التجريبية الزرق المستحث بواسطة حقن العيني من المجهرية المغناطيسي

ملخص

نقدم طريقة لإحداث ضغط مرتفع داخل العين (IOP) ، عن طريق حقن كريات مجهرية مغناطيسية في عين الفئران ، لنمذجة الجلوكوما. هذا يؤدي إلى ارتفاع الضغط القوي ، وموت الخلايا العصبية على نطاق واسع. هذا البروتوكول سهل التنفيذ ، ولا يتطلب تكرار الحقن ، وينتج ارتفاعات مستقرة طويلة الأمد في IOP.

الملخص

يعتمد التقدم في فهم الفيزيولوجيا المرضية ، وتوفير علاجات جديدة للجلوكوما على نماذج حيوانية جيدة للمرض. نقدم هنا بروتوكولا لرفع ضغط العين (IOP) في الفئران ، عن طريق حقن كريات مجهرية مغناطيسية في الغرفة الأمامية للعين. يسمح استخدام الجسيمات المغناطيسية للمستخدم بمعالجة الخرزات في زاوية القزحية القزحية ، مما يوفر حصارا فعالا للغاية لتدفق السوائل من الشبكة التربيقية. هذا يؤدي إلى ارتفاع IOP طويل الأمد ، وفي النهاية موت الخلايا العصبية في طبقة الخلايا العقدية (GCL) بالإضافة إلى أمراض العصب البصري ، كما هو موضح في مرضى المرض. هذه الطريقة سهلة التنفيذ ، لأنها لا تتطلب آلات أو مهارات جراحية متخصصة أو ساعات طويلة من الممارسة لإتقانها علاوة على ذلك ، فإن ارتفاعات الضغط قوية للغاية ، ولا يلزم عادة إعادة حقن الكريات المجهرية المغناطيسية على عكس بعض الطرز الأخرى التي تستخدم الخرز البلاستيكي. بالإضافة إلى ذلك ، نعتقد أن هذه الطريقة مناسبة للتكيف مع عين الفأر.

المقدمة

الزرق الأساسي هو مرض العين المدمر تؤثر يقدر ب 60500000 الناس في جميع أنحاء العالم ^1، والذي يمكن أن يؤدي إلى تغيير الحياة وفقدان البصر والعمى ^2. البحث في آليات المرض، وتطوير علاجات جديدة للزرق، تعتمد على نماذج جيدة من هذا المرض الذي ألخص بعض من السمات المميزة لعلم الأمراض.

نقدم هنا نموذجا الزرق الفئران على أساس طريقة Samsel وآخرون. ³ ويتمثل الهدف العام من هذه التقنية هو زيادة ضغط العين (IOP) في العين عن طريق حقن المجهرية المغناطيسية في الغرفة الأمامية، وباستخدام رنين مغناطيسي، مباشرة لهم في زاوية القزحية القرنوية. هذا يعوق تدفق مائي، مما يزيد IOP، مما يؤدي إلى تلف الخلايا العصبية وفقدان الخلية. وقد تم تطوير هذا البروتوكول في محاولة لتوفير أبسط، نموذج محرض من الزرق.

قد يكون هذا البروتوكول بعض المزاياعلى التقنيات الموجودة. هي المتاحة، والتي لا تتطلب إجراءات لبدء نماذج الماوس الوراثية مثل DBA / 2J. ولكن هذه قد يكون لها بداية لا يمكن التنبؤ به من تطور المرض ^(4). في المقابل، نماذج محرض، وهي في معظمها تعتمد على رفع جراحيا IOP في القوارض، لديها ميزة أن الشروع يمكن التحكم من قبل المستخدم. بعض من هذه الأساليب قد يكون لها عيوب خاصة بهم مع ذلك، بما في ذلك كونه تحديا تقنيا ^5، ويمكن أن تتطلب إجراءات متعددة للحفاظ على IOP ارتفاع ^6.

