Method Article

تحليل مقارن التعبير المؤتلف البروتين في Biofactories مختلفة: البكتيريا، خلايا الحشرات ونظم النبات

DOI:

10.3791/52459

⸱

March 23rd, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona, Verona, Italy, 2Department of Internal Medicine, University of Perugia, Perugia, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، تمت مقارنة التعبير عن بروتين مؤتلف بشري مستهدف في منصات إنتاج مختلفة. ركزنا على الثقافات التقليدية القائمة على التخمير وعلى النباتات ، ووصفنا إعداد كل نظام وسلطنا الضوء ، على أساس النتائج المبلغ عنها ، على الحدود والمزايا المتأصلة لكل منصة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتعتبر أنظمة المستندة إلى النباتات منصة قيمة لإنتاج البروتينات المؤتلف نتيجة لإمكاناتهم موثقة جيدا لإنتاج مرنة ومنخفضة التكلفة ذات جودة عالية، والمنتجات الحيوية النشطة.

في هذه الدراسة، قارنا التعبير عن هدف البروتين المؤتلف البشري في الثقافات التقليدية القائمة على تخمير الخلية (بكتيريا والحشرات) مع أنظمة التعبير المستندة إلى النباتات، سواء عابرة ومستقرة.

لكل منصة، وصفنا مجموعة المتابعة، والتحسين وطول عملية الإنتاج، وجودة المنتج النهائي والغلة وقمنا بتقييم تكاليف الإنتاج مؤقتة ومحددة لالمؤتلف البروتين الهدف المحدد.

وعموما، نتائجنا تشير إلى أن البكتيريا غير مناسبة لإنتاج البروتين المستهدف بسبب تراكمه داخل هيئات إدراج غير قابلة للذوبان. من ناحية أخرى، وأنظمة المستندة إلى النباتات هي منصات متعددة رقبعة تسمح للإنتاج البروتين المختارة في تكاليف أقل من الفيروسة العصوية / نظام خلية الحشرات. على وجه الخصوص، خطوط المعدلة وراثيا مستقرة عرض أعلى محصول للمنتج النهائي والنباتات التعبير عابرة أسرع عملية التنمية. ومع ذلك، قد يستفيد ليست كل البروتينات المؤتلف من أنظمة المستندة إلى النباتات ولكن ينبغي تحديد أفضل منصة إنتاج تجريبيا مع نهج كل حالة على حدة، كما هو موضح هنا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إنتاج البروتينات المؤتلفة تجاريا بكميات كبيرة في أنظمة التعبير غير المتجانسة بمساعدة أدوات التكنولوجيا الحيوية الناشئة. تشمل العوامل الرئيسية التي يجب مراعاتها عند اختيار نظام التعبير غير المتجانس: جودة البروتين ووظائفه وسرعة العملية والعائد والتكلفة.

في مجال البروتين المؤتلف ، يتوسع سوق المستحضرات الصيدلانية بسرعة ، وبالتالي ، فإن معظم المستحضرات الصيدلانية الحيوية المنتجة اليوم مؤتلفة. يمكن التعبير عن البروتينات في المزارع الخلوية للبكتيريا والخمائر والعفن والثدييات والنباتات والحشرات ، وكذلك في النظم النباتية (إما عن طريق التحول المستقر أو العابر) المعدلة وراثيا. كل نظام تعبير له مزاياه وقيوده المتأصلة ، ولكل بروتين مؤتلف مستهدف ، يجب تقييم نظام الإنتاج الأمثل بعناية.

تنشأ المنصات النباتية كبديل مهم للأنظمة التقليدية القائمة على التخمير لإنتاج البروتين المؤتلف الآمن والفعال من حيث التكلفة. على الرغم من أن تكاليف المعالجة النهائية قابلة للمقارنة مع تكاليف الخلايا الميكروبية والثديية ، فإن الاستثمار الأولي المنخفض المطلوب للإنتاج التجاري في النباتات والاقتصاد المحتمل على الحجم ، الذي توفره الزراعة على مساحات كبيرة ، هي مزايا رئيسية.

< p class = 'jove_content'> قمنا بتقييم النباتات كمفاعلات حيوية للتعبير عن الشكل الإسوي 65 كيلو دالتون من ديكاربوكسيلاز حمض الجلوتاميك البشري (hGAD65) ، وهو أحد المستضدات الذاتية الرئيسية في مرض السكري المناعي الذاتي من النوع 1 (T1D). تم اعتماد hGAD65 إلى حد كبير كعلامة ، سواء لتصنيف ومراقبة تطور المرض ودوره في الوقاية من T1D قيد التحقيق حاليا في التجارب السريرية. إذا نجحت هذه التجارب ، فإن الطلب العالمي على hGAD65 المؤتلف سيزداد بشكل كبير.

