مقالة منهجية

في الموقع الكالسيوم 2+ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

21.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52506

⸱

يناير 29, 2015

 , 
1Department of Physiology, Michigan State University

في هذه المقالة

ملخص

الجهاز العصبي المعوي (ENS) هو شبكة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الموجودة في جدار الأمعاء والتي تتحكم في ردود الفعل المعوية. يصف هذا البروتوكول طرق تسجيل نشاط الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية في الاستعدادات الحية ل ENS باستخدام تصوير Ca2+.

الملخص

يتم التحكم في السلوكيات الانعكاسية للأمعاء بواسطة الجهاز العصبي المعوي (ENS). ENS عبارة عن شبكة تكاملية من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في ضفائر عقدية موجودة في جدار الأمعاء. الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية المعوية هي أنواع الخلايا الوحيدة داخل العقد المعوية. نشاط الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية مسؤول عن تنسيق وظائف الأمعاء. يصف هذا البروتوكول طرق مراقبة نشاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية داخل ENS السليمة عن طريق تصوير العابرين داخل الخلايا من الكالسيوم (Ca2+) بأصباغ مؤشر الفلورسنت. تركز مناقشتنا الفنية على طرق تصوير Ca2 + في الاستعدادات الكاملة للضفيرة العضدية المعوية من أمعاء القوارض. يسمح التحميل السائب لحوامل ENS بالكامل مع مؤشر Ca2+ عالي التقارب مثل Fluo-4 بقياسات استجابات Ca2+ في الخلايا العصبية الفردية أو الخلايا الدبقية. يمكن استحضار هذه الاستجابات بشكل متكرر وموثوق ، مما يسمح بإجراء دراسات كمية باستخدام الأدوات الدوائية. يتم تسجيل استجابات Ca2+ في خلايا ENS باستخدام مجهر فلوري مزود بكاميرا جهاز مقترن بالشحن المبرد (CCD). توفر قياسات التألق التي تم الحصول عليها باستخدام تصوير Ca2 + في مستحضرات التثبيت الكاملة وسيلة مباشرة لتوصيف الآليات والعواقب الوظيفية المحتملة لاستجابات Ca2 + في الخلايا العصبية المعوية والخلايا الدبقية.

المقدمة

وينظم الجهاز العصبي المعوي (ENS) إلى قسمين الضفائر عقدي جزءا لا يتجزأ من داخل جدار الجهاز الهضمي 1. هذه الدوائر العصبية في العضل، الضفيرة العضلية المعوية (MP) والضفيرة تحت المخاطية (SMP)، وتتكون من الخلايا العصبية والدبقية المعوية (الشكل 1) (2). النائب وSMP تنظيم الجهاز الهضمي (GI) وظائف مثل حركية الأمعاء وامتصاص الظهارية وإفراز، على التوالي 3. وتقع الدبقية المعوية على مقربة من الخلايا العصبية في العقد ولكن سكان الدبقية المعوية موجودة أيضا في ربط مساحات الألياف وأجزاء خارج العقدية من جدار الأمعاء 3،4. ويعتقد الدبقية المعوية في الأصل لتقديم الدعم المغذي فقط إلى الخلايا العصبية. ومع ذلك، الدراسات الحديثة تشير بقوة إلى أن التفاعلات العصبية، الدبقية ضرورية لENS يعمل 5،6. على سبيل المثال، تشير البيانات إلى أن الدبقية المعوية "الاستماع" إلى نشاط الخلايا العصبية 7وتعدل الدوائر العصبية 6،8، وحماية الخلايا العصبية المعوية من الاكسدة 9 وتكون قادرة على توليد الخلايا العصبية المعوية جديدة استجابة للإصابة 10،11. بروتوكول الواردة في هذا الاستعراض التقني يوفر طريقة بسيطة وقوية لدراسة تفاعل معقد بين الخلايا العصبية والدبقية المعوية باستخدام في الموقع الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التصوير.