في المقابل، فإن طريقة محرض بالتفصيل في هذه المخطوطة هي تقنية بسيطة وفعالة، وقابلة للتكرار أن تنتج، ويزيد من قوة مستقرة في الضغط، مع الحد الأدنى من الحاجة إلى إعادة حقن. بالإضافة إلى ذلك، أنها لا تنطوي على معدات باهظة الثمن، ويتطلب فقط المهارات الجراحية الأساسية لأداء. قد يكون هذا البروتوكول المناسب للقراء الذين يتطلعون لاقامة تطالب أقل من الناحية الفنية محرضنموذج الزرق في المختبرات الخاصة بهم.

البروتوكول

بيان الأخلاق: تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان (IACUC)، وتمت الموافقة في اتفاق مع المبادئ التوجيهية المملكة المتحدة وزارة الداخلية ( http://goo.gl/FLkirW ، بالرجوع إليه آخر مرة 10 ^يونيو ، 2014) وبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية ( http://goo.gl/4LFOjD ، بالرجوع إليه آخر مرة 10 ^يونيو، 2014).

1. بصري ارتفاع ضغط الدم التعريفي

1. حمل الزرق التجريبي رفع ضغط العين (IOP) عن طريق الحقن من جانب واحد المجهرية ممغطس في الغرفة الأمامية من الفئران براون النرويج، استنادا إلى طريقة Samsel وآخرون قد تكون ³ الفئران مصطبغة أخرى مناسبة، على الرغم من أن هذه سوف تحتاج إلى التحقق من صحة لأول مرة من قبل المستخدم.
2. منزل 250-300 غرام أنثىالفئران السابق مربي براون النرويج في بيئة الإضاءة المنخفضة الدائمة (40-60 لوكس) للحد من تقلبات نهاري في IOP ^7، مع الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
3. أخذ قياسات IOP الأساسية في الحيوانات مستيقظا ⁸ قبل التخدير وحقن حبة، وذلك باستخدام مقياس توتر العين انتعاش معايرة للاستخدام في العين الفئران ^9. يؤخذ IOP كما يعني من خمس قراءات.
4. تخدير الفئران مع 37.5 ملغم / كغم من الكيتامين، و 0.25 مغ / كغ medetomidine هيدروكلوريد تسليمها البريتونى. تأكيد عمق التخدير عن طريق اختبار ردود الافعال القدم الخلفية الحيوان، وذلك قبل تطبيق البوفيدون اليود (راجع الخطوة 1.5)، وحقن حبة (راجع الخطوة 1.8). إدارة 0.5٪ بروباراكايين هيدروكلوريد لتسكين الألم.
   ملاحظة: لا تمدد التلميذ في أي مرحلة. وهذا سوف يساعد حبات ليستقر أفضل في زاوية القزحية القرنوية، ومنع ملزم من العدسة. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف القرنية على تديرها الامم المتحدة العين المقابل.
5. Wالرماد العين المنطوق مع 5٪ البوفيدون اليود في الماء ¹⁰ 5 دقائق قبل الحقن.
6. بعد 5 دقائق، الفتيل والبوفيدون اليود قبالة باستخدام شاش معقم، وغسل العين مع 0.9٪ محلول ملحي معقم. إبقاء العين رطبة أثناء التخدير مع التطبيق المنتظم للملحي معقم.
7. وضع المغناطيس حلقية حول العين.
8. ضخ 25 ميكرولتر من محلول يحتوي على 30 ملغ / مل من أشعة غاما تشعيع تعقيمها 8 ميكرون المجهرية المغناطيسية في محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) في الغرفة الأمامية، وذلك باستخدام إبرة مشطوف 33 G.
   1. لإعداد الخرز، وغسل خلال اعادة وقف، ثم الطرد المركزي 3 مرات في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق مع 1 مل HBSS، قبل أن يقدم 30 ملغ / مل الحل النهائي. الحفاظ على ظروف معقمة طوال الوقت.
