يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

12K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52505

⸱

يناير 26, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Division of Allergy and Immunology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

في هذه المقالة

ملخص

وكان الهدف من هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة من شأنها أن تسمح التحليلات الجينومية الوظيفية لإفراز الخلايا البدينة. ويستند هذا البروتوكول على التقييم الكمي لإطلاق سراح من الجين مراسل الفلورسنت cotrasfected مع الجينات في المصالح في الوقت الحقيقي تحليلات التشكل حبيبة إفرازية ل.

الملخص

الخلايا البدينة (MC) هي الخلايا الإفرازية للجهاز المناعي التي تحقق وظائفها الفسيولوجية والمرضية عن طريق الإفراج عن وسطاء الحساسية، التهابات وimmunoregulatory قبل تشكيلها وتوليفها حديثا. وسطاء إم سي إس "تؤثر على الأنسجة والأعضاء متعددة بلغت ذروتها في استجابات حساسية والمناعة. وينظم درجة عالية من التوليف والتخزين والإفراج عن وسطاء MC. معبأة الوسطاء شكلت قبل في حبيبات إفرازية حشوية (SG) أن تلتحم مع غشاء البلازما والافراج عن محتواها بواسطة إيماس المنظم. نقدم بروتوكول، على أساس المشاركة في التعبير عن الجينات في المصالح مع الجين المراسل أن يتم استهداف لجان الدراسات وإصدارها بطريقة المنظم جنبا إلى جنب مع وسطاء SG الذاتية. بروتوكول يتيح عالية الدقة أربعة متحد البؤر الأبعاد يحلل من MC جان الدراسات ومراقبة الجدول الزمني الخاصة بهم من نشوء حيوي لإيماس تشغيلها. وهكذا، وذلك باستخدام هذا البروتوكول لفحص الجينات من بينمؤسسة لالمظهرية والوظيفية تأثيرها يسمح فك رموز الآليات الجزيئية التي تتحكم في نشوء حيوي وإيماس من MC جان الدراسات وتحديد الجهات الرقابية المعنية. وبالتالي، ينبغي أن تقدم مزيدا من الإيضاحات عن الآليات الخلوية التي تمثل وظيفة إم سي إس في الصحة والمرض.

المقدمة

الخلايا البدينة (MC) هي خلايا المناعة التي اشتهر مشاركتهم في الحساسية والتهابات مثل التهاب المفاصل والربو والتهاب المريء بالحمضيات، التهاب الجلد المزمن وصدمة الحساسية 1،2 فضلا عن الأمراض الأخرى بما في ذلك مرض الشريان التاجي 3،5 و السرطان 3،4. وبالإضافة إلى ذلك، إم سي إس تلعب أدوارا هامة في المناعة الفطرية والتكيفية، سواء في الدفاع المضيف ضد البكتيريا والطفيليات وقمع الاستجابات المناعية، على سبيل المثال حمل المزروع التسامح 5،6.

المعلقون تنشأ من النخاع العظمي، وتطوير من CD34 + / CD117 + الخلايا الاصلية المحفزة 7. يتم الافراج نخاع العظام ملتزمة الأسلاف MC إلى مجرى الدم وتهاجر إلى الأنسجة الطرفية توطين في الغالب داخل الأنسجة الضامة والأسطح الظهارية 8. وحققت النضج والتمايز النهائي في نهاية المطاف تحت تأثير سو السيتوكينات داخل الوسط 8،9 المحيطة بها.

المعلقون يمكن تفعيلها من خلال مثيرة للحساسية (مستضد، حج)، الذي أدى إلى جيل من الغلوبولين المناعي E (IgE و) لقاء اكتب الأجسام المضادة. ربط هذا إيج لمستقبلات FcεRI مولودية، تليها عبر ربط الخلايا ملزمة الجلوبيولين على إعادة التعرض لنفس حج، والنتائج في FcεRI تجميع والشروع في سلسلة مما يشير إلى أن يبلغ ذروته في تحبب خلية [استعراضها في 10،11] . يتم تنشيط إم سي إس أيضا، بشكل مستقل عن فريق الخبراء الحكومي الدولي، من خلال نيوروببتيد 5،12، والسموم 13، بكتيريا ومولدات المضادات الفيروسية 14،15، وعدد من الببتيدات موجبة الشحنة يشار إليها مجتمعة ب secretagogues الأساسية، الخلايا المناعية والسيتوكينات 5،13،12،16 ، 17. يتم تنشيط المعلقون أيضا من قبل العديد من وسطاء لهم صدر الخاصة، الأمر الذي يزيد من تضخيم الاستجابة الالتهابية.

