يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير المحلية الكالسيوم

10.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52516

⸱

مارس 3, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 2Physiology and Biophysics, University of California, Irvine

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا تقنيات لتصوير أحداث Ca2+ المحلية بوساطةIP 3 باستخدام المجهر الفلوري في خلايا الثدييات السليمة المحملة بمؤشرات Ca2 + جنبا إلى جنب مع خوارزمية تعمل على أتمتة تحديد وتحليل هذه الأحداث.

الملخص

عصاري خلوي كا 2+ أيونات تنظم جوانب عديدة من النشاط الخلوي في جميع أنواع الخلايا تقريبا، والعمليات كما واسع النطاق كما النسخ الجيني، استثارة الكهربائية وتكاثر الخلايا السيطرة. تنوع وخصوصية الكالسيوم 2+ إشارات مستمد من الآليات التي يتم إنشاؤها الكالسيوم 2+ إشارات للعمل على نطاقات زمنية ومكانية مختلفة، بدءا من التذبذبات على مستوى الخلية وموجات تحدث خلال فترات دقيقة لمحلية عابرة الكالسيوم 2+ microdomains (الكالسيوم 2+ نفث) ميلي ثانية دائمة. تضاعفت التطورات الحديثة في الإلكترون CCD (EMCCD) الكاميرات تسمح الآن للتصوير من الكالسيوم المحلية 2+ الإشارات مع قرار المكاني 128 × 128 بكسل وفقا لأسعار> 500 لقطة في الثانية -1 (إطارا في الثانية). هذا النهج هو مواز للغاية ويمكن رصد في وقت واحد من مئات القنوات أو المواقع نفخة في تجربة واحدة. ومع ذلك، فإن كميات هائلة من البيانات ولدت (حوالي 1 غيغابايت بيص دقيقة) تجعل التعرف البصري وتحليل الكالسيوم المحلي 2+ الأحداث عملي. نحن هنا وصف وشرح إجراءات الاستحواذ، والكشف، وتحليل IP المحلي 3 بوساطة الكالسيوم 2+ الإشارات في خلايا الثدييات سليمة محملة الكالسيوم 2+ المؤشرات باستخدام كل واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان (WF) والانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية وضعت داخل المصدر المفتوح البرمجيات بيثون البيئة بأتمتة تحديد وتحليل هذه الكالسيوم 2+ إشارات المحلية. الخوارزمية يموضع مواقع الكالسيوم 2+ الإفراج لقرار الفرعي بكسل. يسمح للمستخدم باستعراض البيانات؛ والنواتج متواليات وقت إشارات نسبة مضان جنبا إلى جنب مع السعة والبيانات الحركية في جدول Excel متوافق مع.

المقدمة

أيونات الكالسيوم (الكالسيوم 2+) تنظيم بتواجد مطلق مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني، إفراز وتغييرات طويلة الأمد في اللدونة متشابك 1. طريقة واحدة يمكن من خلالها الكالسيوم 2+ يمكن أن تعمل بطريقة مختلفة يتم من خلال أنماط المكانية والزمانية مختلفة من الكالسيوم 2+ اشارات يمكن خلية تولد. على سبيل المثال الارتفاعات العالمية في عصاري خلوي [كا 2+] انكماش الزناد في أنسجة العضلات الملساء 2 في حين أن أصغر، ارتفاعات عابرة مترجم (المحلية الكالسيوم 2+ microdomains) تحفيز التعبير الجيني أساسي للتعلم والذاكرة 3.