< p class = 'jove_content'>هنا ، نركز على التعبير عن النظير غير النشط إنزيميا ل hGAD65 ، hGAD65mut ، وهو متحور تم إنشاؤه عن طريق استبدال بقايا اللايسين التي تربط العامل المساعد PLP (بيريدوكسال -5'-فوسفات) ببقايا الأرجينين (K396R) 1.

hGAD65mut يحتفظ بمناعته ، وفي الخلايا النباتية والحشرية ، يتراكم ما يصل إلى عشرة أضعاف أعلى من hGAD65 ، نظيره من النوع البري. تم الافتراض بأن النشاط الأنزيمي ل hGAD65 يتداخل مع عملية التمثيل الغذائي للخلايا النباتية لدرجة أنه يثبط تخليقه الخاص ، في حين أن hGAD65mut ، الشكل غير النشط إنزيميا ، يمكن أن يتراكم في الخلايا النباتية إلى مستويات أعلى.

للتعبير عن hGAD65mut ، تم استكشاف استخدام تقنيات مختلفة ، تستخدم على نطاق واسع في التكنولوجيا الحيوية النباتية ، هنا ومقارنتها بمنصات التعبير التقليدية (الإشريكية القولونية وفيروس باكولوفيروس / خلايا الحشرات).

في هذا العمل ، تمت مراجعة ومقارنة المنصات المؤتلفة التي تم تطويرها للتعبير عن hGAD65mut التي تشتمل على الأنظمة التقليدية والنباتية ومقارنتها على أساس سرعة العملية والعائد ، وجودة المنتج النهائي ووظائفه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء ناقلات التعبير

  1. التجاري نظام إعادة التركيب الاستنساخ:
    1. تضخيم تسلسل كامل طول الجين الهدف (hGAD65mut) مع الاشعال مناسبة تسمح إضافة المشبك CACC في نهاية 5'من الجين كما هو موضح سابقا (2).
    2. استنساخ المنتج التضخيم هلام تنقية، وفقا للمواصفات عدة الاستنساخ الاتجاه، في ناقلات الدخول (topoisomerase ملزمة) من خلال تجميع التفاعل في الحجم الكلي لل6 ميكرولتر، وذلك باستخدام 1.5: 1 المولي نسبة إدراج: النواقل و1 ميكرولتر من محلول الملح (كلوريد الصوديوم 0.2 M و 0.01 MgCl 2). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. تحويل رد فعل بأكمله إلى المختص كيميائيا E. خلايا القولونية وفقا لمواصفات الاتجاه عدة الاستنساخ والشاشة المستعمرات التي حصلت عليها مستعمرة PCR 3، وذلك باستخدام M13 إلى الأمام وعكس الاشعال المدرجة في هذه المجموعة الاستنساخ الاتجاه. عزل البلازميد من بومستعمرة sitive وفقا لالبلازميد إعداد DNA مواصفات عدة وتسلسل إدراج باستخدام M13 إلى الأمام وعكس الاشعال لضمان عدم وجود الطفرات 3.
    4. استخدام استنساخ دخول الحصول عليها لأداء رد فعل إعادة التركيب من قبل لامدا Recombinase Clonase II أنزيم (LR) مع ناقلات جهة معينة: لالمؤتلف التعبير البروتين في الخلايا البكتيرية مع pDEST17 (العائد pDEST17.G65mut)، في محطات (عابرة أو مستقرة) مع pK7WG2 (العائد pK7WG2.G65mut)، في باكولوفيروس / نظام خلية الحشرات مع الحمض النووي الفيروسي خطي (العائد Baculo.G65mut) 4. تجميع رد فعل، وفقا لمواصفات عدة clonase، مع 100 نانوغرام من ناقلات الدخول، 150 نانوغرام من ناقلات جهة و2 ميكرولتر من مزيج انزيم في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر. احتضان هذا المزيج في RT لمدة 1 ساعة.
    5. تحويل المنتج إلى إعادة التركيب المختص كيميائيا E. خلايا القولونية وفقا لمواصفات عدة clonase. الشاشة المستعمرات التي حصلت عليها PCR 3 باستخدام لجميع رد فعل التحول المستعمرات المستمدة نفس التمهيدي عكس GAD65mut محددة (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ') وناقلات جهة الاشعال إلى الأمام المحددة التالية: لpDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'؛ لpK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '؛ لBaculo ناقلات خطي: ​​5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 ".
    6. عزل DNA البلازميد باستخدام طقم DNA minipreparation التجارية وتأكد من وجود تسلسل الهدف بواسطة PCR 3، وذلك باستخدام نفس مجموعات محددة التمهيدي هو موضح في الخطوة السابقة.
    7. استخدام البلازميدات PCR-الإيجابية التي تم الحصول عليها لتحويل الكائنات المستهدفة المختلفة، اعتمادا على النظام الأساسي الذي تم اختياره لالمؤتلف التعبير البروتين كما هو موضح في الخطوات التالية.
  2. نظام MagnICON 5-7:
    1. استنساخ الجين المستهدف في 3'وحدة pICH31070، كما هو موضح سابقا بالتفصيل 7، مما أسفر عن pICH31070.G65mut. استخدامدورة التالية رد فعل محددة: 30 دقيقة الحضانة عند 37 درجة مئوية، و 5 دقائق عند 50 ° C ثم 5 دقائق عند 80 ° C.