   2. للحقن، وتوخي الحذر لتجنب إدخال الإبرة إلى القزحية، للحد من خطر الصدمة القزحية. هذا يمكن الوقاية منها عن طريق ويوجه الإبرة عرضية على سطح القرنية، كما موازية لالقزحية وقت ممكن. وهذا سوف يساعد أيضا على تقليل الخسائر حبة من موقع الحقن.
      ملاحظة: حقن الخرز بمعدل سريع لضمان حتى التوزيع في جميع أنحاء زاوية القزحية القرنوية، وهو أمر حاسم في رفع IOP. بالإضافة إلى ذلك، الخرز متجر، والإبر والحلقات المغناطيسية بشكل منفصل بحيث لا تشكل حبات العناقيد، مما يجعل من الصعب تحميل في حقنة وحقن، ولا تصبح الإبرة الممغنطة.
9. ترك الإبرة في مكانها لمدة 1 دقيقة بعد الحقن لضمان أن حبات تستقر في الزاوية القزحية القرنوية لعرقلة الصرف المائي من الشبكة التربيقية. قليلا زاوية إبرة بعد الخرز وقد استقر في البداية للسماح لبعض تسرب مائي، للحد من الزيادات العابرة في IOP. في نهاية عملية جراحية مسح الإبرة من خلال مع الفوسفات الأولى مخزنة المالحة (PBS)، ثم الايثانول 70٪، تليها الماء المقطر، لضمان استمرار استخدام الإبرة في إجراءات منفصلة. بدلا من ذلك، يمكن للمرء استخدامالإبر المتاح إذا كان مقياس الصحيح والمحاقن الجمع هو متاح. ويمكن شحذ الإبر باستخدام beveller لإطالة استخدامها: اختياري.
10. في هذه المرحلة إذا لزم الأمر، وإزالة المغناطيس، واستخدامها لرسم حبات في مناطق التغطية غير مكتملة.
11. ترك المغناطيس في مكان حول العين لمدة 10 دقيقة بعد الحقن لضمان مزيد من الخرز تستقر بشكل جيد في زاوية القزحية القرنوية.
12. التخدير العكسي باستخدام 0.25 مغ / كغ atipemezole هيدروكلوريد.
13. إدارة الكلورامفينيكول، أو مرهم مضاد حيوي آخر، على سبيل المثال الجنتاميسين أو طرمايسين موضعيا لمنع العدوى، و 0.5٪ هيدروكلوريد بروباراكايين لتسكين الألم. ترك الحيوانات لاسترداد على حصيرة الحرارة حتى استعادة الحركة، ثم نقل إلى مربع دافئ والعرض مع تغذية إضافية، مثل المكملات الغذائية أو مبلل حمية منتظمة حتى الشفاء الكامل. وينبغي إيلاء تسكين النظامية أو المحلي على الحيوانات التي تظهر علامات الألم 24 ساعة بعد الجراحة. إذا تسااستمرت الأعراض ه على الرغم من العلاج، والحيوانات يجب اعدام إنسانية.
14. استخدام العين المقابل كعنصر تحكم unoperated.
15. أخذ قياسات IOP كل 2-3 أيام بعد إعطاء حبة، وكل 2-3 أيام بعد ذلك باستخدام مقياس توتر العين انتعاش معايرة للاستخدام في العين الفئران ^9.
16. معايير بما في ذلك العينين في الدراسات يمكن أن تكون: إذا 1) IOP مرتفعة فوق السيطرة على ضغط المقابل بنسبة 5 مم زئبق، و2) لا تتجاوز 60 مم زئبق.
17. عيون حيث لا ينبغي أن تدرج يعود الضغط إلى خط الأساس (عادة بنسبة 1 في الاسبوع بعد الحقن) في الدراسات، إلا أنه من الممكن إعادة حقن الخرز في العيون التي تفشل في تطوير IOP عالية اذا شئت.
18. الموت ببطء الحيوانات CO ₂ الاختناق في نهاية التجربة.
19. تشريح العين والأعصاب البصرية، وإصلاح في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) بين عشية وضحاها لمزيد من التحليل النسيجي.

