طبق ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. مرة واحدة يتم حله TMZ تماما، ينبغي أن تصبح الحل أصفر شاحب اللون. إذا كان هذا الحل يصبح وردي، ثم تتحلل وTMZ، ويجب أن يكون مستعدا حل جديد مع الكثير جديدة من TMZ.
  5. حساب حجم مناسب من المياه المالحة عقيمة حاجة بضرب 0.85 من الحجم الكلي (0.85 X 16.5 مل = 14.025 مل المالحة). إضافة 15 مل من محلول ملحي معقم إلى مخروطي 50 مل. في حين TMZ هو حل في DMSO، المالحة الحرارة إلى 65 درجة مئوية.
  6. دوامة الحل / DMSO TMZ لضمان أن مسحوق TMZ يذوب تماما وإضافة المالحة تحسنت إلى حل / DMSO TMZ ببطء.
  7. مباشرة بعد التحضير، ويتم تحميلها بشكل كامل 15 × 1 مل السلين سيرينجوفاق مع حل TMZ للإدارة إلى 4 أيام أنشئت الورم الحاملة للفئران.
  8. كرر هذا الإجراء في الأيام من 1 إلى 4 ليصبح المجموع خمس إدارات TMZ.

2. الجامع الدماغ التشعيع من الفئران الحاملة للورم

أيام من 2 إلى 4:

  1. الطاقة على irradiator الأشعة السينية والسماح لها الاحماء إلى الجهد الكامل. تأكد من أن المرشح المناسب في مكان والمدخلات الجهد المناسب والإعدادات الحالية (الشكل 2A).
    ينبغي تحديد قياس الجرعات من irradiator مسبقا لتحديد الإعدادات الجهد وتخطيط الشبكة (الشكل 2A، B) الاقتضاء: ملاحظة.
  2. حساب طول الوقت ما هو ضروري أن يؤدي إلى 5.5 غراي إشعاع الأشعة السينية. على سبيل المثال، إذا تم تسليمها الأشعة السينية بمعدل 2 غراي / دقيقة، ثم 2.75 دقيقة ضروري لتقديم ما مجموعه 5.5 غراي. إدخال المدة الزمنية المناسبة.
    ويقدم الجدول 2 الماوس معهد البنك الدولي جرعات ملاحظة:الثانية في حكمهم السريرية في البشر. في سياق الاورام الدبقية عالية الجودة، ومجزأة 60 غراي معهد البنك الدولي (2 الكسور غراي، 5 أيام / الأسبوع لمدة 6 أسابيع) هو المعيار السريري للرعاية، وما يعادل الفئران المستخدمة هنا هي 16.5 غراي (5.5 غراي × 3).
  3. يعد حل الطازجة من الكيتامين / زيلازين للتخدير النظامية بإضافة 2 مل و 1 مل الكيتامين زيلازين إلى 17 مل المالحة مثل أن الحل النهائي هو 10 ملغ / مل الكيتامين و 1 ملغ / مل زيلازين.
  4. وزن الفئران وإدارة 10 ميكرولتر من الكيتامين / زيلازين البريتونى لكل غرام من وزن الجسم مثل أن الحيوانات تلقي جرعة من الكيتامين في 100 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم من زيلازين. الفئران يجب مخدرا بالكامل ويتنفس بشكل واضح في غضون 2 دقيقة من الكيتامين الإدارة / زيلازين.
  5. للحفاظ على رطوبة العيون في الحيوانات مخدرا، وفرك بلطف كمية صغيرة من الدموع الاصطناعية مرهم على كل عين.
  6. وضع الفئران مخدرا على الشبكة بحيث رؤساء والمتمركزة في المنطقة التي تستقبل أعلى للأشعة X فيتوتر (الشكل 2B، C). الحجم الهيئات درع من الرقبة إلى أسفل مع بشكل مناسب أنابيب من الرصاص لمنع النظامية تسليم الأشعة السينية (الشكل 2D).
  7. وضع الفئران وضعه تحت شعاع الأشعة السينية مثل أن الليزر تدل على نقطة محورية في شعاع الأشعة X هو في تنسيق (0،0) على تخطيط الشبكة. بدء تسليم الأشعة السينية.
  8. عندما التسليم الأشعة السينية كاملة، وإزالة الحيوانات من irradiator ومكان على وسادة التدفئة الدافئة. لا إيواء الحيوانات مخدرا مع الحيوانات واعية حتى استعاد وعيه الحيوانات كافية للحفاظ على رقود القصية. مرة واحدة يمكن للحيوانات الحفاظ على رقود القصية، ضع الحيوانات واعية مرة أخرى في أقفاصها المناسبة.
  9. كرر هذا الإجراء في أيام 3 و 4 ليصبح المجموع ثلاث جرعات مجزأة من الإشعاع.