2. المؤتلف التعبير البروتين

  1. نظام الخلية البكتيرية:
    1. تحويل pDEST17.G65mut إلى E. القولونية BL21 (DE3) خلايا electrocompetent باستخدام تقنيات القياسية وفحص المستعمرات نمت على التي تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) LB المتوسطة، عن طريق مستعمرة PCR باستخدام بادئات التحوير محددة التالية: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'و 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 "، مع درجة الحرارة الصلب من 58 درجة مئوية، ووقت استطالة من 20 ثانية. تنفيذ رد فعل PCR في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر بعد حل الخلايا البكتيرية مع طرف البلاستيك في الأنبوب.
    2. تطعيم مستعمرة واحدة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 3 مل من التي تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) LB المتوسطة.
    3. تمييع ثقافة البكتيرية 1: 100 في 100 مل من الطازجة المتوسطة LB (بما في ذلك ampicillفي)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-6 ساعة حتى OD النهائي 600 من 0.8.
    4. حمل المؤتلف التعبير البروتين عن طريق إضافة isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) بتركيز نهائي من 1 ملم واحتضان الثقافة مع قوية تهز لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
    5. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 4،000 x ج لمدة 20 دقيقة واستخدام بيليه البكتيرية لاستخراج البروتين (الخطوة 3.1.1.1).
  2. الفيروسة العصوية نظام خلية / الحشرات:
    1. البذور ورق القطن frugiperda (Sf9) الخلايا في 6 لوحات جيدا (8 × 10 5 خلايا لكل بئر) ويغسل مرتين مع 2 مل من غير أن تستكمل-غريس الحشرات متوسط.
    2. إزالة واستبدال المتوسطة قطرة من الحكمة مع خليط ترنسفكأيشن (5 ميكرولتر LR رد فعل المؤتلف، 6 ميكرولتر حل Celfectin و 200 ميكرولتر غير تستكمل-غريس الحشرات متوسطة).
    3. احتضان لوحات في 27 درجة مئوية لمدة 5 ساعة.
    4. إزالة واستبدال خليط ترنسفكأيشن مع 2 مل من الطازجة SF-900 المتوسطة، على أن تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين و 100 ميكرومتر قانسيكلوفير لتحديد الحيوانات المستنسخة المؤتلف الفيروسة العصوية.
    5. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 96 ساعة على 27 ° C، وجمع المتوسطة (الأسهم الفيروسي V1)، الطرد المركزي في 4،000 x ج لإزالة الخلايا والحطام كبيرة وتخزينها في الظلام في 4 درجات مئوية.
    6. البذور 1 × 10 6 خلايا Sf9 لكل بئر في 2.5 مل SF-900 متوسطة تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين و 100 ميكرومتر قانسيكلوفير وتصيب مع 100 ميكرولتر من الأسهم V1 في كل جيدا.
    7. احتضان خلايا لمدة 3 أيام في 27 ° C.
    8. جمع وأجهزة الطرد المركزي المتوسطة في 4،000 ز س.
    9. تخزين طاف (V2 الأسهم عالية عيار) في 4 درجات مئوية.
    10. البذور 1 × 10 6 خلايا Sf9 لكل بئر في 2.5 مل SF-900 متوسطة تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين و 100 ميكرومتر قانسيكلوفير وتصيب 25 ميكرولتر من الأسهم V2 في كل جيدا.
    11. احتضان خلايا لمدة 3 أيام في 27 ° C.
    12. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4،000 x ج واستخدام بيليه خلية الحشرات لاستخراج البروتين (الخطوة 3.1.2 1).
  3. نيكوتيانا benthamiana أنظمة التعبير عابرة:
    1. تنمو N. النباتات benthamiana في دفيئة، تحت الضوء الطبيعي داخل نطاق درجات الحرارة 18-23 درجة مئوية. لagroinfection استخدام النباتات 4-5 الاسبوع القديمة.
    2. إبقاء النباتات agroinfected في غرفة المناخ في 22 ° C مع 13 ساعة يوم / 11 ليلة في الساعة الضوئية.
    3. التجاري نظام إعادة التركيب الاستنساخ:
      1. إدخال pK7WG2.G65mut في الأجرعية المورمة سلالة EHA105 خلايا electrocompetent كما هو موضح سابقا 8 وفحص المستعمرات، ونمت على LB المتوسطة التي تحتوي على ريفامبيسين (50 ميكروغرام / مل)، الستربتومايسين (300 ميكروغرام / مل)، وسبكتينوميسين (100 ميكروغرام / مل) بعد 2 أيام من الحضانة عند 28 درجة مئوية، من قبل مستعمرة PCR 8 باستخدام بادئات التحوير محددة التالية: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217؛ و5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 "، مع درجة الحرارة الصلب من 58 درجة مئوية، ووقت استطالة من 50 ثانية. تنفيذ رد فعل PCR في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر.
      2. تطعيم البكتيريا في 30 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على ريفامبيسين (50 ميكروغرام / مل)، الستربتومايسين (300 ميكروغرام / مل)، وسبكتينوميسين (100 ميكروغرام / مل) لمدة يومين في 28 ° C.
      3. جمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 4،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend بيليه في 10 مل من العازلة تسلل (10 ملي MES، 10 ملي MgCl 2، 100 ميكرومتر acetosyringone، ودرجة الحموضة 5.6). قياس قيمة OD 600 ثم تعديله إلى 0.9 عن طريق تمييع في نفس العازلة.
        ملاحظة: الحجم الكلي اللازمة للتسلل ثلاثة N. النباتات benthamiana هو 30 مل.
      4. استخدام حقنة 2.5 مل needleless التسلل إلى تعليق الأجرعية في N. benthamiana يترك. بعناية وببطء حقن وحات ورقة مع تعليق من الحقنة. التسلل توسيع ثلاثة لترالطنف للنبات وتستخدم ثلاثة مصانع كما يثلث.
        ملاحظة: لأسباب الصحة والسلامة ارتداء حماية العين خلال عملية تسلل.
      5. جمع الأوراق agroinfiltrated 2 أيام من العدوى آخر (نقطة في البوصة) وتجميد في النيتروجين السائل. متجر الأنسجة النباتية في -80 ° C.
    4. نظام MagnICON:
      1. إدخال ناقلات MagnICON - في "وحدة (pICH20111)، 3 '5 وحدة (pICH31070.G65mut)، وحدة إنزيم مدمج (pICH14011) - في A. المورمة سلالة GV3101 باستخدام تقنيات القياسية. شاشة المستعمرات، ونمت على LB المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين والمضادات الحيوية المناسبة ناقلات محددة (50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين لpICH20111 وpICH14011، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين لpICH31070)، عن طريق مستعمرة PCR باستخدام بادئات محددة لكل النواقل.
      2. تطعيم بشكل منفصل A. ثلاثة المورمة سلالات في 5 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين والمضادات الحيوية ناقلات محددة المناسبةويهز بين عشية وضحاها في 28 ° C.
      3. بيليه الثقافات بين عشية وضحاها البكتيرية بواسطة الطرد المركزي عند 4،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend لهم في مجلدين من ثقافة البكتيرية الأولية من 10 ملي MES (الرقم الهيدروجيني 5.5) و 10 ملي MgSO 4.
      4. خلط كميات متساوية من تعليق البكتيرية التي تحتوي على ناقلات ثلاث واستخدام مزيج تعليق لحقنة تسلل N. benthamiana يترك. تسلل ثلاثة أوراق موسعة للنبات.
      5. جمع الأوراق agroinfiltrated في 4 نقطة في البوصة وتجميد في النيتروجين السائل.
      6. متجر الأنسجة النباتية في -80 ° C.
  4. نيكوتيانا تبغ نظام مستقر التعبير:
    1. النمو والحفاظ في المختبر شتلات من N. تبغ (فار SR1.) على الصلب مستنبت النبات (4.4 غرام / L Murashige وسكوغ - MS - المتوسطة بما في ذلك الفيتامينات، 30 ز / L السكروز، ودرجة الحموضة 5.8، 7 غ / L أجار النبات) تحت ظروف خاضعة للرقابة في غرفة المناخ في 25 ° C مع 16 ساعة يوميا / 8 ساعة / نيالنظام GHT.
    2. بدء قبل ثقافة A. المورمة EHA105 إيواء pK7WG2.G65mut ناقلات التعبير في 5 مل من السائل المتوسطة YEB بالمضادات الحيوية المناسبة (ريفامبيسين 50 ميكروغرام / مل، الستربتومايسين 300 ميكروغرام / مل، سبكتينوميسين 100 ميكروغرام / مل)، وتنمو بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في مجموعة شاكر المداري في 200 دورة في الدقيقة.