2. تقييم الشبكية العصبية الأضرار عن طريق TUNEL Staining

1. لتحديد الخلايا أفكارك في جبل بأكمله retinasuse في deoxynucleotidyl محطة بوساطة ترانسفيراز dUTP نيك وضع العلامات (TUNEL) الفحص، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
2. تشريح شبكية العين من الكأس العين، وغسل لمدة 3 × 5 دقائق في 0.3٪ تريتون X-100 في الفوسفات مخزنة المالحة (T-PBS).
3. Permeabilize الأنسجة في 3٪ T-PBS لمدة 2 ساعة.
4. قبل تتوازن شبكية العين في موازنة العازلة لمدة 10 دقيقة، قبل الحضانة في TUNEL محلول التفاعل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
5. غسل الأنسجة لمدة 3 × 5 دقائق في 0.3٪ T-PBS، وشطف في 0.3٪ T-PBS تحتوي على 5 ميكرومتر دابي، وشقة جبل في وسائل الإعلام المتصاعدة.
6. لتحديد نوى إيجابية TUNEL استخدام المجهر متحد البؤر أن تأخذ 10 ميكرون ض أكوام من خلال طبقة الخلايا العقدية في 20X التكبير. يستغرق 3 الصور على كل من 4 بتلات، في مواقع قريبة من العصب البصري، في منتصف المحيط، وعلى هامش بكثير من شبكية العين، وإعطاء ما مجموعه 12 صورة في مون كلهر، وأخذ العينات حوالي 7،000 الخلايا. معايير شكلية تميز غير العصبية (البطانية والدبقية) الخلايا من الخلايا العصبية.
7. حدد مجالات التصوير فقط باستخدام قناة دابي، والمحققين قناع لمجموعات العلاج.

3. تقييم تلف العصب البصري عن طريق طولويدين الأزرق تلطيخ

1. إصلاح الأعصاب البصرية بين عشية وضحاها في حل Karnovsky لفي 4 درجات مئوية.
2. علاج العينات لمدة 2 ساعة في 1٪ (ث / ت) رباعي أكسيد الأوزميوم ثم يذوى في الإيثانول بنسبة 100٪.
3. احتضان الأعصاب البصرية في أكسيد البروبيلين لمدة 30 دقيقة، ووضع في 50:50 خليط من أكسيد البروبيلين: بين عشية وضحاها araldite.
4. تغيير هذا الحل إلى 100٪ araldite، تليها الحضانة بين عشية وضحاها في 60 ° C.
5. قطع semithin أقسام (0.75 مم) وصمة عار مع 1٪ طولويدين الأزرق / البوراكس (TB) في 50٪ من الإيثانول قبل الفحص بواسطة المجهر الضوئي.

4. التحليل الإحصائي

1. تنفيذ آنا الإحصائيlyses باستخدام حزمة البرامج الإحصائية المناسبة. A-اتجاهين ANOVA مع اختبار ما بعد خاص-نيومان-Keul ويمكن أن تستخدم لحساب دلالة إحصائية لIOP يتغير مع مرور الوقت.
2. يمكن اعتبار قيمة p من أقل من 0.05 كبيرا.

النتائج

حقن حبات مغناطيسية في زاوية القزحية القرنوية يتسبب باستمرار ارتفاع لفترات طويلة وقوية في الضغط (الشكل 1)، والذي كان يمكن ملاحظتها بسهولة في نقطة لأول مرة، 3 أيام بعد الحقن. وعلاوة على ذلك، تم الإبقاء على الزيادة في الضغط طوال مدة التجربة، وعلى الرغم بالطبع قتنا انتهى في 18 أيام بعد الحقن، وذكر آخرون أن يستمر الضغط على المدى الطويل ^3. بلغ متوسط ​​متوسط ​​IOP على طول الكامل للتجربة للسيطرة، وكانت عيون حقن غير حبة-19.7 ± 0.3 مم زئبق، مقارنة مع 40.5 ± 2.8 مم زئبقي للعيون حقن حبة (P <0.001). بالإضافة إلى ذلك، زيادة الذروة IOP من 22.8 ± 0.3 مم زئبق إلى 49.9 ± 2.3 ملم زئبقي.

