يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من

12.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52432

⸱

ديسمبر 19, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

في هذه المقالة ، تم وصف بروتوكول لإصابة الضامة ب Cryptococcus neoformans. أيضا ، يتم شرح طريقة استنفاد الستيرول من الضامة. توفر هذه البروتوكولات دليلا لدراسة الالتهابات الفطرية في المختبر وفحص دور الستيرولات في مثل هذه العدوى.

الملخص

المستخفيات هو عدوى تهدد الحياة التي تسببها الفطريات المسببة للأمراض من جنس المستخفية. تحدث العدوى عند استنشاق جراثيم، والتي هي قادرة على تكرار في الرئة العميقة. البلعمة من المستخفية بواسطة الضامة هي واحدة من الطرق أن هذا المرض هو قادرة على الانتشار في النظام العصبي المركزي لتسبب التهاب السحايا والدماغ القاتل. لذلك، ودراسة العلاقة بين المستخفية والضامة مهمة لفهم تطور العدوى. تصف هذه الدراسة بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة البلاعم العدوى التي كتبها C. الأدعومية في المختبر. باستخدام هذا البروتوكول، ودرس دور الجامدة المضيف على التفاعلات المضيف الممرض. استخدمت سيكلودكسترين (MCD) في استنزاف الكولسترول من الفئران شبكية ساركوما مثل بلعم خط الخلية J774A.1 - تركيزات مختلفة من الميثيل. وأكد استنزاف الكولسترول وكميا باستخدام كل من المتوفره تجاريامواقع الحكومة الإلكترونية عدة الكولسترول الكمي وطبقة رقيقة اللوني. تم تنشيط خلايا الكوليسترول المنضب باستخدام Lipopolysacharide (LPS) والانترفيرون غاما (IFNγ) وإصابة مع opsonized الأجسام المضادة المستخفية المورمة البرية من نوع الخلايا H99 في نسبة المستجيب إلى الهدف 1: 1. تم رصد الخلايا المصابة بعد 2 ساعة من الحضانة مع C. تم حساب الأدعومية ومؤشر على البلعمة. أدى استنزاف الكولسترول في انخفاض كبير في مؤشر البلعمة. البروتوكولات قدمت وتقدم طريقة مريحة لمحاكاة بدء عملية العدوى في بيئة المختبر ودراسة دور تكوين الدهون المضيف على العدوى.

المقدمة

البلعمة هي العملية التي يتم المنضوية كيانات خارج الخلية من قبل الخلايا المضيفة. بل هو سلاح أساسي في ترسانة النظام المناعي للدفاع ضد مسببات الأمراض، ولكن قد تكون في كثير من الأحيان تخريب العملية التي مسببات الأمراض للسماح لاستيعاب ونشر في جميع أنحاء الجسم 1. وبوساطة البلعمة من قبل العديد من الأحداث يشير إلى أن يؤدي إلى التعلق والغمر عن طريق إعادة ترتيب الهيكل الخلوي الخلية المضيفة. البالعات "الفنية" قادرة على إدراك وربط opsonins على سطح الممرض الغازية للإشارة لمرفق وتشكيل أقدام صفاحية التي تبتلع الممرض وتشكيل يبلوع 2. ومن بين ما يسمى البالعات 'المهنية' هم الضامة. الضامة هي خلايا متخصصة للغاية التي تنفذ مهام الحماية التي تشمل السعي إلى القضاء على المرض والعوامل المسببة، وإصلاح الأنسجة التالفة، والتوسط من الالتهاب، ومعظمهذه من خلال عملية البلعمة 1،2.