    3. استخدام 1 مل من قبل الثقافة لتطعيم ثقافة 50 مل الأجرعية في YEB المتوسطة بالإضافة إلى المضادات الحيوية (ريفامبيسين 50 ميكروغرام / مل، الستربتومايسين 300 ميكروغرام / مل، سبكتينوميسين 100 ميكروغرام / مل)، وتنمو لمدة 24 ساعة، وحتى الثقافة البكتيرية هي المشبعة (OD 600 قيمة 0.5-1.0).
    4. جمع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 4،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend بيليه في 50 مل من السائل مستنبت النبات. كرر هذه الخطوة مرتين لإزالة المضادات الحيوية تماما.
    5. خذ أول صحية أوراق توسعت بشكل كامل في المختبر من نباتات التبغ وقطع منها إلى حوالي 1 سم الساحات.
    6. قطع نقل ورقةإلى أطباق بتري العميقة التي تحتوي على تعليق البكتيرية وترك في الظلام لمدة 20 دقيقة.
    7. إزالة قطع ورقة من الايقاف وصمة عار الجافة على الورق مرشح العقيمة.
    8. ضع قطع ورقة مع الجانب متجه نحو المحور (العلوي سطح الورقة) في مصنع صلب الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 1.0 ميكروغرام / مل 6-benzylaminopurine (BAP) و 0.1 ميكروغرام / مل حامض الخليك النفتالين (NAA)، واحتضان لوحات لمدة يومين في غرفة المناخ في ذو شاهد الشروط (25 ° C، 16 ساعة يوم / ليلة 8 ساعة).
    9. قطع ورقة نقل على صلب مستنبت (بما في ذلك 1.0 ميكروغرام / مل BAP، 0.1 ميكروغرام / مل NAA، 500 ميكروغرام / مل سيفوتاكسيم، 100 ميكروغرام / مل الكاناميسين) مع سطح مجافي المحور (السطح السفلي للأوراق) في اتصال مع وسيط.
    10. احتضان لوحات لمدة 2-3 أسابيع في غرفة المناخ عند 25 درجة مئوية مع 16 ساعة / 8 ساعة النظام اليوم / ليلة للحث على تشكيل تبادل لاطلاق النار. ثقافة فرعية كل 2 أسابيع بواسطة نقل إإكسبلنتس ورقة لالطازجة مستنبت النباتات الصلبة التي تحتوي على 1.0 ميكروغرام / مل BAP، 0.1 ميكروغرام / مل NAA، 500ميكروغرام / مل سيفوتاكسيم و 100 ميكروغرام / مل الكانامايسين.
    11. عندما تظهر يطلق النار على نقلها إلى مربعات أرجواني تحتوي الصلبة مستنبت بما في ذلك 500 ميكروغرام / مل سيفوتاكسيم و 100 ميكروغرام / مل الكاناميسين للحث على تشكيل الجذر. احتضان شتلات مع 16 ساعة يوميا / 8 ساعة يلة الضوئية عند 25 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
    12. عندما شكل الجذور، ونقل النباتات إلى التربة في الاحتباس الحراري.
    13. جمع قطعة ورقة لكل مصنع وعزل الحمض النووي الجيني مع مجموعة تجارية.
    14. كشف عن وجود التحوير بواسطة PCR محددة. استخدام 30 نانوغرام من الحمض النووي الجيني كقالب لPCR التضخيم باستخدام بادئات التحوير محددة التالية: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 "و5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3"، مع درجة الحرارة الصلب من 58 درجة مئوية، ووقت استطالة من 20 ثانية . تنفيذ رد فعل PCR في الحجم الكلي لل50 ميكرولتر.
    15. تحليل المنتج 220 نقطة أساس قبل الكهربائي على هلام 1٪ الاغاروز في تريس، خلات-EDTA (تاي) عازلة (40 ملي آرهو، 20 ملم حمض الخليك، و1 ملم EDTA).
    16. اختيار النباتات المعدلة وراثيا تحتوي على الجين المستهدف.
    17. جمع قطعة ورقة من كل من محطة المعدلة وراثيا المختارة وتجميد في النيتروجين السائل على الفور.
    18. إعداد إجمالي مقتطفات من البروتين من أنسجة أوراق النبات (الخطوة 3.1.3) واختبار كل عينة عن طريق تحليل لطخة الغربي كما هو موضح سابقا 2 لاختيار أفضل البروتين المؤتلف نبات التبغ التعبير.
    19. الزهور كيس من النبات اختيار أفضل أداء أمام تزهر لمنع تلاقح.
    20. بعد تزهر، نضج الثمار والبذور والتجفيف، وجمع الحقائب.
    21. بذور منفصلة عن القشر وتخزينها في غرفة جافة في درجة حرارة رقابة (20-24 درجة مئوية).
    22. زرع بذور مجففة لإنتاج النباتات المعدلة وراثيا الجيل الثاني وبعد ذلك حدد مصنع أفضل أداء ليكون التلقيح الذاتي.
    23. كرر نفس الإجراء هو موضح في الخطوات 2.4.19-2.4.21 للأجيال اللاحقة.