كاليفورنيا 2+ هو جزيء إشارة في كل مكان في الخلايا منفعل ويلعب دورا أساسيا في الأحداث يشير متشابك في الجهاز العصبي 12. الإثارة من الخلايا العصبية أو الدبقية المعوية يتسبب إرتفاع في هيولي تركيز الكالسيوم 2+ إما عن طريق تدفق الكالسيوم من خلال قنوات 2+ -permeable أو الكالسيوم 2+ إطلاق سراح من مخازن الكالسيوم داخل الخلايا. التصوير كاليفورنيا 2+ العابرين في الخلايا العصبية والدبقية مع الأصباغ الفلورية وثابتة والتقنية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة التنظيم الوظيفي وديناميكيةفي 13-17 ENS. وقد تبين التصوير كاليفورنيا 2+ أن تكون أداة هامة في دراسة سليمة شرائح الأنسجة GI لتوضيح انتشار استثارة من خلال شبكات تنظيم ضربات القلب المحكمة الجنائية الدولية 18 والأمعاء العضلات الملساء 19،20. وهي تمكن الباحثين للتحقيق في طيف واسع من المعلمات الفسيولوجية ويقدم معلومات عن كل من توزيعها المكاني والزماني ديناميات. الخلايا يمكن أن تكون ملطخة بكفاءة بطريقة الغازية الحد الأدنى باستخدام مؤشرات الفلورسنت نفاذية الغشاء والبروتوكولات تلطيخ الأمثل 21. هذا يتيح الفرصة لمراقبة عدد كبير من الخلايا العصبية والدبقية المعوية في الأعمال التحضيرية الحفاظ عليها وظيفيا 14-16،22، وكذلك في الجسم الحي 23. جبل كامل الاستعدادات الأنسجة هي الأكبر محملة عالية تقارب الكالسيوم 2+ مؤشر صبغ مثل فلوو-4 الذي يزيد مضان لها عندما بد أن الكالسيوم 2+. يتم تسجيل التغيرات في مضان بواسطة كاميرا CCD وآناlyzed رقميا 6. قدم ظهور الكالسيوم 2+ الفرصة لمراقبة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية التفاعلات، والاستجابة لمختلف المحفزات، وإشراك أنواع الخلايا هذه في عمليات الجهاز الهضمي في الوقت الحقيقي.

في الموقع قد حقق التصوير الكالسيوم 2+ بصيرة آليات الإشارات من الخلايا العصبية المعوية والدبقية وتمتلك عدة مزايا واضحة على نماذج ثقافة الخلية 6،24. أولا، في الموقع استعدادات المحافظة على البيئة مصفوفة الأم من الخلايا العصبية والدبقية وترك الجزء الأكبر من صلاتهم لاستهداف الأنسجة سليمة. وثانيا، فإن علم الوراثة ومورفولوجية الدبقية المعوية مثقف وبشكل ملحوظ مقارنة اختلف في الجسم الحي 6،24. ثالثا، يتم فقدان كثير من التفاعلات غيروي في زراعة الخلايا الأولية وهذه حدود تقييم التفاعلات خلية خلية. على الرغم من أن الخلايا المستزرعة هي مناسبة تماما للتحقيق في الخصائص الأساسية، usefulne بهمSS لدراسة التفاعلات المعقدة بين الدبقية المعوية والخلايا العصبية محدودة. التحقيق تفاعل الخلايا العصبية، الدبقية باستخدام نهج في الموقع أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة كما تبقى مسارات متشابك سليمة 25. بالمقارنة مع النهج ثقافة الخلية، وهو نهج الموقعي في تقدم وتحسن الظروف لفهم منهجي التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية والدبقية المعوية. وعلاوة على ذلك، فإن المنظمة مستو من الضفيرة عقدي في الاستعدادات الكاملة جبل مثالية للتصوير الفلورسنت من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ العابرين ويوفر هذا الأسلوب نهجا واضحة لتقييم نشاط الخلايا العصبية الدبقية في ENS.

البروتوكول

ملاحظة: الإجراءات التالية التي تنطوي على أنسجة من حيوانات المختبر تتسق مع المبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات عام 2013 وتمت الموافقة مسبقا من قبل جامعة ولاية ميشيغان IACUC.