المستخفية المورمة هي الأنواع من الخميرة الممرضة التي تسبب مرض خطير يعرف باسم المستخفيات. يتم استنشاق الجراثيم المستخفية من قبل المضيف ويؤدي الى عدوى رئوية التي عادة ما تكون أعراض. ويعتقد أن التعرض منتشر للغاية. وقد أظهرت عينة من 61 طفلا من الأمراض المعدية للأطفال عيادة في مركز مستشفى برونكس لبنان وجدت أن كل الذين شملهم الاستطلاع كان الأجسام المضادة للglucuronoxylomannan السكاريد بالمستخفيات وغيرها من الدراسات انتشار في كل من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) غير مصاب والبالغين المصابين 3، 4. الضامة السنخية هي الخط الأول للاستجابة للعدوى رئوية واضح في معظم الحالات بنجاح الممرض. ومع ذلك، في الأفراد المناعة (المرضى على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية والإيدز) الخميرة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الضامة. في هذهالحالات، يمكن للالضامة بمثابة محراب للتكرار من مسببات المرض ويمكن أن تسهل نشرها على الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث يصبح المرض قاتلا 5-8. ويعتقد أن الضامة حتى يمكن تقديم الخميرة مباشرة في السحايا، مما يساعد الخميرة لعبور حاجز الدم في الدماغ عن طريق "حصان طروادة" نموذج 3،9 - 11. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم عملية البلعمة والعوامل التي تؤثر عليه، وخاصة في الالتهابات بالمستخفيات.

العمل السابق في أنظمة الممرض أخرى تشير إلى الكولسترول والدهون الطوافات التي شكلتها الكولسترول وجود دور هام في البلعمة 12-15. الكولسترول هو النوع الأكثر وفرة الدهون في خلايا الثدييات، وتضم 25 - 50٪ من غشاء الخلية الثدييات 16. وقد وجد أن تلعب دورا في تحوير BIOPخصائص hysical الأغشية عن طريق تغيير صلابة من 17. الكولسترول والإسفنجية تشكل معا microdomains الدهون داخل غشاء المعروفة باسم الطوافات الدهنية. تم العثور على الطوافات الدهنية أن تشارك في تشكيل caveolae، فضلا عن توفير مجال معزولة لأنواع معينة من إشارات 16-18. نظرا لصغر حجمها، فمن الصعب لدراسة الطوافات الدهنية في الجسم الحي. طريقة واحدة مفيدة لدراسة دور الطوافات الدهنية هو تغيير ناخبيهم. الميثيل-β-سيكلودكسترين (MβCD) هو مركب التي تم العثور عليها في استنزاف الكولسترول من الأغشية الثدييات ويستخدم عادة لدراسة دور الطوافات الدهنية 18.

في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة لاستنزاف الكولسترول من أغشية الخلية المضيفة وقياس تأثير استنزاف على قدرة الخلايا المضيفة في phagocytose C. الأدعومية في المختبر. هذا الإجراء يجعل من استخدام زراعة الخلايا TECHNIQUES على البلاعم خلد مثل خط الخلية (J774A.1) كنموذج للعدوى. تم انجازه استنزاف الكولسترول عن التعرض لMβCD، والذي له نواة مسعور محدد لحجم الجامدة وغير قادرة على بمثابة بالوعة للالكولسترول لاستدراجه للخروج من غشاء 19. وقد تم قياس نضوب الكولسترول كميا باستخدام عدة المتاحة تجاريا ونوعيا باستخدام بلي-داير استخراج الدهن تعديل تليها طبقة رقيقة اللوني (TLC) 20. . تم قياس البلعمة عن طريق إصابة خط الخلية مع ثقافة الخميرة opsonized مختلطة مع كوكتيل من انترفيرون γ وlipopolysaccharide في تفعيل الضامة وopsonized المستخفية باستخدام glucuronoxylomannan (GXM) الأجسام المضادة 21-23. تلطيخ والتجارب المجهري سمحت لرؤية الخلايا وحساب مؤشر أكلة لتقييم درجة البلعمة. أخذت معا، وهذا البروتوكول دescribes طريقة الأساسي الذي يدمج تغيير تركيبة الدهون مع عملية الفسيولوجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الكولسترول استنفاد الخلايا J774A.1 مع MβCD

  1. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 5 J774A.1 الخلايا الشبيهة بلعم لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S). احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 O / N.
  2. إزالة وسائل الاعلام من أحادي الطبقة الخلية وغسل الخلايا مرتين مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تم تصفيتها أو تعقيمها.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من حل MβCD في تركيز (10 ملم أو 30 ملم في PBS) أو برنامج تلفزيوني 1X على النحو المرغوب فيه السيطرة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C مع اهتزاز. إزالة طاف والاحتياطي في RT للتحليل الكمي مع عدة المتاحة تجاريا باتباع الإجراء على الفور.
  4. غسل الخلايا مرتين إلى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X أو المصل DMEM مجانا وتواصل مع العدوى أو ليز الخلايا عن طريق pipettiنانوغرام مرتين إلى ثلاث مرات مع H 2 O منزوع الأيونات لتحليل مع طبقة رقيقة اللوني أو مع عدة.
    ملاحظة: بعد نضوب الكولسترول والمتاحة تجاريا عدة الكولسترول الكمي يمكن استخدامها. انظر القسم المواد للحصول على التفاصيل. اتبع تعليمات الشركة الصانعة كما هو مكتوب.

