Method Article

تحليل مقارن التعبير المؤتلف البروتين في Biofactories مختلفة: البكتيريا، خلايا الحشرات ونظم النبات

DOI:

10.3791/52459

⸱

March 23rd, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona, Verona, Italy, 2Department of Internal Medicine, University of Perugia, Perugia, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، تمت مقارنة التعبير عن بروتين مؤتلف بشري مستهدف في منصات إنتاج مختلفة. ركزنا على الثقافات التقليدية القائمة على التخمير وعلى النباتات ، ووصفنا إعداد كل نظام وسلطنا الضوء ، على أساس النتائج المبلغ عنها ، على الحدود والمزايا المتأصلة لكل منصة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتعتبر أنظمة المستندة إلى النباتات منصة قيمة لإنتاج البروتينات المؤتلف نتيجة لإمكاناتهم موثقة جيدا لإنتاج مرنة ومنخفضة التكلفة ذات جودة عالية، والمنتجات الحيوية النشطة.

في هذه الدراسة، قارنا التعبير عن هدف البروتين المؤتلف البشري في الثقافات التقليدية القائمة على تخمير الخلية (بكتيريا والحشرات) مع أنظمة التعبير المستندة إلى النباتات، سواء عابرة ومستقرة.

لكل منصة، وصفنا مجموعة المتابعة، والتحسين وطول عملية الإنتاج، وجودة المنتج النهائي والغلة وقمنا بتقييم تكاليف الإنتاج مؤقتة ومحددة لالمؤتلف البروتين الهدف المحدد.

وعموما، نتائجنا تشير إلى أن البكتيريا غير مناسبة لإنتاج البروتين المستهدف بسبب تراكمه داخل هيئات إدراج غير قابلة للذوبان. من ناحية أخرى، وأنظمة المستندة إلى النباتات هي منصات متعددة رقبعة تسمح للإنتاج البروتين المختارة في تكاليف أقل من الفيروسة العصوية / نظام خلية الحشرات. على وجه الخصوص، خطوط المعدلة وراثيا مستقرة عرض أعلى محصول للمنتج النهائي والنباتات التعبير عابرة أسرع عملية التنمية. ومع ذلك، قد يستفيد ليست كل البروتينات المؤتلف من أنظمة المستندة إلى النباتات ولكن ينبغي تحديد أفضل منصة إنتاج تجريبيا مع نهج كل حالة على حدة، كما هو موضح هنا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إنتاج البروتينات المؤتلفة تجاريا بكميات كبيرة في أنظمة التعبير غير المتجانسة بمساعدة أدوات التكنولوجيا الحيوية الناشئة. تشمل العوامل الرئيسية التي يجب مراعاتها عند اختيار نظام التعبير غير المتجانس: جودة البروتين ووظائفه وسرعة العملية والعائد والتكلفة.

في مجال البروتين المؤتلف ، يتوسع سوق المستحضرات الصيدلانية بسرعة ، وبالتالي ، فإن معظم المستحضرات الصيدلانية الحيوية المنتجة اليوم مؤتلفة. يمكن التعبير عن البروتينات في المزارع الخلوية للبكتيريا والخمائر والعفن والثدييات والنباتات والحشرات ، وكذلك في النظم النباتية (إما عن طريق التحول المستقر أو العابر) المعدلة وراثيا. كل نظام تعبير له مزاياه وقيوده المتأصلة ، ولكل بروتين مؤتلف مستهد....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء ناقلات التعبير

  1. التجاري نظام إعادة التركيب الاستنساخ:
    1. تضخيم تسلسل كامل طول الجين الهدف (hGAD65mut) مع الاشعال مناسبة تسمح إضافة المشبك CACC في نهاية 5'من الجين كما هو موضح سابقا (2).
    2. استنساخ المنتج التضخيم هلام تنقية، وفقا للمواصفات عدة الاستنساخ الاتجاه، في ناقلات الدخول (topoisomerase ملزمة) من خلال تجميع التفاعل في الحجم الكلي لل6 ميكرولتر، وذلك باستخدام 1.5: 1 المولي نسبة إدرا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف على التصميم التجريبي للتعبير مغاير لالمؤتلف البروتين المستهدف في أنظمة الإنتاج المختلفة هنا. وكان التركيز الأول على انشاء لمنصات مختلفة من خلال إنشاء الظروف المثلى للتعبير عن البروتين المستهدف في كل نظام.