معبأة المعلقون مع حبيبات إفرازية (جان الدراسات) التي تحتوي على المناعةوسطاء التنظيمية، بما في ذلك الأمينات فعال في الأوعية، مثل الهستامين والسيروتونين (في القوارض)، البروتيوغليكان، البروتياز، مثل كيماز وتريبتاز، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية والعديد من السيتوكينات و chemokines 8،9. هذه هي وسطاء "على استعداد للذهاب" وحالما يتم تفعيل المعلقون من قبل التحفيز المناسب، وأصدرت هذه سطاء من الخلايا عن طريق إيماس تنظيم (تحبب) في بضع ثوان إلى دقائق 18،19. ويتبع هذا الحدث الأولي من التوليف دي نوفو وإطلاق مجموعة كبيرة من المواد الفعالة بيولوجيا، بما في ذلك الأيض حمض الأراكيدونيك، السيتوكينات متعددة وكيموكينات 20،21،22. الافراج عن المنتجات تصنيعه حديثا يحدث بشكل مستقل عن إطلاق SG. بشكل جماعي، وهذه سطاء الشروع الردود في وقت مبكر والمرحلة المتأخرة التهابات والحساسية. ولذلك، فهم آليات المحاسبة لتفعيل MC وتحبب كلاهما عفريت النظري والسريريortance.

صعوبة التلاعب وراثيا إم سي إس الابتدائية ومثقف وأعاقت محاولات لتوضيح الآليات الكامنة MC تحبب، والتي ظلت حلها بشكل سيئ. للتغلب على هذه المشكلة وضعنا مقايسة على أساس مراسل بواسطة خط الخلية المخاطية الصاري transfecting المشترك، الفئران سرطان الدم مستقعد (RBL) -2H3 (المشار إليها هنا RBL) أو نخاع العظام المستمدة إم سي إس (BMMCs) 30 مع الجينات في المصالح و نيوروببتيد Y (NPY) تنصهر لRFP أحادى (mRFP)، كمراسلة SG.

تم NPY توضح مسبقا تلخيص سلوك علامات SG المحلية في النظم الأخرى. وعلاوة على ذلك، لأن mRFP مضان هو الرقم الهيدروجيني حساسة والتعبير عن NPY-mRFP يسمح التصور من لجان الدراسات الحمضية وكذلك التقييم الكمي للإيماس باستخدام لوحات 96-جيدا وقارئ لوحة مضان. لقد أظهرنا أن يتم تسليم NPY-mRFP لجان الدراسات الحمضية خلايا RBL وBMMCs ويتم تحريرها من الخلايابطريقة المنظم إلى جانب البضائع SG الذاتية (أي، β-هيكسوزامينيداز والسيروتونين) 30، 32. يوفر هذا البروتوكول منهجية قائمة على التصوير عالية الدقة التي تسمح الجينات فحص الفائدة لالمظهرية وتأثيرها على خصائص وظيفية SG وتحبب في خلايا RBL 32. على وجه التحديد، وهذا البروتوكول يسمح في الوقت الحقيقي تتبع MC جان الدراسات والكمي لمنطقتهم أو حجم وحدة التخزين، عددهم، حركية التجمع والتنقل على طول الهيكل الخلوي الخلية والانصهار في نهاية المطاف مع غشاء البلازما تحت ظروف مختلفة. على سبيل المثال، توعية الخلايا مع DNP محددة إيج والتسبب في الخلايا مع حج متعددي (DNP مترافق ألبومين المصل) تحت الاضطرابات المختلفة (أي ضربة قاضية للجينات من الفائدة، على التعبير عن الجينات WT أو متحولة، أو التلاعب الدوائية) و مقارنة للسيطرة على الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد RBL خلية الثقافة وسائل الإعلام

  1. مزيج 500 مل من المتوسط ​​تعديل النسر انخفاض مستوى السكر في Dulbecco لفي (DMEM) مع 56 مل من مصل بقري جنيني (وهذا يجعل 10٪ FBS)، ثم قم بإضافة 5.5 مل من البنسلين ستربتومايسين (وهذا يجعل ~ 1٪ من الآفات).
  2. تصفية وسائل الإعلام باستخدام 500-1،000 مل زجاجة-الأعلى فراغ الفلاتر مع 0.22 ميكرون حجم المسام وتخزينها في 4 ° C.