2. مراقبة من الكولسترول المحتوى من قبل اللوني طبقة رقيقة (TLC)

  1. غسل خزان TLC مرتين مع الأسيتون ومرة ​​واحدة مع محلول الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم). تشبع الخزان مع الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم) حل وترك O / N.
    ملاحظة: يجب دائما العضوية المذيبات أن تستخدم تحت غطاء الدخان لمنع استنشاق بخار. يجب ارتداء القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات. حمض الخليك هو حمض قوي وينبغي أن تستخدم بحذر.
  2. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 6 J774A.1 مثل بلعم الخلايا لكل بئر على م 6-جيدالوحة الثقافة ليرة لبنانية في حجم 5 مل من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 O / N.
  3. المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4، استبدال 1 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من التربسين-EDTA إلى كل بئر، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية، وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية.
  5. نقل إلى أنبوب microfuge وإضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S.
  6. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ج وإزالة طاف.
  7. إضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S إلى الخلية بيليه و resuspend بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  8. إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا والعد الخلايا على عدادة الكريات. تطبيع تركيزات خلية من كل عينة وإضافة عدد متساو من الخلايا لأنابيب زجاجية.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن للمرءاختيار الجمع بين الخلايا من مجموعات العلاج نفسه للحصول على أكثر تركيزا النهائي استخراج الدهون.
  9. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT وإزالة وسائل الإعلام.
  10. إضافة 2 مل من الميثانول ودوامة. ثم، إضافة 1 مل من الكلوروفورم ودوامة. التحقق من حالة المرحلة للتأكد من الحل في الطور.
    ملاحظة: أنابيب يمكن تخزينها في 4 درجات CO / N.
  11. أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة في RT ونقل طاف لأنبوب جديد
  12. إضافة 1 مل إضافية من كلوروفورم تليها 1 مل من درهم 2 O. دوامة مرتين لمدة 30 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  13. تزن أنبوب زجاجي على ميزان حساس واستخدام ماصة باستير الزجاج لنقل المرحلة الدنيا في أنبوب زجاجي من الوزن المعروفة.
  14. تجف أسفل الدهون في المبخر الطرد المركزي حتى تجف (حوالي 2 ساعة). تزن أنبوب مع الدهون المجففة وحساب الوزن الدهون الجاف.
    ملاحظة: الدهون الجافة يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لأداء TLC.
  15. تمييع الدهون المجففة في الكلوروفورم يكفي لتطبيع تركيز الدهون (عادة 20-50 ميكرولتر) وتحميل 20 ميكرولتر من الدهون المخففة على TLC لوحة السيليكا. تحميل 20 ميكروغرام من الكولسترول مخففة في 20 ميكرولتر من كلوروفورم كمعيار.
  16. إضافة المجففة لوحة TLC إلى خزان TLC المشبعة والسماح مذيب للهجرة يصل إلى 1 سم قبل وحة الحافة. إزالة TLC لوحة من دبابات واتركه حتى يجف حوالي 5 دقائق.
  17. تصور الدهون عن طريق وضع في خزان بخار اليود للتحقق الهجرة. إزالة البقع والسماح لتتلاشى لحوالي 10 - 15 دقيقة تحت غطاء محرك السيارة.
    ملاحظة: اليود هو خطر استنشاق. استخدام دائما تحت غطاء الدخان.
  18. يعد حل لتلطيخ محايد الدهون عن طريق الجمع بين 60 مل من الميثانول مع 60 مل من H 2 O منزوع الأيونات، 4 مل من حمض الكبريتيك، و 630 ملغ من كلوريد المنغنيز.
  19. بعناية وببطء تراجع لوحة TLC في حل الدهون تلطيخ محايد في علبة وازالة دون النزع قبالة السيليكا لآير.
    ملاحظة: الحل الدهون تلطيخ محايد يمكن إعادة استخدامها عدة مرات وبحيث يمكن استرجاعها من علبة وضعها مرة أخرى في زجاجة لاستخدامها لاحقا.
  20. تسمح لوحة لتجف تحت غطاء محرك السيارة في RT حتى اختفت جميع فقاعات. تسخين لوحة TLC على مجموعة كتلة الحرارة إلى 160 درجة مئوية، وشار إلى اللون المطلوب.
    ملاحظة: برنامج قياس كثافة مثل LS الرؤية الأشغال يمكن استخدامها لقياس العصابات المتفحمة لمقارنة عينات الدهون.