التعبير عن بروتين الهدف، hGAD65mut، وكان المستحث في ثلاث نسخ E. ثقافات القولونية. وبعد 3 ساعات التعبير عند 37 درجة مئوية، وقد تم جمع الخلايا البكتيرية بواسطة الطرد المركزي و lysed من قبل ص.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة تم مقارنة ثلاث منصات مختلفة للتعبير عن البروتين البشري المؤتلف: الخلايا البكتيرية، وخلايا الفيروسة العصوية / الحشرات والنباتات. وكانت منصة المستندة إلى النباتات مواصلة استكشاف من خلال استغلال ثلاث تقنيات التعبير المستخدمة على نطاق واسع (أي عابر - MagnICON وpK7WG2 مقرها - ومستقرة). البروتين الهدف الذي تم اختياره لهذه التجربة، hGAD65mut، وقد أعرب سابقا في أنظمة مختلفة 13، وإنتاجه وظائف وبسهولة اكتشاف وقياس 14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال إجراء COST "التصيد الجزيئي: النباتات كمنصة إنتاج للبروتينات عالية القيمة" FA0804. يشكر المؤلفون الدكتور أناتولي جيريتش والبروفيسور يوري جليبا على توفير نواقل MagnICON لأغراض البحث.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مستخلص الخميرةSigmaY1333
TryptoneFormediumTRP03
Agar Bacteriological GradeApplichemA0949
Sf-900 II SFM mediumGibco10902-088
Grace ' s الحشرات المتوسطة ، غير مكملGibco11595-030
كاشف Cellfectin IIInvitrogen10362-100
MS medium بما في ذلك الفيتاميناتDuchefa BiochemieM0222
السكروزDuchefa BiochemieS0809
أجار النباتDuchefa BiochemieP1001
أمبيسلين الصوديومDuchefa BiochemieA0104
كبريتات جنتاميسيندوشيفا بيوكيميميG0124
جانسيكلوفيرInvitrogenI2562-023
كاربينيسيلين ثنائي الصوديومدوشيفا بيوكيميميC0109
كبريتات الكاناميسينالسامة سيجماK4000
ريفامبيسينسامة دوشيفا بيوكيميميR0146سامة & ندش. مخزون 25 مجم / مل في DMSO
كبريتات الستربتومايسيندوشيفا بيوكيمياءS0148
سبيكتينومايسين ثنائي هيدروكلوريددوشيفا بيوكيميميS0188
IPTG (إيزوبروبيل - بيتا ؛ - D-1-tiogalattopiranoside)سيجماI5502
هيدرات MESسيجماM8250
MgCl 2< / sub>الكيميائية الحيوية436994U
AcetosyringoneSigmaD134406Toxic & ndash; 0.1 M مخزون في حقنة DMSO
(1 مل)Terumo
MgSO4Fluka63136
BAP (6-Benzylaminopurine)SigmaB3408NAA
السام (حمض الخليك النفتالين)Duchefa BiochemieN0903
سيفوتاكسيمMylan Generics
Trizma baseSigmaT1503اضبط الأس الهيدروجيني مع 1 N HCl لجعل عازلة Tris-HCl
HClSigmaH1758تآكل
كلوريد الصوديومSigmaS30141 M مخزون
KClSigmaP9541
Na2< / sub>HPO4< / sub>سيجماS7907
KH2< / sub>PO4< / sub>SigmaP9791
PMSF (فينيل ميثان سولفونيل فلوريد)سيجماP7626أكالة وسامة
اليورياسيجماU5378
& بيتا ؛ -ميركابتو إيثانولسيجماM3148توين
سام -20سيجماP5927
HepesSigmaH3375
DTT (Dithiothreitol)SigmaD0632Toxic &ndash ؛ مخزون 1 متر ، مخزن عند -20 درجة ؛ C
CHAPSDuchefa BiochemieC1374كوكتيل
مثبط البروتياز النباتيالسام SigmaP9599لا تجمد / تذوب مرات
عديدة SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)SigmaL3771قابلة للاشتعال ، سامة ، أكالة & 10٪ مخزون
GlycerolSigmaG5516
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
الأيزوبروبانولسيجما24137القابل للاشتعال
سيجما27221الجلوتاميك المضاد للتآكل
ديكاربوكسيلاز 65/67سيجماG5163لا تجمد / تذوب مرات
عديدة بيروكسيداز الفجل (HRP) - مترافق الأجسام المضادة للأرانبسيجماA6154لا تتجمد / تذوب مرات
Sf9 حياةالخلايا التقنيات11496
BL21 المختصة E. القولونية< / em>نيو إنجلاند بيولابسC2530H
بروتين أ سيفاروزسيجماP2545
لوحات زراعة الخلاياسيجماCLS3516
مجموعة الفحص المناعي الراديويتكنو علم الوراثة12650805المواد المشعة
السامة السامة السامة مهيج مادة حمض الخليك حمض عديدة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
  2. Avesani, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombinant Protein ExpressionBacterial SystemsInsect Cell SystemsPlant Based SystemsTransient ExpressionStable Transgenic LinesProtein Yield AnalysisProduction Cost EvaluationInclusion Body FormationBiofactory Comparison

Related Articles