2. الثقافة من الخلايا RBL

  1. زراعة خلايا RBL في جو مرطب من CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية في أي لوحات أو قوارير. وينبغي استكمال خلايا RBL التي تنمو في 10 سم لوحات مع 10 مل المتوسطة وتشكيل أحادي الطبقة متموجة من ~ 10 7 خلايا / لوحة.
  2. عندما طبقة الخلايا يقترب التقاء، replate ثقافة في مناطق ذات كثافة أقل.
    1. إزالة مستنبت من لوحة / قارورة باستخدام ماصة باستير العقيمة متصلة فراغ.
    2. شطف أحادي الطبقة الخلية مع prewarmed (37° C) 0.25٪ التربسين / EDTA التي تغطي أحادي الطبقة بأكملها (حجم يعتمد على حجم وحة الثقافة / قارورة، 2 مل لمدة 10 سم لوحة). وهذا فصل الخلايا.
    3. بدلا من ذلك، شطف أحادي الطبقة الخلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة prewarmed (37 درجة مئوية) التربسين / EDTA. هذه الخطوة تنفصل الخلايا بشكل أسرع.
    4. وضع لوحة / قارورة في حاضنة عند 37 درجة مئوية (لا يزيد عن 10 دقيقة).
    5. تفقد الخلايا تحت المجهر الضوئي للتحقق مما إذا كانت قد منفصلة. إذا لم الخلايا فصل بعد 10 دقيقة، اضغط بلطف على لوحة / قارورة.
    6. إضافة المتوسطة إلى لوحة الثقافة / قارورة لتعليق الخلايا (يجب أن يكون حجم المتوسط ​​على الأقل 2 أضعاف أكبر من حجم الحل التربسين).
    7. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 غرام عند 25 ° C.
    8. resuspend الخلايا في المتوسط. تمييع الخلايا عن طريق 1:10 و البذور في صحن الثقافة الجديد. احتضان الخلايا لمدة 48-72 ساعة، حتى REACح ما يقرب من 90٪ التقاء.
    9. كرر نفس الإجراء (القسم 2.2.1-2.2.8) لمدة تصل إلى 3 أشهر (30 الممرات).

3. إعداد ترنسفكأيشن وسائل الإعلام.

  1. إعداد 100 ملي حل K-أنابيب الرقم الهيدروجيني 7، 1 ملم حل من الكالسيوم 2+ خلات و 100 ملي حل من المغنيسيوم 2+ خلات.
  2. تمييع ملي حل 100 من K-أنابيب درجة الحموضة 7 إلى 20 مم باستخدام DMEM وسائل الإعلام، إضافة محلول 1 ملم من الكالسيوم 2+ خلات إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر و 100 ملي حل من المغنيسيوم 2+ خلات إلى تركيز النهائي من 2 ملي.
  3. تزن البوتاسيوم الصوديوم وإضافة إلى حل لتركيز النهائي من 128 ملي، تخلط جيدا والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. حافظ على الحلول المتبقية (أي.، K-أنابيب، كاليفورنيا 2+ خلات، والمغنيسيوم خلات 2+) في -20 ° C.