عصاري خلوي مجانا [كا 2+] هو الحفاظ على ~ 100 نانومتر في بقية، ولكن يمكن أن يرتفع بسرعة لعدة الجزئي الضرس في أعقاب تدفق الكالسيوم 2+ في العصارة الخلوية من خلال الكالسيوم 2+ القنوات الأيونية -permeable الموجود في غشاء البلازما والتي تحرير الكالسيوم 2+ من الصورة داخل الخلاياTORES. يركز مختبرنا على إينوزيتول 1،4،5-trisphosphate مستقبلات (IP 3 R)، الذي يشكل الكالسيوم 2+ قناة الإفراج الموجود في غشاء الشبكة الإندوبلازمية (ER). على ملزمة لكلا IP 3 والكالسيوم 2+ إلى عصاري خلوي تفعيل مواقع مستقبلات، تفتح R قناة IP 3 لتحرير الكالسيوم 2+ المحتبسة داخل التجويف ER. الافراج عن الكالسيوم 2+ قد تبقى مقيدة مكانيا لمجموعة صغيرة من IP 3 روبية لتوليد microdomain عصاري خلوي المحلية من الكالسيوم 2+ (كاليفورنيا 2+ نفخة 4) أو، اعتمادا على قربها من التجمعات المجاورة IP 3 روبية، قد نشر عبر خلية من خلال تجنيد مواقع نفخة متعددة من خلال عملية الكالسيوم 2+ يسببها الكالسيوم 2+ -release (CICR) 5،6.

إدخال الأصباغ مؤشر جزيء صغير الفلورسنت الكالسيوم 2+ التي وضعتها روجر تسين 7، إلى جانب متقدمة المجهري imagi تقنيات نانوغرام، سهلت بشكل كبير فهمنا من الكالسيوم 2+ الإشارات. التطورات الحديثة في الكاميرات المستخدمة للفحص المجهري يسمح الآن لتصوير عابرة المحلية الكالسيوم 2+ أحداث مثل نفث مع القرار المكانية والزمانية لم يسبق له مثيل. المتاحة حاليا الكاميرات EMCCD تمكن التصوير مع 128 × 128 بكسل في> 500 لقطة في الثانية -1 (FPS) والجيل الجديد من مكمل معدن أكسيد أشباه الموصلات توفر (CMOS) كاميرات دقة أعلى بكسل، وحتى سرعة أكبر على حساب ارتفاع طفيف مستويات الضوضاء. بالتعاون مع الانعكاس الكلي الداخلي (TIRF) المجهري أصبح من الممكن الآن أن صورة واحدة الكالسيوم 2+ أحداث قناة 8،9. هذا النهج يتيح للتصوير المئات من القنوات / الأحداث في وقت واحد، في حين توليد مجموعات البيانات الكبيرة (حوالي 1GB لكل دقيقة) التي تجعل المعالجة اليدوية، وتحديد البصرية والتحليل غير عملي ووضع المسؤولية على عاتق تطوير خوارزميات الآلي.

الصورة = "jove_content"> هنا، نقدم إجراءات وبروتوكولات لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الإشارات في خلايا الثدييات سليمة باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ المؤشرات. علينا أن نظهر المزيد من خوارزمية وضعت في بيئة بيثون المصدر المفتوح بأتمتة تحديد وتحليل المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث المصورة من قبل كل من TIRF والتقليدية مجالا واسعا برنامج التحصين الموسع ومضان (WF) المجهري. على الرغم من أن وصفنا هذه النهج في سياق IP 3 -generated الكالسيوم 2+ إشارات، فهي قابلة بسهولة لدراسة التغيرات المحلية في عصاري خلوي [كا 2+] المنبثقة عن مجموعة متنوعة من الكالسيوم 2+ القنوات الأيونية -permeable تقع في أي سطح غشاء أو عضيات داخل الخلايا 8-10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

نقدم إجراءات تفصيلية لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث في العصبية البشري خلايا SH-SY5Y. ويمكن تكييف هذه الإجراءات لصورة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ إشارات في العديد من أنواع الخلايا 8-10.

1. إعداد الخلايا

  1. ثقافة الخلايا ليتم تصويرها وفقا لتعليمات المدرجة على المورد الخاصة بهم على شبكة الإنترنت.
  2. بضعة أيام قبل التصوير، وخلايا الحصاد نمت في قارورة زراعة الأنسجة باستخدام 1 مل من 0.25٪ التربسين / EDTA (2-3 دقيقة). وبعد انفصال، إضافة حجم مساو من وسائل الإعلام ثقافة لإبطال نشاط التربسين.
  3. إجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات والبذور الخلايا في أطباق التصوير أسفل الزجاج في كثافة 3-7 × 10 4 خلايا في طبق. حدد الخلايا للتجارب التصوير عندما تصل إلى 60٪ التقاء (2-3 أيام).