    3. المؤتلف تحليلات التعبير البروتين

    1. استخراج البروتين الكلي:
      1. الخلايا البكتيرية:
        1. resuspend الكرية الخلية البكتيرية، التي تم جمعها كما هو موضح في الخطوة 2.1.5، في نصف حجم ثقافة المالحة تريس مخزنة (TBS - 2 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، و 500 ملي مول كلوريد الصوديوم) ودرجة الحموضة 7.4 تستكمل مع 1 ملم phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF).
        2. يصوتن معلق بيليه الخلية ثلاث مرات لمدة 40 ثانية في نصف السلطة، مع الحفاظ على عينة على الجليد.
        3. توضيح المحللة بواسطة الطرد المركزي عند 14،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
        4. نقل طاف لأنبوب نظيفة وتخزين كل من طاف وبيليه على حدة في -80 ° C.
        5. ذوبان الهيئات إدراج، التي تم جمعها في بيليه، في نصف حجم المحللة الخلوي للTBS درجة الحموضة 8.0 تستكمل مع 6 M اليوريا التي كتبها قوية تهز بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
        6. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وجمع طاف في نظيفةأنبوب.
        7. تخزين كل طاف وبيليه في -80 ° C.
      2. خلايا الحشرات:
        1. غسل بيليه الخلية المصابة الحشرات، التي تم جمعها كما هو موضح في الخطوة 2.2.12، مع 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS - 137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 مم KH 2 PO 4) الرقم الهيدروجيني 7.4.
        2. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من تحلل العازلة (20 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم، 3 ملم β المركابتويثانول و 1٪ توين-20)، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
        3. الطرد المركزي يذوب الخلايا في 14،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
        4. جمع الكسور القابلة للذوبان وتخزينها في -80 ° C وتجاهل بيليه.
      3. أوراق النبات الأنسجة:
        1. N. طحن benthamiana أو N. تبغ الأنسجة إلى مسحوق ناعم في النيتروجين السائل باستخدام هاون ومدقة.
        2. التجانس 100 ملغ من الأنسجة أرض الواقع في 300 ميكرولتر من استخراج العازلة (40 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 5 ملي DTT، 1.5٪ CHAPS)، ملحقemented مع 3 ميكرولتر من مثبط البروتياز الكوكتيل وذوبان الجليد على الجليد.
          ملاحظة: نسبة اختيار بين وزن الأنسجة النباتية (ز) لالعازلة (مل) حجم هو 1: 3.
        3. استخراج الطرد المركزي في 30،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
        4. جمع طاف في أنبوب نظيفة وتخزينها في -80 ° C.
    2. Coomassie هلام تلطيخ:
      1. إعداد التخفيف المناسب من إجمالي مقتطفات البروتين (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر من مستخلصات نباتية، 5 ميكرولتر من مقتطفات البكتيرية والحشرات) إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر من العازلة استخراج وإضافة 5 ميكرولتر من 3X عينة عازلة (1.5 M تريس / حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 و 3٪ SDS، الجلسرين 15٪، 4٪ β المركابتويثانول) إلى تركيز 1X النهائي.
      2. عينات يغلي لمدة 10 دقيقة.
      3. البروتينات منفصلة بنسبة 10٪ SDS-PAGE.