1. إعداد الأنسجة

  1. تخدير الحيوان البحوث في غرفة تحتوي على 2.5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين أو عن طريق وضع 3-5 مل من الأيزوفلورين السائل على مادة ماصة على أرضية الغرفة، وضمان أن حاجز مادي يمنع الحيوانات من الاتصال المباشر مع الأيزوفلورين. اختبار لمدى عمق التخدير بواسطة معسر قاطع الطريق.
    ملاحظة: ويعتبر عمق التخدير المناسب عندما لا يكون هناك رد فعل الانسحاب من أطرافهم هند. مرة واحدة تخدير مناسب، الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم
  2. وضع الحيوان في موقف ضعيف وتنظيف جلد البطن مع الايثانول 70٪. استخدام ملقط لقرصة جلد البطن في خط الوسط واستخدام مقص جراحي لجعل وسائل الاعلام 6 سمل شق على طول الخط ألبا لفضح الجهاز الهضمي الداخلية.
  3. استخدام ملقط حادة لتحديد مكان وفضح الدقاق داخل الصفاق. قطع مساريق لفائفي / القولون مع مقص والبدء في كشف الأمعاء.
  4. بمجرد كشفا طول الأمعاء بشكل كاف، وقطع القاصي الأمعاء والمعدة والأقرب إلى الأعور لإعداد الدقاق. لإعداد الأمعاء الغليظة، وقطع القاصي القولون الأعور والأقرب إلى المستقيم.
  5. بسرعة إزالة جزء الأمعاء ووضعه في كوب مع وسائل الاعلام DMEM / F12 تستكمل مع 3 ميكرومتر نيكارديبين هيدروكلوريد و 1 ميكرومتر سكوبولامين هيدروكلوريد (المشار إليها فيما يلي باسم "وسائل الإعلام") على الجليد. إضافة هذه المثبطات تسهل تسليخ مجهري والتصوير لاحق عن طريق شل العضلات الملساء الأمعاء.
  6. شريحة قطع من الفائدة (على سبيل المثال، الصائم، اللفائفي والقولون البعيدة أو القريبة) على أساس علامات تشريحية المعمول بها. utiliz عادةالبريد الأنسجة من الدقاق البعيدة أو القولون البعيدة. ومع ذلك، استخدام نفس الإجراء الأساسي لعزل، تحميل والصورة الخلايا العصبية العضلية المعوية والدبقية في جميع المناطق المعوية.
  7. إزالة شريحة صغيرة (4-6 سم) من شريحة الأمعاء المطلوب وضعها في طبق بتري Sylgard المغلفة مليئة سائل الإعلام المبردة.
  8. تأمين القريبة والبعيدة نهايات الجزء الأمعاء مع دبابيس الحشرات وفتح أنبوب الأمعاء عن طريق جعل على التوالي، وقطع بالطول على طول الحدود المساريقي.
  9. دبوس الأنسجة مسطحة تحت التوتر الخفيف مع الجانب الغشاء المخاطي صعودا وبعناية تشريح بعيدا طبقة المخاطية باستخدام ملقط غرامة (رقم 5 و 5/45 عمل أفضل) ومقص الربيع الجميلة جدا.
    ملاحظة: إزالة الغشاء المخاطي يمكن أن تكون مؤلمة جدا لENS إذا لم تفعل بشكل صحيح. للتحضير الجودة، ورعاية للحد من إزالة مفاجئة من الغشاء المخاطي عن طريق تقشير أو كشط. أفضل الممارسات لرفع الغشاء المخاطي وقطع تحت مع مقص غرامة.
  10. قطع الأنسجة في إعداد أصغرالصورة (حوالي 0.5 سم 2) ودبوس في أطباق التصوير (4 زوايا مع طبقة العضلات الدائرية التي تواجه متابعة) وضعت على الجليد مع وسائل الإعلام الطازجة.
  11. تشريح بعناية بعيدا عضلة الدائرية التي كتبها إغاظة بعيدا مع ملاقط غرامة لفضح الضفيرة العضلية المعوية. تجنب الإفراط في التمدد.
  12. وضع طبق التصوير مرة أخرى على الجليد والتغيير حل مع وسائل الإعلام الطازجة.
  13. إعداد 2 مل من مزيج انزيم في طبق [Dispase 1 U / مل (4.48 ملغ / 8 مل)، كولاجيناز النوع الثاني 150 U / مل (5.45 ملغ / 8 مل) في وسائل الإعلام].
  14. إزالة أطباق من الجليد وإضافة مزيج انزيم من الخطوة 1.13.
  15. احتضان الأطباق في RT لمدة 15 دقيقة مع 5٪ CO 2/95٪ الجوية.
  16. غسل الاستعدادات الأنسجة مع وسائل الاعلام 3 مرات وزوايا إعادة دبوس.