2. إعداد حلول والكواشف

  1. إعداد الكالسيوم 2+ المحتوية HEPES مخزنةمحلول الملح (كاليفورنيا 2+ -HBSS) تتكون من (مم): 135 كلوريد الصوديوم، و 5.4 بوكل، 2 CaCl 2، 1 MgCl 2، 10 HEPES، و 10 الجلوكوز. الرقم الهيدروجيني = 7.4 في درجة حرارة الغرفة (RT) مع هيدروكسيد الصوديوم. إعداد الكالسيوم 2+ -HBSS بدون إضافة السكر وتخزينها في 4 ° C. إضافة الجلوكوز في حل مباشرة قبل الاستعمال.
  2. ذوبان أشكال غشاء نفيذ من الفلورسنت الكالسيوم 2+ مؤشر كال-520 (1 ملم)، CI-IP 3 (200 ميكرومتر)، وEGTA (100 ملم) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) تحتوي على 20٪ pluronic F-127. قسامة هذه الكواشف في أنابيب إيبندورف وتخزينها، ومحمية من الرطوبة والضوء، في -20 ° C.

3. تحميل الخلايا مع غشاء نفيذ كال-520، CI-IP 3 و EGTA

  1. إعداد "العازلة تحميل" عن طريق تمييع الحلول الأسهم من غشاء نفيذ كال-520 و CI-IP 3 إلى تركيز النهائي من 5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر، على التوالي، في كا 2+ -HBSS.
  2. نضح مكعبوسائل الإعلام lture وشطف الخلايا عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع الكالسيوم 2+ -HBSS ثلاث مرات.
  3. إزالة الكالسيوم 2+ -HBSS واحتضان الخلايا في العازلة تحميل لمدة 60 دقيقة في RT في الظلام.
  4. إزالة العازلة تحميل وشطف الخلايا عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع الكالسيوم 2+ -HBSS ثلاث مرات.
    1. إذا رغبت في ذلك، في هذه الخطوة، خلايا الحمل مع EGTA / AM عن طريق تمييع الحل الأسهم إلى التركيز النهائي من 5 ميكرومتر في كا 2+ -HBSS ثم احتضان الخلايا لمدة 30-60 دقيقة في RT في الظلام. وبعد هذه الحضانة، وشطف خلايا ثلاث مرات مع الكالسيوم 2+ -HBSS قبل الانتقال إلى الخطوة 3.5.
  5. احتضان خلايا في كا 2+ -HBSS لمدة 30 دقيقة للسماح دي الأسترة من الكواشف المحملة.
  6. مباشرة قبل التصوير، ويحل محل الكالسيوم 2+ -HBSS مع "جديدة" كا 2+ -HBSS من أجل إزالة أي صبغة يمكن أن تكون قد تسربت إلى الحمام أثناء الحضانة النهائية.