3. ترنسفكأيشن

اليوم -1:

  1. إعداد وسائل الاعلام D10 بإضافة 50 مل مصل بقري جنيني (FBS) إلى 500 مل من Dulbecco وModified النسر المتوسطة (DMEM).
  2. إعداد T وسائل الاعلام الخلية (TCM) وذلك بإضافة 5.5 مل L-الجلوتامين، 5.5 مل البيروفات الصوديوم، 5.5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 5.5 مل pencillin / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا) إلى 500 مل سائل الإعلام RPMI-1640. المقبل، إضافة 550 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول و 550 جنتاميسين ميكرولتر. وأخيرا، إضافة 50 مل FBS.
  3. الحصاد في المختبر خلايا HEK293T تربيتها ويرتفع الى تركيز 7.5 × 10 6 خلية / مل في وسائل الإعلام D10.
  4. لوحة 10 مل سائل الإعلام D10 وإضافة 1 مل من HEK293T تعليق خلية في كل من 16 × 10 سم بولي-D-ليسين (PDL) لوحات المغلفة.
  5. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

اليوم 0:

  1. استبدال وسائل الإعلام مع 10 مل D10 جديدة على الأقل 30 دقيقة قبل بنقل العدوى إلى خلايا.
  2. تحديد مقدار ناقلات البلازميد، PCL للبيئة ناقلات، وliposomal ترنسفكأيشن كاشف اللازمة لترنسفكأيشن بضرب عدد من لوحات + 1 (16 + 1 = 17) بنسبة 14.1 ميكروغرامناقلات بلازميد (14.1 × 17 = 239.7 ميكروغرام)، 9.9 ميكروغرام PCL للبيئة ناقلات (9.9 × 17 = 168.3 ميكروغرام)، و 60 ميكرولتر liposomal ترنسفكأيشن الكاشف (60 × 17 = 1،020 ميكرولتر). يجب أن تكون جميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة قبل إعداد الحلول.
  3. تسمية أنبوبين ألف وباء في أنبوب A، إضافة 239.7 ميكروغرام ناقلات البلازميد و168.3 ميكروغرام PCL للبيئة متجه إلى (1.5 × 17) مل خفض المصل تعديل النسر المتوسط ​​(RS-MEM). في أنبوب B، إضافة 1020 ميكرولتر liposomal كاشف ترنسفكأيشن إلى (1.5 × 17) مل RS-MEM.
  4. احتضان A و B على حدة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. خلط A و B معا بلطف (دوامة لمدة 1-2 ثانية أو عكس عدة مرات)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل الدهون / مجمع DNA.
  6. إضافة الدهون / DNA انخفاض مجمع الحكمة أن خلايا HEK293T في صحن 10 سم.
  7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعة أو بين عشية وضحاها (لا تتجاوز 24 ساعة).
  8. بعد 6-8 ساعة الحضانة، واستبدال المتوسطة مع 12 مل من TCM جديدة لإنتاج الفيروسي. هذه الوسائط مطليوسوف تستخدم في يوم 2 كما طاف الفيروسي لخلايا T التنبيغ.