2. تحميل فلوو-4 صبغ

ملاحظة: تجنب photobleaching من خلال العمل مع ضوء محدود أثناء التعامل مع الأصباغ الفلورية والأنسجة محملة الأصباغ المؤشر.

  1. إعداد 4 ميكرومتر فلوو-4 حل التحميل.
    1. إضافة 1.5 مل سائل الإعلام و 1.2 ميكرولتر من 250 ملي الأسهم البروبينسيد إلى قسامة 1.5 ميكرولتر من 4 مم فلوو-4 المخزون. ويتم إعداد 4 ملي فلوو-4 الأسهم عن طريق إضافة 11.4 ميكرولتر من pluronic F-127 (20٪ في DMSO، على أن تستكمل مع 0.25٪ cremaphor-EL) إلى 50 ميكروغرام من فلوو-4، AM.
  2. احتضان محضرات في فلوو-4 الحل تحميل لمدة 45 دقيقة في حاضنة مظلمة عند 37 درجة مئوية.
  3. إزالة من الحاضنة وغسل الاستعدادات مع وسائل الاعلام 3 مرات.
  4. وسائل الإعلام مقابل وسائل الإعلام التي تحتوي على 200 ميكرومتر البروبينسيد واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل التصوير.
    ملاحظة: بالبروبنيسيد هو الدواء الذي يمنع النقل المقاومة للأدوية المتعددة في الخلايا العصبية. بالإضافة لهذا الدواء يمنع قدرة الخلايا العصبية لبثق الأصباغ ويعزز وضع العلامات العصبية. السائبة التحميل من الكالسيوم 2+ الأصباغ مؤشر في غياب البروبينسيد تنتج أساسا الدبقية تحميل الخلية. إضافة البروبينسيد تسمح لرؤية الردود العصبية والدبقية.
  5. إعداد التعديل KREبكالوريوس العازلة.
    1. جعل منطقة عازلة كريبس المعدلة مثل أن تركيزات النهائية (مم) من المكونات هي على النحو التالي: 121 كلوريد الصوديوم، و 5.9 بوكل، 2.5 CaCl 2، 1.2 MgCl 2، 1.2 ناه 2 PO 4، 10 HEPES، 21.2 NaHCO 3، 1 البيروفيك حمض و 8 الجلوكوز (درجة الحموضة تعديل إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم). إضافة 3 ميكرومتر نيكارديبين و1 ميكرومتر سكوبولامين لمنع تقلصات العضلات أثناء الكالسيوم 2+ التصوير وكله يشن تشريح.

3. التصوير وتحليل

ملاحظة: استخدام ما لا يقل عن تلاعب التصوير الأساسي مع مصدر ضوء الفلورسنت، المجهر، وكاميرا CCD الجودة وبرنامج الحصول المناسب. تختلف إضافة مكونات أخرى اعتمادا على مصدر الضوء وتطبيق معين. يجب استخدام عجلة تصفية ومصراع مع مصدر ضوء زينون التقليدي القوس. ومع ذلك، مصادر الضوء LED وأنظمة الإضاءة لا تتطلب هذه المكونات.