      4. بعد الكهربائي، هلام الحرارة في وجود حل Coomassie ألف (0.05٪ بريليانت الأزرق R-250، و 25٪ الأيزوبروبانول، 10٪ حامض الخليك) في فرن الميكروويف لمدة دقيقتينالصورة حتى درجة الغليان.
      5. يبرد هلام إلى درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
      6. تجاهل Coomassie حل تلطيخ A.
      7. هلام يزيل اللون عن طريق التسخين في وجود Coomassie الحل B (0.05٪ بريليانت الأزرق R-250، و 25٪ الأيزوبروبانول)، C (0.002٪ بريليانت الأزرق R-250، وحامض الخليك 10٪) وD (10٪ حامض الخليك) في كل مرة باتباع نفس بروتوكول لتلطيخ.
      8. بعد الخطوة التدفئة الماضية مع الحل D، وترك هلام destaining حتى خلفية واضحة 9.
    3. تحليل لطخة غربية:
      1. بعد الكهربائي، ونقل فصل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز باستخدام تقنيات القياسية وكتلة مع الحليب بنسبة 4٪ في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      2. احتضان صمة عار بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة في عرقلة الحل تحتوي على الأجسام المضادة الأولية الأرنب التي أثيرت ضد البروتين المستهدف في 1: 10،000 وتستكمل مع 0.1٪ توين-20.
      3. بعد تسمية الأجسام المضادة الأوليةجي، وغسل غشاء 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها عرقلة الحل تحتوي على 0.1٪ توين-20.
      4. احتضان مع الفجل البيروكسيديز (HRP) -conjugate الأضداد المضادة للأرنب في 1: 10،000 مقابل 1.5 ساعة.
      5. غسل غشاء 5 مرات لمدة 5 دقائق مع كل PBS-T (PBS تستكمل مع 0.1٪ توين-20).
      6. معالجة طخة غربية باستخدام الغلوثانيون الركيزة chemiluminescent.
    4. فحص Radioimmuno (RIA):
      1. السماح الكواشف (مصل، التتبع والبروتين وسيفاروز) لتصل إلى درجة حرارة الغرفة والماصة 20 ميكرولتر من البروتين استخراج العينات والمعايير بتركيزات مختلفة (من 300-2،400 نانوغرام / مل من hGAD65 التجارية المؤتلف) في أنابيب البوليسترين 12 × 75 مم.
      2. إضافة 20 ميكرولتر من مصل، أعدت تمييع 01:30 المصل من البلازما للمريض T1D.
      3. إضافة 50 ميكرولتر من التتبع (125-I-GAD65)، واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وضع أنبوب مع التتبع فقط لتقدير النشاط الكلي.
      4. إضافة 50 ميكرولترمن البروتين وسيفاروز واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      5. الاستغناء 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة العازلة في كل أنبوب والطرد المركزي في 1،500 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      6. صب الأنابيب لإزالة طاف وامتصاص السائل المتبقي على الورق النشاف من خلال استغلال بلطف الأنبوب.
      7. قياس النشاط الإشعاعي immunoprecipitated في جميع الأنابيب عن طريق عد لمدة 1 دقيقة في لأشعة غاما ومكافحة.
      8. مؤامرة في نطاق سجل معدلات ملزمة (B / T٪) من معايرة المتعلقة بالنشاط الكلي، لإنشاء منحنى القياسية، وقراءة تركيز GAD عينات من منحنى المعايرة 10.
        وينبغي تصميم المقيدة مناطق للتخزين والمناولة والتخلص من المواد المشعة: ملاحظة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف على التصميم التجريبي للتعبير مغاير لالمؤتلف البروتين المستهدف في أنظمة الإنتاج المختلفة هنا. وكان التركيز الأول على انشاء لمنصات مختلفة من خلال إنشاء الظروف المثلى للتعبير عن البروتين المستهدف في كل نظام.