4. الكالسيوم 2+ الحصول على صورة

  1. وضع قطرة صغيرة من زيت الغمر على الهدف 100X APO TIRF (NA 1.49).
  2. تركيب صحن التصوير على مسرح المجهر المقلوب وجعل الخلايا في التركيز باستخدام الضوء المرسل. من المهم لتأمين طبق التصوير لمنع الحركة أثناء التسجيل.
  3. تضيء الخلايا مع ليزر 488 نانومتر من أجل إثارة كال-520 وجمع مضان المنبعثة (λ> 510 نانومتر) باستخدام كاميرا EMCCD عالية السرعة.
    ملاحظة: حزمة البرامج التي تعمل المجهر تسمح للمستخدم لترجمة عدسة التركيز السماح شعاع الليزر ليتم إدخال إما على حافة القصوى من الفتحة الخلفية الموضوعية (لTIRF الإثارة) أو أكثر مركزيا (ل"WF" الإثارة).
  4. باستخدام برنامج EMCCD، والحد من مجال التصوير من كامل 512 × 512 بكسل من أجل جمع البيانات على قرار الزمني اللازم لالتقاط المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث.
    ملاحظة: على سبيل المثال، رباعية مركزيةالحصول على 256 × 256 بكسل بسرعة تصل نسبة الاستحواذ إلى 66 إطارا في الثانية. ومن الممكن أيضا لزيادة معدل الإطار الكاميرا EMCCD إلى 500 إطارا في الثانية باستخدام وظيفة وضع المحاصيل المعزولة.
  5. تكوين برنامج لتسجيل تلقائيا بضع ثوان من النشاط الأساسي، وتقديم ومضة الأشعة فوق البنفسجية على الخلايا وتستمر لمدة 10-30 ثانية تسجيل آخر.
    ملاحظة: يتم تسليم وميض الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مصدر ضوء قوس زينون قدم من خلال الأشعة فوق البنفسجية تعكس مرآة مزدوج اللون في ميناء الخلفي للالمجهر. يتم تعديل مدة وشدة فلاش للأشعة فوق البنفسجية تجريبيا لاستحضار تردد المطلوب من الكالسيوم المحلية 2+ الأحداث.
  6. حفظ الملفات كما مداخن صورة للتحليل خارج الخط.

5. الكالسيوم الآلي تحليل 2+ صورة

ملاحظة: من الممكن لعرض ومعالجة وتحليل البيانات التي تم التقاطها باستخدام العديد من حزم البرامج التجارية. ومع ذلك، وضعنا خوارزمية لأتمتة بسرعة لتحديدتحليل د المحلية من الكالسيوم 2+ الإشارات. وصف مفصل للمرشحات المكانية والزمنية المستخدمة في هذه الخوارزمية، جيل من ΔF / F 0 وتحديد / تحليل الروتينية يمكن العثور عليها في 11. وقد تم تطوير هذه الخوارزمية لتشغيل على المصدر المفتوح منصة برمجيات بيثون، ويمكن الحصول عليها، جنبا إلى جنب مع البيانات التجريبية عينة وإرشادات تفصيلية المستخدم، من قبل المؤلف المقابل بالبريد الإلكتروني (ismith@uci.edu).