  1. ضع تفصيلأوردينج غرفة تحت المجهر وباستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية مع عدة خزانات حقنة ساخنة تحديد معدل نضح المستمر من 2-3 مل / دقيقة من 37 درجة مئوية كريبس العازلة. تأكد لمنع تشكيل فقاعة الهواء في كل من المدخلات وشفط خط متصل فخ الفراغ.
  2. جلب الضفيرة المطلوب في التركيز تحت إضاءة ساطعة المجال. تجنب تعريض الأنسجة، مما قد يؤدي إلى الصورة التبييض.
  3. دراسة تحميل فلوو-4 ضمن العقد وحدد العقد صحي للتصوير. وغير صحية العقد / التالفة تظهر تألق ذاتي أو منقط التشكل وينبغي ألا تستخدم للتصوير.
  4. مرة واحدة يتم تحديد العقدة، تحويل مسار الضوء إلى الكاميرا والحصول على صورة حية مع برنامج الحصول على الصور. تأكد من أن العقدة هي في التركيز وتعيين صورة ومعدل اقتناء والتعرض مرات.
    ملاحظة: سوف معدلات اكتساب صورة والأوقات تختلف تبعا لأحداث المحققين ترغب في تسجيل. بالنسبة لمعظم التجارب، صوريتم الحصول على تقليديا في 0.5-1 هرتز للخلايا الدبقية وتصل إلى 2-10 هرتز لالخلايا العصبية بسبب ردود الدبقية الكالسيوم 2+ ليست سريعة مثل الكالسيوم 2+ العابرين في الخلايا العصبية.
  5. تبدأ التجربة وإقامة النشاط الأساسي لمدة 30 ثانية.
  6. تطبيق المخدرات قبل تحسنت ذات الأهمية مثل منبهات مستقبلات ومضادات باستخدام نظام نضح تدفق الجاذبية بمعدل 2-3 مل / دقيقة. اتبع تطبيق منبهات / الخصوم من خلال العودة إلى نضح من العازلة العادي والسماح لفترة الغسيل / استرداد 10 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: تختلف الأوقات تطبيق المخدرات تبعا لمجمع الفردي والتصميم التجريبي. بشكل عام، تطبيق 20-30 ثانية من ناهض كافية لتنشيط مستقبلات البروتين G-يقترن في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. ومع ذلك، القنوات الأيونية بوابات يجند (مثل مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية) تتطلب مرة تطبيق لا يزيد عن 5-10 ثانية. سوف التعرض مدة أخرى تسبب يجند بوابات القنوات الأيونية لDESE بسرعةnsitize. وينبغي تطبيق الخصوم لحوالي 3-15 دقائق لضمان الحصار الكامل لمسارات مستقبلات. ومع ذلك، وهذا هو التعميم الإجمالي، وينبغي أن المحققين دائما تحسين أي دواء التجريبية في نموذج بصفة خاصة.
  7. إيقاف التسجيل وعرض الوقت الفاصل بين الفيلم التجربة. مناطق مختارة بعناية من الفائدة (ROI ل) باستخدام المناسب برنامج تحليل الصور.
  8. استخدام البرمجيات لتطبيع ومقارنة العائد على الاستثمار كثافة الفلورسنت ضد القيمة الأولية الفلورسنت خط الأساس. التغيرات في مضان تطبيع ويتناسب طرديا مع التغيرات في [كا 2+].
    1. استخدام تعديل طريقة التي سبق وصفها باستخدام 26 ΔF / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) الخلفية، حيث F1 هو مضان في أي يعطى نقطة وF0 هي مضان خط الأساس، لتحسين دقة التقييم. يساعد هذا التعديلفي الحد من الضوضاء من التغييرات مضان في الاستعدادات الأنسجة التي تظهر حركة طبقة العضلات الكامنة وراء الضفيرة العضلية المعوية.

النتائج

الاستخدام السليم لهذه التقنية تسمح للمحققين تقيس بدقة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ [كا 2+] ط العابرين في الخلايا العصبية المعوية والدبقية في جبل لالجامع الاستعدادات الأنسجة. ويرد مثال ممثل ل-أثار ناهض الكالسيوم 2+ الردود في الدبقية ضمن العقدة العضلية المعوية من القولون الماوس في فيديو 1. وتهدف النتائج التالية لتوضيح بعض النتائج التمثيلية التي حصلنا عليها باستخدام هذا الأسلوب. أولا، يوضح الشكل (2) ونتائج تجربة قياس الدبقية المعوية [كا 2+] ط التغييرات ردا على التحفيز عن طريق ATP داخل خنزير غينيا القولون طولية الضفيرة العضلية المعوية العضلات (LMMP) الاستعدادات. على وجه التحديد، ويظهر هذا الرقم أسلوب التحليل السليم للبروتوكول تجريبي المذكورة أعلاه بما في ذلك الخطوط العريضة للالعقدة، والنجمة تدل على مكان الخلايا العصبية العضلية المعوية المعوية تحليلها. هذه النتائج أيضا طllustrate الجرعة المثلى من مائة ATP مكرومولي على تعبئة [كا 2+] i في خنزير غينيا الدبقية العضلية المعوية. هذا الرد يمكن أن تستخدم لمعايرة التحفيز الدبقية المعوي وتطبيع الردود على اختبار المحفزات. وبعد ذلك، بالتعريف الشكل (3) كيفية تحديد المناطق ذات الاهتمام (رويس) المحيطة الخلايا الدبقية بشكل صحيح، كما هو موضح مع توضيح الدوائر الصفراء. تظهر هذه النتائج أيضا التغييرات مضان المطلوب في ظل الظروف القاعدية واستجابة للمؤثرات الدوائية. وأخيرا، يوضح الشكل 4 الاعتبارات المكانية لاختيار الدبقية المعوية والخلايا العصبية ل[كا 2+] ط الردود في الاستعدادات الكاملة جبل.