التعبير عن بروتين الهدف، hGAD65mut، وكان المستحث في ثلاث نسخ E. ثقافات القولونية. وبعد 3 ساعات التعبير عند 37 درجة مئوية، وقد تم جمع الخلايا البكتيرية بواسطة الطرد المركزي و lysed من قبل ص...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة تم مقارنة ثلاث منصات مختلفة للتعبير عن البروتين البشري المؤتلف: الخلايا البكتيرية، وخلايا الفيروسة العصوية / الحشرات والنباتات. وكانت منصة المستندة إلى النباتات مواصلة استكشاف من خلال استغلال ثلاث تقنيات التعبير المستخدمة على نطاق واسع (أي عابر - MagnICON وpK7WG2 مقرها - ومستقرة). البروتين الهدف الذي تم اختياره لهذه التجربة، hGAD65mut، وقد أعرب سابقا في أنظمة مختلفة 13، وإنتاجه وظائف وبسهولة اكتشاف وقياس 14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال إجراء COST "التصيد الجزيئي: النباتات كمنصة إنتاج للبروتينات عالية القيمة" FA0804. يشكر المؤلفون الدكتور أناتولي جيريتش والبروفيسور يوري جليبا على توفير نواقل MagnICON لأغراض البحث.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مستخلص الخميرةSigmaY1333
TryptoneFormediumTRP03
Agar Bacteriological GradeApplichemA0949
Sf-900 II SFM mediumGibco10902-088
Grace ' s الحشرات المتوسطة ، غير مكملGibco11595-030
كاشف Cellfectin IIInvitrogen10362-100
MS medium بما في ذلك الفيتاميناتDuchefa BiochemieM0222
السكروزDuchefa BiochemieS0809
أجار النباتDuchefa BiochemieP1001
أمبيسلين الصوديومDuchefa BiochemieA0104
كبريتات جنتاميسيندوشيفا بيوكيميميG0124
جانسيكلوفيرInvitrogenI2562-023
كاربينيسيلين ثنائي الصوديومدوشيفا بيوكيميميC0109
كبريتات الكاناميسينالسامة سيجماK4000
ريفامبيسينسامة دوشيفا بيوكيميميR0146سامة & ندش. مخزون 25 مجم / مل في DMSO
كبريتات الستربتومايسيندوشيفا بيوكيمياءS0148
سبيكتينومايسين ثنائي هيدروكلوريددوشيفا بيوكيميميS0188
IPTG (إيزوبروبيل - بيتا ؛ - D-1-tiogalattopiranoside)سيجماI5502
هيدرات MESسيجماM8250
MgCl 2< / sub>الكيميائية الحيوية436994U
AcetosyringoneSigmaD134406Toxic & ndash; 0.1 M مخزون في حقنة DMSO
(1 مل)Terumo
MgSO4Fluka63136
BAP (6-Benzylaminopurine)SigmaB3408NAA
السام (حمض الخليك النفتالين)Duchefa BiochemieN0903
سيفوتاكسيمMylan Generics
Trizma baseSigmaT1503اضبط الأس الهيدروجيني مع 1 N HCl لجعل عازلة Tris-HCl
HClSigmaH1758تآكل
كلوريد الصوديومSigmaS30141 M مخزون
KClSigmaP9541
Na2< / sub>HPO4< / sub>سيجماS7907
KH2< / sub>PO4< / sub>SigmaP9791
PMSF (فينيل ميثان سولفونيل فلوريد)سيجماP7626أكالة وسامة
اليورياسيجماU5378
& بيتا ؛ -ميركابتو إيثانولسيجماM3148توين
سام -20سيجماP5927
HepesSigmaH3375
DTT (Dithiothreitol)SigmaD0632Toxic &ndash ؛ مخزون 1 متر ، مخزن عند -20 درجة ؛ C
CHAPSDuchefa BiochemieC1374كوكتيل
مثبط البروتياز النباتيالسام SigmaP9599لا تجمد / تذوب مرات
عديدة SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)SigmaL3771قابلة للاشتعال ، سامة ، أكالة & 10٪ مخزون
GlycerolSigmaG5516
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
الأيزوبروبانولسيجما24137القابل للاشتعال
سيجما27221الجلوتاميك المضاد للتآكل
ديكاربوكسيلاز 65/67سيجماG5163لا تجمد / تذوب مرات
عديدة بيروكسيداز الفجل (HRP) - مترافق الأجسام المضادة للأرانبسيجماA6154لا تتجمد / تذوب مرات
Sf9 حياةالخلايا التقنيات11496
BL21 المختصة E. القولونية< / em>نيو إنجلاند بيولابسC2530H
بروتين أ سيفاروزسيجماP2545
لوحات زراعة الخلاياسيجماCLS3516
مجموعة الفحص المناعي الراديويتكنو علم الوراثة12650805المواد المشعة
السامة السامة السامة مهيج مادة حمض الخليك حمض عديدة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
  2. Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).
  3. Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
  4. Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
  5. Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).
  6. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
  7. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), (2008).
  8. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).
  9. Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
  10. Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
  11. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
  12. Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).
  13. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419(2014).
  14. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).
  15. Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombinant Protein ExpressionBacterial SystemsInsect Cell SystemsPlant Based SystemsTransient ExpressionStable Transgenic LinesProtein Yield AnalysisProduction Cost EvaluationInclusion Body FormationBiofactory Comparison

Related Articles