لتحديد ما إذا كان الارتفاع في IOP يؤدي إلى موت خلايا الشبكية العقدة، أجرينا TUNEL تلطيخ على شبكية العين، والأنسجة على المقاطع العرضية العصب البصري (الشكل 2). في شبكية العين لاحظنا زيادة في TUNEL تلطيخ (الشكل 2A) في عيون حقن حبة مع IOP مرتفعة. ارتفع عدد نوى أفكارك حوالي 15 أضعاف، من 1.6 ± 0.5 الخلايا في الضوابط المقابل، إلى 24.5 ± 0.5 الخلايا في شبكية العين ارتفاع ضغط الدم (الشكل 2B؛ P <0.05). وعلاوة على ذلك، في عيون التي حقنت حبات مغناطيسية ولكن لم لا تزيد الضغط (على الأرجح بسبب انسداد غير كامل من زاوية القزحية القرنوية)، كانت أعداد خلايا TUNEL إيجابية لا تختلف كثيرا عن تلك الضوابط uninjected (P> 0.05). هذا يشير إلى أن موت الخلايا كان مرتبطا إلى زيادة الضغط، وليس بسبب سمية مباشرة للالمجهرية المغناطيسية. وأخيرا، فإننا التحقيق البصري علم الأمراض العصبية في نموذج الزرق، ورأيت تراكم طولويدين الأزرق في العديد من المحاور، مشيرا إلى انحطاط هذه العمليات الخلوية (الشكل 2C).

لدى عودتهم 1 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. ارتفاع ضغط العين باستخدام المجهرية المغناطيسية. حقن المجهرية المغناطيسية في الغرفة الأمامية التي يسببها لذلك، الارتفاع الكبير قوي في ضغط العين (IOP) بالمقارنة مع السيطرة المقابل، عيون غير المحقونة. وحدات Y-محور = ملليمتر من الزئبق (ملم زئبقي). البيانات = يعني ± SEM. * = P <0.001، تم تعديل N = 12. وهذا الرقم من فوكستون وآخرون، AM. J. Pathol 182 (4): 1379-1390.

الشكل 2. الارتفاع من IOP عن طريق الحقن المجهرية المغناطيسية في زاوية القزحية القرنوية، التي يسببها موت الخلايا العصبية في طبقة الخلايا العقدية (GCL). (A) صور الممثل شبكية العين من سيطرة (اليسار) والجلوكوما (يمين) عيون الملون للنوى أفكارك التي كتبها TUNEL (الخضراء.السهام البيضاء) ودابي (الأزرق)، مما يشير إلى زيادة عدد نوى أفكارك كما ارتفع IOP. (B) الكمي لخلايا إيجابية TUNEL في GCL، وتبين أن عيون مع ارتفاع IOP (وسط)، وكان الخلايا بشكل ملحوظ أكثر أفكارك في المقارنة ل التحكم (يسار). في المقابل، في عيون حقن حبة حيث لم يرتفع الضغط (إلى اليمين)، لم يلاحظ أي زيادة كبيرة في TUNEL تلطيخ. البيانات = يعني ± SEM. * = P <0.05، N = 7-8 (C) صور الممثل البصري تلطيخ العصبية، مما يدل على زيادة في تراكم طولويدين الأزرق (الأسهم السوداء) في محاور التالفة من الجلوكوما (يمين)، ولكن ليس السيطرة عيون (يسار). الحانات النطاق = 50 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من فوكستون وآخرون، صباحا. J. Pathol 182 (4): 1379-1390.