figure-results-1
الشكل 1. منظمة ENS. وتتضمن ENS اثنين من الضفائر عقدي الرئيسية. يقع الضفيرة العضلية المعوية بين لطبقات العضلات ongitudinal ودائرية. يقع الضفيرة تحت المخاطية بين الغشاء المخاطي وطبقة العضلات الدائرية. وتتألف ENS فقط من الخلايا العصبية والدبقية المعوية. مساحات الألياف العصبية تربط العقد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. المعوية الدبقية في خنزير غينيا القولون الضفيرة العضلية المعوية الاستجابة لاعبي التنس المحترفين في الموقع. (A) فلوو-4 مضان في العقدة العضلية المعوية (التي حددها خط متقطع) في ظل الظروف القاعدية. وتشير الأسهم لمساحات سميكة من الألياف بين العقد. (ب) عند التحفيز مع 100 ميكرومول / L ATP، الخلايا الدبقية، ولكن ليس الخلايا العصبية، وزيادة بسرعة فلوو-4 مضان مما يشير إلى زيادة في [كا 2+] ط. لاحظ أن خلايا الاستجابة صغيرة وتحيط الخلايا العصبية أكبر من ذلك بكثير (الأماكن المظلمة تميزت العلامات النجمية). (C) الدبقية المعوية تستجيب لATP بطريقة تعتمد على الجرعة مع 1 مليمول / L مثيرة لاستجابات القصوى 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. الفئران S-100-GFP + الخلايا في القولون العضلي المعوي الاستجابة الضفيرة لاعبي التنس المحترفين في الموقع. (A) S-100-GFP + الخلايا الدبقية (الأخضر) في الماوس القولون العقدة العضلية المعوية (التي حددها خط متقطع). وتظهر ست مناطق من الفائدة (رويس) المحيطة الخلايا الدبقية ضمن العقد كما الدوائر الصفراء. السهام تشير مساحات الألياف سميكة المؤدية إلى العقدة. النجمة دموقع enote من 2 الخلايا العصبية المعوية. (ب) نفس العقدة تظهر Rhod-2 مضان في ظل ظروف القاعدية. (C) وبعد التحفيز مع 100 ميكرومول / L ATP، الخلايا الدبقية تستجيب مع زيادة [كا 2+] أنا كما يتضح من زيادة Rhod- 2 مضان. (D) آثار المقابلة لكل ROI هو مبين في A-C. (E) بلغ متوسط ​​استجابة (يعني ± SEM) من 6 رويس هو مبين في D 24. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. في مجال التصوير الموقع من المعوي الاتصالات العصبية إلى الدبقية. (A) صور الممثل (pseudocolored) من تجربة التصوير الكالسيوم 2+ حيث كله جبلوطعن إعداد الضفيرة العضلية المعوية مع الخلايا العصبية P2X7 مستقبلات ناهض BzATP (100 ميكرومتر، 30 ثانية). لاحظ أن ناهض العصبية يسبب زيادة في Fluo4 مضان في الخلايا العصبية (A ') قبل المحيطة بها الخلايا الدبقية المعوية (A "). (ب) تحليل التغير في مضان على مر الزمن في الدبقية (الأزرق) والخلايا العصبية (الحمراء ) بعد تطبيق ناهض الخلايا العصبية، BzATP. (C) العصبية واستجابات الدبقية لBzATP في المخزن العادي (خطوط الصلبة) وفي العازلة التي تحتوي على الكالسيوم منخفض 2+ والمغنيسيوم 2+ (الخطوط المتقطعة) لتحفيز مستقبلات P2X7 العصبية (13). من فضلك انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1. أثار ناهض الكالسيوم 2+ رد في الدبقية المعوية فيالموقع. يظهر هذا الفيديو على العقدة العضلية المعوية من القولون البعيدة الماوس محملة كا 2+ صبغ المؤشر، فلوو-4. ناهض الخلايا الدبقية، ADP، يضاف إلى الحمام عند اللزوم. ADP يتسبب زيادة في الكالسيوم داخل الخلايا الدبقية في 2+ المعوية كما لوحظ من خلال الارتفاع عابر في فلوو-4 مضان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