3. إصابة الضامة مع C. الأدعومية (H99)

  1. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 خلايا تشبه البلاعم 5 لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 5٪ CO 2 O / N.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم العدوى في الزجاج القاع أطباق مبائر لتسهيل التصوير. لا تزال جميع المبالغ نفسها.
  2. تنمو ثقافة C. الأدعومية (H99)، فحقن 10 مل من YNB مع مستعمرة واحدة تم الحصول عليها من لوحة ضرب واحتضان أنه O / N عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز.
  3. غسل والاعتماد C. الأدعومية (H99) الخلايا.
    1. الطرد المركزي C. الأدعومية O / N الثقافة في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    2. إزالة وسائل الاعلام وتجاهل. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. إزالة برنامج تلفزيوني ويغسل مع 5 مل من تصفيتها برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر.
    4. إزالة PBS و resuspend في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
    5. جعل التخفيف المتسلسل في برنامج تلفزيوني للحصول على 1: 500 التخفيف من ثقافة غسلها.
      1. إضافة 100 ميكرولتر من العينة الأصلية إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول 1:10 التخفيف.
      2. إضافة 100 ميكرولتر 1:10 عينة المخفف إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 100 التخفيف.
      3. إضافة 200 ميكرولتر من 1: عينة المخفف 100 إلى 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 500 dilutiفي
    6. يستغرق 10 ميكرولتر من 1: 500 التخفيف والاعتماد على عدادة الكريات لحساب عدد من الخلايا.
  4. يعد حل يعملون لتفعيل الضامة وopsonizing C. الأدعومية.
    1. تمييع LPS وIFNγ 100X من الحلول الأسهم من خلال إضافة 10 ميكرولتر إلى 990 ميكرولتر.
      وتستخدم LPS وIFNγ لتعزيز امتصاص أكلة ولكن ليست مطلوبة لالبلعمة: ملاحظة. إذا كان هناك مصلحة في النشاط فطريات الضامة، نفذ تفعيل O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قبل الإصابة.
    2. في عينة الجمع بين 7.5 ميكرولتر من LPS المخفف، 1.25 ميكرولتر من المخفف IFNγ، 1.25 ميكرولتر من GXM الأجسام المضادة وحجم C. ثقافة الأدعومية الذي يعطي 1.25 × 10 5 الخلايا. جعل حجم ما يصل الى 250 ميكرولتر مضروبا عدد العينات مع DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S.
    3. دوامة واحتضان الحل لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز.
      ملاحظة:نضوب الكولسترول (الخطوات 1،2-1،4) يمكن أن يتم بالتزامن مع خطوة طهاية. تأكد لعلاج الضامة قبل الجمع بين حل العاملة، حيث أن خلايا opsonized يجب أن تستخدم على النحو الأمثل لم يعد من 20 دقيقة بعد الحضانة خطوة 3.4.3.
  5. إصابة الضامة
    1. الضامة غسل مرتين مع المصل DMEM الحرة وإضافة 200 ميكرولتر من opsonized C. حل الأدعومية العمل على كل بئر.
    2. احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  6. الإصلاح وصمة عار الخلايا
    1. إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا 2 مرات مع DMEM.
    2. الهواء الجاف أحادي الطبقة خلية لمدة 10 دقيقة وإضافة 200 ميكرولتر من الميثانول الجليد الباردة لإصلاح الخلايا.
    3. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT وإزالة أي الميثانول المتبقية.
    4. إضافة 200 ميكرولتر من 10X بالغيمزا واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
    5. يغسل 2-3 مرات مع الماء منزوع الأيونات وO جاف / N مع غطاء قبالة.
      ملاحظة: التصوير يمكن القيام به في اليوم التالي أو ما يصل إلى followi الأسبوعنانوغرام تلطيخ.
  7. تصور وعدد
    1. باستخدام المجهر، عد 300 خلية لكل نقطة بيانات (إذا كان هناك 2 من نفس المعاملة العد 150 لكل بئر) ولاحظ عدد من الضامة المصابة وعدد الخلايا المستخفية اجتاحت.
      ملاحظة: لضمان حتى أخذ العينات في استخدام نقطة بيانات لوحات 2 في حالة، واختيار 3 مناطق غير متداخلة في لوحة وتعول 50 خلية في المنطقة.
    2. حساب مؤشر أكلة بضرب النسبة المئوية للالضامة المصابة حسب متوسط ​​عدد C. الأدعومية في البلاعم. تطبيع مؤشر أكلة بالإعراب عن القيم كنسبة مئوية من برنامج تلفزيوني 1X تعامل السيطرة. بعد عدة محاكمات حساب القيمة المتوسطة والانحراف المعياري للمتوسط ​​لتحديد الاتجاهات في مؤشر البلعمة. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية.
    3. اتخاذ الميكروسكوب من الخلايا في 1،000X أو 400X التكبير.