4. ترنسفكأيشن من خلايا RBL

  1. إزالة مستنبت من لوحة / قارورة باستخدامماصة باستير العقيمة متصلة فراغ.
  2. شطف أحادي الطبقة الخلية مع prewarmed (37 درجة مئوية) التربسين / EDTA التي ينبغي تغطية أحادي الطبقة بأكملها. وضع لوحة / قارورة في حاضنة عند 37 درجة مئوية (لا يزيد عن 10 دقيقة). تحقق مما إذا كان قد فصل الخلايا باستخدام المجهر الضوئي.
  3. إضافة المتوسطة إلى لوحة الثقافة / قارورة لتعليق الخلايا (حجم وسائل الإعلام يجب أن يكون على الأقل 2-أكبر أكثر من حجم الحل التربسين).
  4. حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  5. بيليه 1.5 × 10 7 الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 x ج عند 25 درجة مئوية. تجاهل supernatants وإضافة 280 ميكرولتر ترنسفكأيشن المتوسطة. نقل مزيج التفاعل إلى 4 مم كفيت.
  6. إضافة 20 ميكروغرام من NPY-mRFP البلازميد وإما 30 ميكروغرام من السيطرة البلازميد فارغة أو البلازميد التي تم اختبارها. يجب أن يكون الحجم النهائي من مزيج رد فعل 300 ميكرولتر.
  7. وضع على الفور على الجليد لمدة 10 دقيقة. مسح كفيت من المياه المتبقية وصroceed إلى Electroporation للفي 300 V لمدة 9 ميللي ثانية.
  8. لقياس إيماس، replate الخلايا على الفور في 24 جيدا أطباق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 300 ميكرولتر المتوسطة. إضافة 8 ميكرولتر من مزيج التفاعل (4 × 10 5 خلايا) إلى كل بئر. إضافة 4 × 10 5 غير الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى آبار إضافية من أجل السيطرة. إعداد ما يكفي من الآبار لللديك على الأقل تكرار الآبار لكل معاملة لكل ترنسفكأيشن.
  9. للمرة الفاصل بين المجهري، replate الخلايا على الفور في 8 جيد غرفة البورسليكات نظام ساترة تحتوي على 80 ميكرولتر المتوسطة. إضافة 1.5 ميكرولتر من مزيج التفاعل (7.5 × 10 4 خلايا) لكل غرفة. (حاول تجنب استخدام غرف على حافة ساترة، وغرف في وسط ساترة هي أسهل للصورة).
    ملاحظة: الأهم من ذلك، ليس كل الخلايا ردا على الزناد، وأحيانا منسوخ المجهري الوقت الفاصل بسبب فقدان التركيز والانجراف من borosi الغرفة 8 جيدانظام ساترة licate. لذلك، وإعداد لا يقل عن 8 غرف لكل علاج لكل ترنسفكأيشن.
  10. لتوعية الخلايا لمدة FcεRI تفعيل بوساطة، إضافة 1 ميكروغرام / مل من الماوس إدارة التخطيط الوطني وحيدة النسيلة محددة فريق الخبراء الحكومي الدولي لوسائل الإعلام (احتضان الخلايا مع فريق الخبراء الحكومي الدولي لا يقل عن 2 ساعة).
  11. بعد 18-24 ساعة استخدام المجهر الفلورسنت للتأكد من أن الخلايا تبدي والبلازميدات. الإثارة وانبعاث موجات من mRFP مضان هي: λEx 584، λEm 607 نانومتر. يجب أن تظهر NPY-mRFP في الهياكل حويصلي التي تتوافق مع اس جي اس. إذا تم تنصهر فيها الجين الثاني من الفائدة على علامة فلوري استخدام المجهر الفلورسنت لتأكيد المشاركة في التعبير عن كل من البلازميدات في نفس الخلايا. على سبيل المثال، إذا تم تنصهر فيها الجين اختبار لGFP، والإثارة وانبعاث موجات من GFP مضان هي: λEx 488، λEm 507 نانومتر. يجب أن تظهر البروتين GFP الموسومة في نفس الخلايا التي تعبر عن NPY-mRFP.
  12. لقياسات إيماس المضي قدما رس الخطوة 5 والفاصل الزمني المجهري، انتقل إلى الخطوة 6.