المناقشة

توفر المنهجيات الموضحة في هذه المخطوطة نهجا متسقا لدراسة الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المعوية بشكل فعال في ENS. على الرغم من أن تصوير الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المعوية في الثقافة قد أسفر عن ثروة من الأفكار حول وظيفة الخلايا الفردية ، إلا أن دراسة هذه الخلايا في بيئتها الأصلية متعددة الخلايا أمر بالغ الأهمية لفهمنا لفهم علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية. يعد الفحص المجهري الفلوري تقنية حاسمة لتقييم التفاعلات متعددة الاتجاهات للخلايا في ENS. يسمح تحميل خلايا ENS بعلامات الفلورسنت الانتقائية والحصول على الصور باستخدام الفحص المجهري عالي الدقة بالملاحظات الكمية للنشاط الخلوي في ENS. يتم إجراء تصوير عينات الأنسجة الحية من ENS بسرعة نسبيا ويولد كميات كبيرة من البيانات الوظيفية والمكانية المتعمقة. تسمح مستحضرات الضفيرة العضلية المعوية وتحت المخاطية للفأر المستخدمة في هذه التجارب بأساليب التلاعب الجزيئي والجيني. يوفر تصوير Ca2+ في المستحضرات الكاملة أداة مفيدة لتقييم تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية.

في النماذج التجريبية المتقدمة ، يمكن دمج العديد من المجسات للحصول على معلومات حول الأحداث المختلفة داخل الخلايا. يمكن للفحص المجهري الفلوري تسجيل الصور ذات التباين المحسن لجزيئات معينة ، إذا تم استخدام ملصق فلوري مناسب. تم اختيار Fluo-4 لأنه يمتلك نطاقا ديناميكيا كبيرا. يعد وقت الحضانة الكافي أمرا حيويا عند استخدام أصباغ AM في ENS. قد يلزم تعديل تركيز الصبغة وطريقة التحميل لتحقيق أفضل النتائج. يجب تحميل المستحضرات المثالية بصبغة كافية لتصور التغيرات في التألق ولكن ليس لدرجة أن الصبغة تخلب الأيونات المستهدفة وتتداخل مع الإشارات داخل الخلايا. يجب أن يقتصر التعرض للضوء الفلوري على منع السمية الضوئية في الخلايا والتبييض الضوئي للأصباغ.

يجب على المحققين توخي الحذر في عدة خطوات من هذه التجربة ، وخاصة تحضير المحلول والأنسجة. يجب توخي الحذر بشكل خاص أثناء معالجة وتشريح أنسجة ENS من أجل الحفاظ على الوظائف الخلوية. يحتوي الجهاز الهضمي على عدة طبقات وأنواع من الأنسجة ، والتي تشكل تحديات للتشريح وجودة التصوير في هذه المستحضرات الكاملة 27. علاوة على ذلك ، فإن المسالك الليفية المترابطة ل MP أوسع والعقد أكبر من تلك الموجودة في SMP 2. كثافة الخلايا العصبية للضفيرة العضلية المعوية أعلى مقارنة بكثافة الضفيرة تحت المخاطية 28. سيكون للتشريح البطيء وغير الدقيق آثار ضارة على جودة مستحضرات الضفيرة وبالتالي النجاح العام للتجارب. لذلك ، فإن الأدوات النظيفة / غير التالفة والممارسة والبراعة اليدوية أمر بالغ الأهمية لهذا الإجراء.