4. استئصال الطحال وT إعداد خلية

اليوم 0:

  1. صب 10 مل من TCM إلى 50 مل المخروطية ومكان على الجليد لجمع الطحال.
  2. تضحية العدد المناسب من الحيوانات عن طريق CO 2 الخنق وقطع الرؤوس الثانوي: مكان الحيوانات في قفص تلقي CO 2 بمعدل تدفق 10-30٪ قفص حجم / دقيقة، وفقا لتوجيهات الجمعية الأمريكية للطب البيطري (لا يمكن لأكثر من 5 حيوانات يكون ضحى في وقت واحد) حتى ينهي التنفس ولمدة دقيقتين بعد ذلك. إزالة الحيوانات من غرفة CO 2 وقطع رأس.
    ملاحظة: واحد الطحال من 6-12 أسبوع من العمر الإناث C57BL / 6 الماوس سوف تسفر حوالي 4،5-5 × 10 7 splenocytes. هنا، سوف تحصد 4 الطحال لحوالي 200 × 10 6 خلايا.
  3. وضع الماوس بحيث جانبها الأيمن يواجه ما يصل، ورذاذ مع الايثانول 70٪. مع ملقط، والاستيلاء على أضعاف رقيقة من الجلد تحت القفص الصدري الأيسر وقطع شق طفيف مع مقص. قشر يعود الجلد، وانتزاع بعناية أضعاف رقيقة من الغشاء البريتوني مع ملقط، وقطع على تجويف صغير.
  4. الطحال هو، ممدود، الجهاز الأحمر الداكن صغيرة تشبه حبة بالارض. بدقة والاستيلاء على الطحال مع ملقط والمكوس عن طريق خفض بعيدا النسيج الضام المحيطة بها. وضع الطحال رفعه إلى المخروطية التي تحتوي على 10 مل من TCM على الجليد.
  5. صب الطحال أكثر من 70 ميكرون خلية شبكة مصفاة وتفصيل كتبها يهرس مع نهاية حادة من داخل حقنة 5 مل لتوليد تعليق خلية واحدة. وينبغي تصنيف كحد أقصى اثنين من الطحال في شبكة مصفاة.
  6. استخدام كمية صغيرة من TCM لغسل بعناية مصفاة التالية تفصيل لجمع أي splenocytes المتبقية. تجميع كل الطحال مصنفة في تعليق خلية واحدة. جلب الحجم النهائي إلى 50 مل مع TCM لغسل واحد لد تدور في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  7. يعد حل من 1X العازلة تحلل عن طريق إضافة 5 مل 10X العازلة تحلل إلى 45 مل ماء معقم. للقضاء على خلايا الدم الحمراء، بيليه resuspend في 5 مل من 1X العازلة تحلل في الطحال في المخروطية 50 مل، ويمزج جيدا بواسطة pipetting بلطف صعودا وهبوطا. إذا تتجاوز 5 الطحال، واستخدام أنبوب الطرد المركزي 250 مل. وضع المخروطية أو أنبوب الطرد المركزي في 37 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق.
  8. إزالة رد فعل تحلل من حمام الماء وإضافة TCM في نسبة 1: 1 مع تحلل العازلة لتحييد رد فعل. غسل من خلال الدوران في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  9. نضح وطاف Resuspend بيليه بالكامل في TCM (2 مل / الطحال، 8 مل مجموعه لمدة 4 الطحال) من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  10. عدد الخلايا من خلال إضافة 10 ميكرولتر من تعليق خلية إلى 190 ميكرولتر التريبان الأزرق (01:20 تمييع). مضاعفة عدد التي تم الحصول عليها في واحدة من الساحات الشبكية أربعة بنسبة 20 × 10 × 4 الحجم الإجمالي (8 مل) للحصول على عدد الخلايا الكلي (على سبيل المثال، 125 خلايا × 20 × 10 4 × 8 مل = 200 × 10 6 splenocytes).
  11. تمييع الخلايا إلى تركيز 2 × 10 6 خلية / مل في TCM، على أن تستكمل مع 2 ميكروغرام / مل كونكانافالين ألف (كونا) و 50 وحدة دولية / مل المؤتلف الإنسان انترلوكين 2 (rhIL-2). وهكذا، على 200 × 10 6 splenocytes، إضافة 92 مل سائل الإعلام إلى 8 مل الخلايا، 200 ميكروغرام كونا، و 5،000 وحدة دولية rhIL-2.
  12. إضافة 2 مل الخلايا إلى كل بئر من نسيج الثقافة 24-جيدا لوحات المعالجة، مثل أن 4 × 10 6 الخلايا في كل بئر (على سبيل المثال، 100 مل من خلايا سيتطلب حوالي 4 لوحات).
  13. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