5. قياس NPY-mRFP الإيماس

  1. إعداد عازلة تايرود:
    1. تحضير محلول من 54 ملي بوكل، 20 ملي MgCl 2، 2.74 M كلوريد الصوديوم و 8 ملي ناه 2 PO 4 في أحواض دبي الجافة العالمية. تخلط جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية. هذه الخطوة هي لإعداد 20x وتايرود العازلة.
    2. تحضير محلول من 20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7، 1.8 ملي CaCl 2، 1 ملغ / مل BSA، والجلوكوز 5.6 ملم والتخفيف من 1 إلى 20 من تايرود 20x وفي أحواض دبي الجافة العالمية وتخلط جيدا. هذه الخطوة هي لإعداد عازلة 1X تايرود.
    3. قسامة المخزن المؤقت 1X تايرود وتخزينها في -20 ° C. تجنب تكرار التجميد والذوبان.
  2. إزالة مستنبت من لوحة جيدا 24 ويغسل 3 مرات مع العازلة تايرود. إعداد الخلايا unstimulated من خلال إضافة 200 ميكرولتر تايرود عازلة للسيطرة على آبار.
  3. إعداد تتركز 10 ميكرولتر / جيد من 20X تفعيل كاشف [(على سبيل المثال 1،000 نانوغرام / مل DNP-BSA أو إدارة التخطيط الوطني-HSA (حج)، و ​​200 ميكرومتر الكالسيوم 2+ حامل الأيون (على سبيل المثال A23187)، ومزيج من 20 ميكرومتر الكالسيوم 2+ حامل الأيون و 1،000 نيوتن متر 12-O- tetradecanoylphorbol-13-خلات (TPA)]. إذا تم تخزين الكواشف في DMSO، يخفف من الكواشف إلى 20x والتركيز في تايرود العازلة التي تحتوي على 1٪ DMSO. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. إزالة supernatants من كل بئر بعناية إلى 96 لوحة جيدا، ضع على الجليد وتجنب من الضوء. (وsupernatants تحتوي على الببتيد خيالية NPY-mRFP الذي تم إصداره من الخلايا).
  5. إضافة 200 ميكرولتر تايرود العازلة التي تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100 إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. (هذه الخطوة مهمة لإعداد لست] خلية التي تحتوي على ما تبقى من NPY-mRFP التي لم يفرج عنه من الخلايا). جمع لست] الخلية ونقل إلى 96 لوحة جيدا، ضع على الجليد وتجنب من الضوء.
  6. قياس مضان من supernatants الخلية والخلية لست] باستخدام fluorescسينعقد لوحة القارئ، وذلك باستخدام 590-، 20 نانومتر عرض النطاق الترددي الإثارة وتصفية 635-، 35 نانومتر تصفية الانبعاثات عرض النطاق الترددي.
  7. حساب النسبة المئوية للنبي-mRFP صدر:
    ملاحظة: هذا الاجراء القارئ مضان وحدات مضان التعسفية (AFU). قيم AFU تعتمد على الآلة وحساسيتها وكفاءة ترنسفكأيشن.
    1. تعيين تألق ذاتي للخلايا RBL nontransfected فارغة كما. تقسيم AFU من كل طاف لمضان الإجمالي (AFU من supernatants + AFU من المحللة المقابلة) ومضاعفة بنسبة 100.