في مستحضرات الأنسجة الكاملة ، يجب مراعاة دقيق عند رسم مناطق الاهتمام (ROI) لتقييم الحركية بشكل صحيح ودرجة التغيير الملحوظ في شدة التألق لنوع الخلية المطلوب. نظرا لأن العقد تقع على طبقة عضلية مقلصة ، فإن القطع الأثرية الحركية الناتجة عن حركة الأمعاء هي مصدر قلق أساسي أثناء التصوير في الموقع . وبالتالي ، فإن قمع اضطرابات الحركة هذه من خلال إعادة تثبيت مستحضرات الأنسجة بعد الحضانة بالإنزيمات وإضافة التثبيط الدوائي (نيكارديبين / سكوبولامين) إلى المخازن المؤقتة يسمح بالحصول على صور واضحة وموثوقة. بصرف النظر عن علم الأدوية والأساليب الميكانيكية لمنع حركة الأنسجة ، توضح الدراسات الحديثة تطبيق منهجيات البرمجيات المتقدمة وخصائص استجابة نوع الخلية لتصحيح حركة الأنسجة المتبقية في التسجيلات وتحسين دقة التحليل 29. باستثناء هذه العقبات التقنية ، توفر هذه الطريقة ظروفا فسيولوجية ذات صلة لتقييم الخصائص المورفولوجية والكمية للخلايا العصبية والدبقية المعوية في ENS.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة جمعية البحوث والمصنعين الصيدلانية الأمريكية (PhRMA) (إلى B. Gulbransen) ، والمعاهد الوطنية للصحة (بناء وظائف بحثية متعددة التخصصات في صحة المرأة) منحة K12 HD065879 (B. Gulbransen) وأموال بدء التشغيل من جامعة ولاية ميشيغان (B. Gulbransen).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سخان حقنة BubbleStop AutoMate Scientific10-4-35-G
CaCl2SigmaC3306
كولاجيناز ، النوع الثاني ، مسحوقGibco17101-015
DispaseSigma-Aldrich42613-33-2
أدوات التشريحRoboz & nbsp ؛
DMSOسيجما - ألدريتشD5879
مجهر المرحلة الثابتةأوليمبوس  BX51WI
Fluo-4 AM صبغةInvitrogenF-14201
جلوكوزسيجماG8270
دبابيس الحشراتأدوات العلوم الدقيقةدبابيس Minutien iQ
برنامج تصوير الخلايا الحيةأندورأندور iQ3
KClسيجماP3911
MgCl2< / sub>SigmaM9272
كلوريد الصوديومسيجماS9888
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaS6014
Neo sCMOSكاميرا AndorNeo 5.5 sCMOS
NicardipineSigmaN7510
غرفةالتروية
جهاز هارفاردموديل 720
بلورونيك F-127   ؛InvitrogenP3000MP
المجسات الجزيئيةProbenecidP36400
ScopolamineSigmaS1013   ؛
سوتر لامدا DG-4سوترDG-4
سيلغارد داو كورنينج184
وحدة تحكم في درجة الحرارةوارنر إنسترومنتسTC-344C
مضخة تمعجية مخصصة

المراجع

  1. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  2. Furness, J. B. The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections. Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  3. Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).
  4. Nasser, Y., et al. Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).
  5. Glial cells in the gut. Neurogastroenterology & Motility. 17 (6), 777-790 (2005).
  6. Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. J. Physiol. 590, 335-350 (2012).
  7. Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon. J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).
  8. McClain, J. L., et al. Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
  9. Chandrasekharan, B., et al. Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress. Neurogastroenterology & Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55, 630-637 (2006).
  12. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).
  13. Gulbransen, B. D., et al. Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis. Nat Med. 18, 600-604 (2012).
  14. Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon. J Physiol. 588, 399-421 (2010).
  15. Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).
  16. Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation. J Physiol. 526, 375-385 (2000).
  17. Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system. Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).
  18. Hennig, G. W., et al. Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum. Neurogastro Motil. 14, 575(2001).
  19. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes. Nature. 399, 62-66 (1999).
  20. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine. Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).
  21. Jessen, K. R., et al. Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia. Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).
  22. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).
  23. Gomes, P., et al. ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice. Neurogastroenterology & Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).
  24. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system. Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).
  25. Ren, J., Bertrand, P. P. Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons. Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).
  26. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).
  27. Dongcheng, Z., et al. Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy. Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).
  28. Gershon, M. D. Behind an enteric neuron there may lie a glial cell. J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).
  29. Boesmans, W., et al. Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تصوير الكالسيومتحضير العينة كاملةصبغة مؤشر فلوريةمجهر الفلورسنسالضفيرة المعويةتحميل Fluo-4التحفيز الدوائيالحصول على الصورنشاط الخلايا الدبقية
في الموقع الكالسيوم 2+ التصوير من الجهاز العصبي المعوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.