المناقشة

نحن هنا لشرح طريقة لإحداث IOP مرتفعة في الفئران، عن طريق حقن المجهرية المغناطيسية في الغرفة الأمامية للعين. وهذه طريقة بسيطة للقيام بها، ويتطلب خبرة جراحية قليلا، أو ساعة من الممارسة والصقل. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء هو فعال؛ نادرا ما يتطلب أكثر من حقنة واحدة من حبات للحث على، وارتفاع قوي قوي في الضغط (ما يقرب من 10٪ معدل إعادة حقن). قد توفر هذه ميزة على أساليب محرض القائمة، مثل الوريد episceral تحديا تقنيا التصلب ¹¹ نموذج، أو الليزر الضوئي بروتوكول ^6، والتي يمكن أن تتطلب إجراءات متعددة لرفع الحفاظ على IOP.

من أجل أن طريقة لتكون ناجحة ومع ذلك، هناك بعض الخطوات الحاسمة الصغيرة التي تحتاج إلى اتخاذها. أولا أنه من المفيد استخدام مغناطيس على شكل حلقية لرسم حبات في زاوية القزحية القرنوية. هذه الخطوة هو تعديل البروتوكول الأصلي، وهره تم حقن حبات في الغرفة الأمامية، ثم انتقل مرفوعة حول العين ^3. باستخدام مغناطيس حلقي يعني أن المجهرية يجب أن تستقر بالتساوي في جميع أنحاء زاوية، والتي تتطلب الحد الأدنى من إعادة توزيع اليدوي. ثانيا، ينبغي أن يكون معدل الحقن بسرعة - بطيئة جدا وسوف الخرز تتراكم في الغالب على جانب واحد من زاوية، مما يؤدي إلى تغطية غير مكتملة، وربما عدم ارتفاع الضغط. وبصفة عامة على الرغم من هذه الطريقة واضحة بما فيه الكفاية أن المستخدم يمكن بسهولة إجراء تعديلات على البروتوكول، مثل متفاوتة الحجم أو حجم الجسيمات المكروية، ربما في محاولة لتغيير درجة ارتفاع IOP.

ومع ذلك، واحد العيب المحتمل للطريقة هو أن على المرء أن سيطرة تذكر على مدى ارتفاع ضغط الدم، والتي ارتفعت في حوالي 5-10٪ من الحالات لاحظنا فوق 60 مم زئبق. ارتفاع المفرطة في IOP يمكن أن تكون مدمرة جدا لأنسجة الشبكية، ويمكن أن تجعل دراسة آليات والبيولوجيةبليد الحركة من موت الخلايا تحديا. ومع ذلك، ينتج الأسلوب علم الأمراض العصبية ثابت، سواء في شبكية العين والعصب البصري، والتي يمكن التلاعب عقاقيري ^12. وهذا قد جعل نموذج جاذبية لتطوير علاجات جديدة لعلاج الجلوكوما. بالإضافة إلى ذلك، لأن الخرز وتوجه إلى زاوية القزحية القرنوية، وهذا يترك محور البصري الحرة للتصوير المباشر لشبكية العين أو البصرية القرص. ونحن نتوقع أن هذا النموذج سيتم تكييفها واستخدامها في التطبيقات المستقبلية في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الماوس.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
250 - 300 جرام أنثى فئران مربية سابقة من براون النرويج Harlan	UK	203
Tonolab Rebound Tonometer	Tiolat	TV02
Ketaset (كيتامين)	فورت دودج صحة		BN1000118 37.5 مجم / كجم
دوميتور (ميديتوميدين هيدروكلوريد)	أوريون فارما	140-999	0.25 مجم / كجم
بوفيدون اليود	Ecolab	BN4369LE10	5٪ في H2< / sub>O
ملحي Minim	Bausch and Lomb	PL00033 / 5017
مغناطيس حلقي	Supermagnete	R-10-07-03-N
الكرات المجهرية المغناطيسية	الانفجارات مختبرات	UMC4N / 9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G إبرة مشطوفة	هاميلتون	7747-01	حقنة طرف إبرة مخصصة
	لهاملتون	80601
أنتيسيدان (أتيبيميزول هيدروكلوريد) أوريون	فارما	141-003	0.25 مجم / كجم
مرهم كلورامفينيكول	ميديكوم	18956-0005
طقم تلطيخ	TUNEL Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield تركيب وسائل الإعلام	Vector Labs	H-1000