6. الوقت الفاصل بين الميكروسكوب من الإيماس

  1. البذور 7.5 × 10 4 من transfected خلايا / غرفة في نظام ساترة غرفة البورسليكات 8-جيدا. بعد 18-24 ساعة، وإزالة مستنبت من غرف ويغسل 3 مرات مع العازلة تايرود
  2. إضافة 72 ميكرولتر من العازلة تايرود لكل غرفة. تمييع الكواشف تفعيل العازلة في تايرود إلى 10X التركيز.
    3. <لى> استخدام المجهر مضان مبائر مجهزة غرفة ساخنة (37 ° C) وCO 2 تحكم (4.8٪) وهدف 40X 63X أو. بدوره على أنظمة المجهر: مصباح الزئبق، والكمبيوتر، وأشعة الليزر. تأكد من أن غرفة ساخنة هي في درجة الحرارة الصحيحة قبل بدء التجربة.
  3. ضع غرفة في غرفة ساخنة وتأكد من أن يتم تثبيت الغرفة بشكل صحيح ومستقرة.
  4. بدوره على ضوء مضان وفقا لfluorophore ذات الصلة وتصور الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. إيقاف مضان مرة واحدة في خلية من الفائدة في الميدان من أجل تقليل التبييض والسمية الخلوية. فمن المهم أن هذا المجال سوف تحتوي على حوالي 2-3 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. والخلايا المصابة بالعدوى بالنقل يجب أن تنتشر بشكل جيد ولكن لا لمس كل منهما الآخر.
  5. ضبط قوة الليزر (اعتمادا على المجهر) للحد من الضوضاء وoversaturation وكذلك سمية، وتعيين الربح وتعويض لتعديل إشارة إلى نسبة الضوضاء. مسح سريع أو دير لتقليل مدة المعرض الليزر (المتوسط ​​2).
  6. ضبط حجم الثقب إلى الحد الأقصى، وهذا يتيح تقليل قوة الليزر والحفاظ على الصور ركزت لفترة طويلة من الزمن. إذا رغبت في ذلك، تعيين المعلمات لZ كومة لإعادة بناء الصورة في ثلاثي الأبعاد، وضبط حجم الثقب إلى 1 وحدة مهواة (AU) الذي يعطي أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء والحصول على المسح الضوئي على التوالي من شرائح الضوئية مبائر ثنائية الأبعاد في -axes ض مع شرائح بصرية ≤0.7 ميكرون.
  7. ضبط الوقت الفاصل بين كل اكتساب إلى 15-30 ثانية ومدة الاستحواذ الكلي إلى 15 دقيقة والبدء في الحصول على الصور. بعد 5 دقائق من اكتساب وقفة السلاسل الزمنية. إضافة 8 ميكرولتر من على الزناد 10X والاستمرار في الاستحواذ على الفور.
  8. حفظ الصور، تنفيذ إزالة التفاف باستخدام برنامج إزالة التفاف وإعادة بناء المداخن إلى ثلاث صور ثلاثية الأبعاد وفيلم باستخدام برنامج Imaris.

الصورة = "jove_title"> 7. تحليلات صورة

  1. استيراد البيانات من الصور المتسلسلة deconvoluted التي تم الحصول عليها من قبل مضان المجهر متحد البؤر لبرنامج Imaris. هذا البرنامج يقرأ أكثر من 40 ملفات المجهري. إذا كان البرنامج لا يمكن قراءة الملفات؛ تحويل الملفات إلى ملفات معرض طرابلس والاستيراد.
  2. لإضافة نقاط الوقت إلى نهاية مفتوحة مجموعة البيانات الصحفية تحرير -> إضافة نقاط الوقت واستيراد البيانات الجديدة المحددة.
  3. خلق سطح القناة mRFP باستخدام الخيار المعالج السطح. اختيار خوارزمية الافتراضية. اختيار قناة NPY-mRFP. بمناسبة الخيار تجانس للحد من الضوضاء. لتجنب فقدان التفاصيل الصغيرة تقلل من مستوى التفاصيل منطقة إلى 0.05 ميكرون.
  4. تعيين عتبة الشدة. سيتم عرض سطح رمادي جديد. انتقل إلى "إعدادات" وتبديل النمط من "نقطة المركز" إلى "السطحية".
  5. انتقل إلى علامة التبويب إحصائيات في خصائص الكائن المحدد، حدد علامة التبويب مفصل ويرغب، يمث قيمة محددةح كما كثافة مضان، وحجم الخ
  6. مراجعة البيانات والتأكد من أن القيم هي متوافقة مع الصور. على سبيل المثال، يمكن قياس اثنين أو أكثر من حبيبات المجاورة كأحد أكبر الحبيبية. لقياس متوسط ​​حجم الحبيبات تقسيم حجم الحبيبات المدمجة إلى العدد الفعلي للحبيبات.
  7. تصدير مجموعات البيانات المطلوبة لملفات اكسل وتحليل البيانات.
و