4. التريبان الأزرق الفحص

  1. في خزانة معقمة للسلامة الأحيائية، والبذور 10 6 خلايا تشبه البلاعم لكل بئر على 6 جيدا لوحة الثقافة خلية في حجم 5 مل من Dulbecco والحد الأدنى من المتوسط ​​ضروري (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين . احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 O / N.
  2. المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4 استبدال 2 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر.
    ملاحظة: تأكد من تضمين عنصر تحكم تعامل مع برنامج تلفزيوني 1X فضلا عن التحكم التي يتم كشط قبل أي علاج.
  3. إضافة 500 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية. نقل إلى أنبوب microfuge وتعليق الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
  4. إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا وصمة عار مع 1 ميكرولتر من 4٪ التريبان الأزرق.
  5. عد الخلايا على عدادة الكريات وحساب الجدوى باستخدام المعادلة التالية:٪ الجدوى = [1 - (خلايا الأزرق / مجموع الخلايا)]س 100. القيم تطبيع إلى عنصر التحكم الذي كان دون علاج. بعد عدة محاكمات حساب قيمة المتوسط ​​والانحراف المعياري لتحديد الاتجاهات في قدرتها على البقاء. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الكولسترول استنفاد

تحليل طاف محفوظة في الخطوة 1.3 من البروتوكول باتباع إرشادات الشركة المصنعة في Amplex الأحمر الكولسترول الفحص عدة غلة تركيز مرتفع من الكولسترول في عينة MβCD تعامل على أنها مقارنة بالكنترول برنامج تلفزيوني 1X. اعتمادا على نوع من الخلايا والتركيز MβCD المستخدمة استنزاف الكوليسترول قد تختلف. لJ774 تعامل مع 10 ملي MβCD، لوحظ وجود استنزاف ما يقرب من 50٪. ويمكن حساب استنزاف باستخدام القيم التي تم الحصول ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في العمل مع هذا البروتوكول من المهم الحصول على عدد خلايا دقيقة عندما تصفيح خلايا الثدييات وopsonizing C. خلايا الأدعومية. هذا يقلل من التباين بين التجارب ويضمن ودقيقة 1: 1 هدف إلى نسبة المستجيب طوال فترة الدراسة. فمن الأهمية بمكان لتنسيق توقيت استنزاف الكولسترول والإصابة لمنع خلايا الخميرة opsonized أو خلايا البلاعم المعالجة من يستريح في RT بين الإجراءات أيضا. فترات انتظار طويلة يمكن أن يؤدي إلى فقدان الجسم المضاد طهاية أو يستكمل الكوليسترول المنضب قبل أن تبدأ ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من المنح NIH AI56168، ​​AI71142، AI87541 وAI100631 إلى MDP. ماوريتسيو ديل POETA هو بوروز ويلكوم باحث في مجال الأمراض المعدية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية من النوع A2Labconco3460009
J774A.1 خط الخليةATCCTIB-67يصل مجمدا. انظر تعليمات ATCC للثقافة.
دولبيكو s Modified Eagle MediumGibco11995-065Store at 4 & deg; درجة مئوية ودافئة إلى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
Fetal Bovine Serum Performance PlusGibco10082-147يحفظ مجمدا عند -20 درجة ؛ C والذوبان قبل إضافته إلى DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U / ml)Gibco15140-122تستخدم لاستيعاب
حاضنة ثقافة الخلايا DMEM Isotempفيشر النموذج العلمي# 3530
طبق ثقافة 96 جيداCorning Inc. Costar3595
10x فوسفات مخزن محلول ملحيفيشر الكواشف الحيوية العلميةBP3994خفف إلى 1x وقم بالفلتر أو الأوتوكلاف قبل الاستخدام.
ميثيل بيتا سيكلودكسترينسيجما لايف ساينسC4555-10Gتذوب في 1x PBS لعمل محاليل بتركيزات 10 ملي مولار و 30 ملي مولار شاكر
مداريLabline
Amplex لفحص الكوليسترول الأحمر مجموعةتقنيات الحياة المجسات الجزيئيةA12216جميع الكواشف لفحص الكوليسترول موجودة داخل المجموعة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
96-Well Black Assay PlateCorning Inc. Costar3603
FilterMax قارئ الصفيحة الدقيقةالأجهزة الجزيئيةنموذج F5