5. تنبيغ

يوم 1:

  1. احسب عدد ثقافة غير الأنسجة تعامل 24 لوحات جيدا اللازمة لالتنبيغ عن طريق ضرب عدد من الطحال تحصد 2 (هناك حاجة إلى 8 لوحات لمدة 4 الطحال).
  2. التالي، وحساب حجم المطلوب من المؤتلف فبرونيكتين الإنسان جزء (RHFF) حلاللازمة لوحات معطف بضرب (إجمالي عدد الآبار + 3) × 0.5 مل (8 لوحات × 24 = 192 بئرا + 3 = 195) × 0.5 = 97.5 مل مل.
  3. إعداد 97.5 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على RHFF بتركيز 25 ميكروغرام / مل بضرب الحجم الإجمالي بنسبة 25 ميكروغرام (97.5 × 25 = 2437.5 ميكروغرام). إضافة هذه الكمية من RHFF إلى 97.5 مل PBS.
  4. تعامل معطف الثقافة غير الأنسجة 24 لوحات جيدا بإضافة 0.5 مل PBS / RHFF حل لكل بئر.
  5. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

يوم 2:

  1. تفريغ حل PBS / RHFF من ثقافة غير الأنسجة المعالجة بمبيدات 24 لوحات جيدة.
  2. إضافة 1 مل / جيد الزلال 2٪ المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. إزالة BSA التي تقلب بحزم لوحة. غسل بإضافة 2 مل PBS.
  4. جمع طاف الفيروسي عن طريق تحويل وسائل الإعلام من كل HEK293T PDL لوحة في أنبوب 250 مل الطرد المركزي وتدور 10 دقيقة في 500 ز س.
  5. نقل بعناية الفيروسي سوpernatant إلى الطازج 250 مل أنبوب الطرد المركزي، ويجري التأكد من عدم تعكير صفو بيليه الخلية التي ربما تكون قد تشكلت.
  6. إضافة TCM جديدة لطاف الفيروسية مثل أن الحجم النهائي هو 3 مل أكثر من المبلغ المطلوب للآبار RHFF المغلفة. على سبيل المثال، على 192 بئرا RHFF المغلفة، وجلب حجم طاف الفيروسي إلى 192 + 3 = 195 مل مل.
  7. إزالة splenocytes مثقف من الحاضنة و resuspend من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا من 2 - 3 مرات في كل بئر. نقل إلى المخروطية 250 مل. إذا باستخدام ماصة متعدد القنوات، وذلك باستخدام خزان معقم مسبق لنقل سيساعد على تسريع هذه الخطوة. عد كما هو موضح سابقا وتدور في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  8. إضافة rhIL-2 لطاف الفيروسي بتركيز 50 وحدة دولية / مل. على سبيل المثال، إضافة 50 × 195 = 9،750 وحدة دولية إلى 195 مل من طاف الفيروسي-2 rhIL.
  9. و resuspend splenocytes في طاف الفيروسي في 1 × 10 6 خلية / مل
  10. إضافة 1 مل / بئر خلية طحالية تعليق لRHFF المغلفة 24 لوحات جيدا.
  11. تدور لمدة 90 دقيقة وفقا للإعدادات التالية: 770 x ج، والتسارع = 4، والفرامل / تباطؤ = 0، 32 ° C.
  12. يعد حل TCM مع 50 وحدة دولية / مل rhIL-2. على سبيل المثال، وإعداد TCM 200 حل عن طريق إضافة 10،000 وحدة دولية rhIL-2. إضافة 1 مل من rhIL-2 / TCM إلى كل بئر بعد الطرد المركزي.
  13. الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.