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ونظرا لكفاءة ترنسفكأيشن منخفضة من إم سي إس، من غير المرجح أن يترك أثرا على قراءات من متوسط ​​إفراز قياس وسطاء جان الدراسات الذاتية التلاعب الجيني. ومع ذلك، من خلال إنشاء كامل شاركت في التعبير لمراسل الجين NPY-mRFP والبلازميد-transfected شارك في نفس الخلايا، رصد النتائج NPY-mRFP في رصد حصرا السكان الخلية التي تعبر عن الجينات في المصالح. ولذلك، فإن الاستفادة من هذا الاختبار بالمقارنة مع الطرق التقليدية هي القدرة على رصد انتقائي خلايا التلاعب بها وراثيا (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصفنا استراتيجية مبتكرة تجمع بين الكمي لإم سي إس إيماس وأربعة (س، ص، ض، ر) quantifications البعد عن طريق ثلاثي الأبعاد التصوير ساقطا وقت جان الدراسات في الخلايا الحية باستخدام الجين مراسل إيماس. هذه التقنية تتيح فحص عائلات البروتينات من حيث أثرها على وظيفة MC مثل جان الدراسات المراقبة ابتداء وقت خروجهم من جولجي من خلال النضج، واكتساب الكفاءة إيماس وتحبب. مزيج من قياسات إيماس جنبا إلى جنب مع الأوصاف المظهرية والحركية للجان الدراسات ويوفر نظرة ثاقبة الآليات التي البروتينات اختبار تو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب مالي في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور U. عاشري لهدية من NPY-mRFP [كدنا]. نشكر الدكاترة. MJ Kofron، L. ميتلمان، M. Shaharbani، وY. زلبرشتاين للحصول على مساعدة لا تقدر بثمن مع المجهري وصورة ويحلل. كما نشكر الدكتور جوزيف أورلي لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم إسرائيل، التي تأسست من قبل الأكاديمية الوطنية الإسرائيلية للعلوم (1139-1112 إلى RS-E).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMسيجما-ألدريتشD6046-500MLدافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
مصل الأبقارالجنيني GE الرعاية الصحية علوم الحياةSH30071.01
البنسلين الستربتومايسينتقنيات الحياة
غشاء أسيتات السليلوز ، حجم المسام 0.22   ؛ مو مSigma-AldrichCLS430769-1EA
أطباق الثقافة المعالجة بزراعة الأنسجة CorningSigma-AldrichCLS430167
Trypsin / EDTA Solution (TE) تقنياتالحياةR001100دافئة في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
أنابيب ملح ثنائي البوتاسيومSigma-Aldrich108321-27-3   ؛
هيدرات أسيتات الكالسيومسيجما ألدريتش114460-21-8
أسيتات المغنيسيوم رباعي هيدراتسيجما ألدريتشM5661   ؛
حمض الجلوتاميك ملح البوتاسيوم أحادي الهيدرات (غلوتامات البوتاسيوم)سيجما ألدريتشG1501
4 مم مشاريع خلايا كوفيت التثقيب الكهربائيEP-104
النابض الجيني مع وحدة التحكم في النبض و ؛ CAPACITANCEBio rad
غطاء زجاجيحراري علمي155411
24 بئر ، قاع مسطحSigma-AldrichCLS3524
Corning 96 لوحة بئرSigma-AldrichCLS3367 أو CLS390
96 قارئ مضان لوحة البئر- Infinite 200Tecan
Calcium ionophore A23187سيجما - ألدريتشC7522تجنب التعرض المباشر للضوء
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)CalbiochemP3766
المضادة ل DNP أحادية النسيلة IgESigma-AldrichD8406   ؛
DNP-BSA / DNP-HASSIGMA-ALDRICHA6661تجنب التعرض المباشر للضوء
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787
مجهر الفلورسنت متحد البؤر:
Zeiss LSM 510
LeicaSP5
Nikon A1 مقلوب
برنامج ImarisBITLANE Microsoft
exel أو Prism أو برامج تحليلات
كاشف آخر:
كلوريد المغنيسيومMERK5833
كلوريد الصوديومMERK6404
كلوريد الكالسيوم  MERK2382
ألبومين مصل البقر  مختبرات Sigma-AldrichA4503
GlucoseBDH284515V
فوسفات أحادي الصوديوم   ؛MERK5345
مياه
أخرى معقمة

المراجع

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214(2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134(2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تكوين الحبيبات الإفرازيةالإخراج الخلوي المنظمالمجهر البؤريالجين المراسل الفلوريالتعبير الجيني المشتركالتحليل المورفومتريقياس شدة الفلورةتحفيز ناقل أيونات الكالسيومطفرة Rab5
التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.