TLC غرفةSigma-AldrichZ126195-1EA
ChloroformSigma-Aldrich650498-4L
الميثانولسيجما ألدريتش34860-2L-R
TLC ورقةواتمان3030917قم بتقليل الحجم المطلوب لغطاء
الدخانأي غطاء دخان يتوافق مع معايير AIHA / ANSI
6-Well لوحةCorning Inc. Costar3506
Trypsin-EDTAGibco25300-054
مكشطة الخليةCorning Inc. Costar3010
مقياس الدمHausser Scientific1490
جهاز طرد مركزيبيكمان كولترموديل أليجرا x-30R
خلاط Votexفيشر Scientific12-812
BalanceMettler ToledoModel # MS104S meaures وصولا إلى 0.1 مجم
ماصة زجاجية باستورفيشربراند13-678-20A
كوليسترولأفانتي القطبية الدهون700000
مكثف SpeedVacالنموذج العلميالحراري # SPD2010
الأثير البتروليفيشر ScientificE139-1
ثنائي إيثيل الأثيرسيجما ألدريتش309966
حمض الخليكسيجما ألدريتش320099
TLC هلام السيليكا 60 مع منطقة التركيزالكروماتوغراهي التحليلية ميليبور1.11845.0001
رقائق اليودسيجما ألدريتش376558-50G
حمض الكبريتيكسيجما ألدريتش320501
كلوريد المنغنيزسيجما ألدريتش244589
التصوير UVP EC3منتجات الأشعة فوق البنفسجية المحدودة.استخدم برنامج Vision Works LS لتحليل قياس الكثافة
طبق متحد البؤر القاع الزجاجيMatTekP35G-1.5-10Cwww.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)تم الحصول عليه من المركز الطبي بجامعة ديوك
YNBBD239210انظر الشركة المصنعة للحصول على تعليمات التحضير. استخدم تركيز جلوكوز 20 جم / لتر.
عديدات السكاريد الدهنيةSigmaL4391-1MGتذوب في 1x PBS لصنع 1 مجم / مل من المرق. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
إنترفيرون جاماسيجماI4777يذوب في 1x PBS لصنع 0.1 مجم / مل محلول
مخزون Glucuronoxylomannan الأجسام المضادة (مضاد ل GXM)هدية من تركيز مختبر Arturo Casadevall هو 1.98 مجم / مل
GiemsaMP Biomedicals194591قم بإذابة 0.8 جم من Giemsa في 25 مل من الجلسرين وتسخينها إلى 60 درجة ؛ ج لمدة 1 ساعة. أضف 25 مل من الميثانول إلى المحلول واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة شهر واحد على الأقل.
مجهرZeissObserver.D1 مجهر مع AxioCam MRm لالتقاط الصور
HI لخزان TLC نظام

المراجع

  1. Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
  2. Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
  3. Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173(2012).
  4. Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
  5. Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
  6. Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
  7. Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
  8. Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
  9. Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
  10. García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
  11. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
  12. Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).
  13. Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
  14. Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
  15. Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
  16. Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
  17. Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
  18. Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
  19. Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
  20. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  21. Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
  22. Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
  23. Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).
  24. Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Cryptococcus Neoformans LPS IFN Gamma
بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.