6. CAR T خلية الثقافة والحصاد

أيام 3 و 4:

  1. إذا خلايا T تحقيق> 80٪ التقاء، يمكن تقسيم الخلايا (هذا يحدث عادة بعد يوم 3 أو 4 أيام). لتقسيم الخلايا، الماصة بلطف صعودا وهبوطا في كل بئر 2-3 مرات، والتحرك 1 مل من كل بئر في آبار جديدة من 24-جيدا لوحة جديدة تعالج الأنسجة الثقافة. ثم، إضافة 1 مل من TCM الطازجة مع 50 وحدة دولية / مل IL-2 إلى كل هذا جيدا أن الحجم النهائي هو 2 مل في جميع الآبار.
  2. إذا الخلايا لا تصل> 80٪ التقاء، إجراء تغيير وسائل الاعلام نصف قبل pipetting ببطء قبالة 1 مل من وسائل الإعلام من أعلى كل بئر. تجنب دisturbing خلايا استقر على الجزء السفلي أثناء إزالة وسائل الإعلام. إضافة 1 مل من TCM الطازجة تحتوي على 50 وحدة دولية / مل rhIL-2.

يوم 5:

  1. Resuspend الخلايا T CAR من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا 3 مرات في كل بئر ونقل إلى 250 مل أنبوب الطرد المركزي. تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  2. طاف نضح تماما من دون إزعاج بيليه. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، عد الخلايا كما هو موضح سابقا، ويغسل مع برنامج تلفزيوني للمرة الثانية. A CAR العائد خلية T نموذجي هو حوالي 1 × 10 6 خلايا لكل بئر (8 لوحات خلايا × 24 = 192 بئرا × 10 6 CAR T).
  3. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني بتركيز 5 × 10 7 / مل لحقن 1 × 10 7 في حجم 200 ميكروغرام (على سبيل المثال، عن 192 × 10 6 خلايا CAR T، وغسلها بيليه resuspend في 3.84 مل PBS).

7. CAR إدارة خلية T إلى الفئران الحاملة للورم

يوم 5:

  1. TRANSPOخلايا غ على الجليد لمنشأة الحيوان للحقن في الوريد. تحميل 500-1،000 ميكرولتر إلى حقنة الأنسولين مع 27-31 G إبرة، وضمان أن جميع فقاعات وطرد.
  2. الاستيلاء على الماوس عند قاعدة الذيل ووضع في أنبوب رادع.
  3. سحب الذيل مشدود مع الوريد تواجه صعودا، وأنسل من الإبرة حوالي 1-2 ملم تحت الجلد في الوريد عن طريق إدراج ذلك بالتوازي مع الوريد الذيل. طرد ببطء 200 ميكرولتر في الوريد. إذا تم إدخال الإبرة بشكل صحيح في الوريد، فإن حجم التدفق بسهولة في. وإلا لن يكون هناك مقاومة، وسوف تحتاج الإبرة إلى إزالتها من الذيل وإعادة إدراجها بشكل صحيح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم إنشاؤها CAR T الخلايا عن طريق التنبيغ مع EGFRvIII CAR فيروسات ناقلات 11. هذه النواقل، MSGV1، وقد وضعت من متجه SFGtcLuc_ITE4 35، والذي يحتوي على الفيروس الخلايا الجذعية الفئران (MSCV) يكرر الطرفية طويلة، والممتدة المنطقة هفوة والمغلف الموقع لصق (لصق المانحة، والتنمية المستدامة، ولصق متقبل، سا)، والفيروسية إشارة التعبئة والتغليف (ψ). وCAR EGFRvIII تحتوي على مكافحة EGFRvIII سلسلة واحدة جزء البشري متغير (scFv) 139، جنبا إلى جنب مع CD8TM الفئران والمناطق داخل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد تم تصميم الجدول الزمني العلاج الموصوفة هنا إلى النموذج القياسي السريري الرعاية والاستفادة من آثارها لCAR العلاج بالتبني. CAR T جرعات خلية، نظم TMZ، وإدارة العلاج الإشعاعي يمكن تعديلها لتعزيز في الجسم الحي T نشاط الخلايا، lymphodepletion، وقتل الورم. نظم TMZ يمكن زيادة لانتاج myeloablation المضيف وزيادة التوسع في خلايا نقل adoptively 30. وعلاوة على ذلك، فإن الآثار lymphodepletive من TMZ يمكن تلخيصها كل جرعة منخفضة (4-6 غراي) واحد جزء الكلي تشعيع الجسم (TBI)،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم للدكتورة لورا جونسون والدكتور ريتشارد مورغان لتوفير بنية الفيروس القهقرية CAR. يشكر المؤلفون أيضا جياو نغيوين على مساعدتها في قياس الجرعات لتشعيع الدماغ بالكامل. تم دعم هذا العمل بمنحة المعاهد الوطنية للصحة NCI 1R01CA177476-01.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ناقل تغليف pCL-Eco RetrovirusImgenex10045Pناقل مساعد لتوليد الفيروس القهقري
CAR Concanavalin ASigma AldrichC2010ميتوجين غير محدد للحث على تكاثر الخلايا التائية ونقل الفيروس
RetronectinClonTech / TakaraT100Bيسهل نقل الفيروسات القهقرية للخلايا
التائية Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019كاشف الإرسال
DMEM ، الجلوكوز العالي ، تقنيات الحياة المرتفعة11995-065HEK293 وسائط الثقافة
RPMI 1640Life Technologies11875-093وسائط زراعة الخلايا
التائية Opti-MEM I تقنيات مصل متوسطالعمرمخفضة 11058-021وسائط الإرسال
200 ملي مولار تقنيات L-GlutamineLife25030-081مكمل وسائط زراعة الخلايا التائية
100 ملي مولار تقنيات حياة بيروفات الصوديوم11360-070مكمل وسائط زراعة الخلايا التائية
100X MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية تقنياتالحياة11140-050مكمل وسائط زراعة الخلايا التائية
55 ملي مولار 2-Mercaptoethanolتقنيات الحياة21985-023عامل اختزال لإزالة الجذور الحرة
البنسلين الستربتومايسين (10,000 U / ml)تقنياتالحياة 15140-122مكمل وسائط زراعة الخلايا التائية
جينتاميسين (50 مجم / مل)تقنيات الحياة15750-060مكمل وسائط زراعة الخلايا التائية
GemCell من أصل الولايات المتحدة مصل الأبقارالجنين الجوزاء المنتجات الحيوية100-500يوفر عوامل النمو والمواد المغذية ل in vitro < / em> نمو الخلايا
ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، Fraction V & ndash ؛ منتجات الجوزاء الحيويةالقياسية 700-100Pتمنع الارتباط غير المحدد للفيروسات القهقرية بألواح مطلية بالرجعية فارم
ليز (تركيز 10x) BDBiosciences555899Lyses خلايا الدم الحمراء أثناء معالجة خلايا الطحال
70 مو ؛ م مصافي الخلايا المعقمةCorning352350تقوم بتصفية جزيئات الأنسجة الكبيرة أثناء معالجة خلايا الطحال
أطباق ثقافة BioCoat 100 مم مع Poly-D-LysineCorning356469يعزز التصاق خلايا HEK293 لزيادة التكاثر بعد التعدي
TemozolomideBest PharmatechN / Aمسحوق مجفف بالتجميد أعد في يوم الإعطاء
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما علوم الحياةD2650ضروري للذوبان الكامل للتيموزولوميد
محلول ملحيHospiraIM 0132 (5/04)مذيب للتيموزولوميد والكيتامين / الزيلازين
كيتاثيسيا هيدروكلوريكهنري شاين صحة11695-0701-1محلول الكيتامين
AnaSedLloyd IncN / Aمحلول زيلازين معقم 100 مجم / مل
من الدرجة < td colspan = "4" > [header]

المراجع

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الرعاية القياسية لورم الأرومة الدبقيةالتشعيع بالتيموزولوميدترانسدكشن النواقل الارتجاعيةهندسة الخلايا التائية الفأريةاستهداف مستضد EGFRvIIIالتشعيع الكامل للدماغبروتوكول تهيئة المضيفتحليل قياس التدفق الخلويالعلاج التبني للخلايا التائية
جيل من الخلايا T CAR للعلاج بالتبني في سياق ورم أرومي دبقي مستوى الرعاية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.