  1. تحويل الملفات المراد استيرادها إلى خوارزمية مكتوبة مخصصة لتنسيق الملف ومتعددة طائرة .tiff.
  2. حدد موقع المجلد الذي يحتوي على خوارزمية تحليل وانقر نقرا مزدوجا فوق run.exe.
  3. حدد الملف .tiff لتحليلها.
  4. اختيار المعلمات التحليل في مربع الحوار المفتوح. انظر الشكل 2A للالمعلمات الافتراضية للبيانات العينة.
  5. تحديد مستوى الأسود على أن يعوض من الصورة كومة إما عن طريق تحريك المؤشر إلى جزء من مجال الرؤية التي لا نبعد التمديد تحتوي على الخلية (انظر الشكل 2B) أو عن طريق الدخول على مستوى الأسود باستخدام 'تعيين مستوى الأسود' موجه يدويا.
  6. مراقبة أربع نوافذ على الشاشة التالية تحليل من قبل البرنامج (الشكل 2C-F). C هي صورة أحادية اللون من يستريح مضان من الخلايا التي يجري تحليلها. المربعات البيضاء فرضه على هذه الصورة هي مواقع الحدث، كما تحدد المواقف الوسطى من وظائف جاوس ثنائية الأبعاد تركيبها على الأحداث.
  7. انقر على كل موقع الحدث أو اضغط على مفاتيح المؤشر لدورة بين الأحداث. على القيام بذلك للطرح الخلفية، ممهدة التمويه التغييرات نسبة مضان (ΔF / F 0) في كل من هذه المواقع التحديث في نافذة D.
    ملاحظة: أبرز الأحداث الأحمر مصممة على أن تنشأ من موقع معين وليس من "ينزف من خلال" من النشاط المترجمة إلى المواقع المجاورة. يشير التتبع الأزرق السفلي حيث إشارة مضان في الموقع المختار تجاوزت الكشفالعتبة، في حين يحدد خط أسود الأحداث القادمة من هذا الموقع بالذات (الموافق الحمراء أبرز الأحداث).
  8. انقر على اللون الأحمر أبرز حدث لتحديث نافذة E الذي يعرض التطور الزمني لهذا الحدث، ونافذة F الذي يعرض الملف الشخصي المكاني للحدث على مدى متوسط ​​الحال وقتها، جنبا إلى جنب مع الشخصية المكاني وظيفة جاوس المجهزة.
  9. مراجعة الأحداث التي تم تحديدها بحيث يمكن رفض القطع الأثرية من تحليل يدويا. حذف مثل هذه الأحداث من خلال النقر الحق الحمراء أبرز الأحداث.
    ملاحظة: في أيدينا، كاليفورنيا 2+ تدفق من خلال قنوات IP 3 R واحدة تثير إشارات مع ΔF / F 0 حول 0.11، لذلك من المحتمل أن تكون ايجابيات كاذبة أي "الاحداث" الكشف عن أصغر بشكل ملحوظ من هذا.
  10. تصدير البيانات عن طريق اختيار 'حفظ إلى Excel "أو تصدير البيانات على أساس لكل خلية عن طريق رسم حول الخلية من الاهتمام واختيار" حفظ CellR17 ؛.
    يتم حفظ البيانات إلى نفس المجلد مثل صورة كومة الأصلي: ملاحظة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الشكل 1A يظهر صورة WF من الراحة كال-520 مضان في الخلايا العصبية SH-SY5Y الإنسان أيضا محملة CI-IP 3. تعرض هذه الخلايا إلى ومضة 100 مللي ثانية الأشعة فوق البنفسجية إلى الصورة الإفراج ط-IP 3 أثارت عابرة الكالسيوم 2+ نفث في مواقع منفصلة (لاحظ الدوائر البيضاء في الشكل 1A). وأظهرت آثار مضان تقاس في هذه المواقع مرحلة ارتفاع السريعة بسبب الفتحات عابرة للIP 3 روبية، تليها طور السقوط أبطأ بكثير (1B الشكل و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن هنا وصف البروتوكولات لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث في خلايا الثدييات مثقف باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ المؤشرات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية مع واجهة مستخدم بديهية بأتمتة تحديد وتحليل البيانات التي حصل عليها. الإجراء الموضح هنا الاستفادة من الفلورسنت الكالسيوم 2+ مؤشر كال-520، ولكن العديد من الكالسيوم 2+ الأصباغ الأخرى الحساسة مثل فلوو-3، فلوو-4، فلوو-8 وأوريغون الخضراء BAPTA-1 أداء جيدا بما فيه الكفاية لصورة الكالسيوم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة 100201 GM إلى IFS ، و GM 048071 و GM 065830 إلى IP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

خلايا
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5YATCCCRL-2266
Cal-520 / AMAAT Bioquest Inc.21130
ci-IP3 < / sub> (D-23-O< em>-Isopropylidene-6-O< / em>-(2-nitro-4،5-dimethoxy)benzyl-myo-inositol 1،4،5-trisphosphate-Hexakis (بروبيونوكسي ميثيل) EsterSiChemcag-iso-2-145-10
DMSO / 20٪ الجنبي F127InvitrogenP-3000MP
EGTA / AMInvitrogenE-1219
أطباق تصوير ذات قاع زجاجي مقاس 35 ممMatTekP35G-1.5-14-C

المراجع

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  2. Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549(2011).
  3. Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564(2011).
  4. Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
  5. Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
  6. Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
  7. Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
  8. Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
  9. Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
  10. Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
  11. Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
  12. Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
  13. Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

إشارات الكالسيوم المحليةتصوير الكالسيومالكالسيوم بوساطة IP3كاميرا EMCCDمجهر TIRFالفلورة واسعة المجالمؤشرات الكالسيومدقة أقل من بكسلخوارزمية تحليل مؤتمتةالكشف عن نفثات الكالسيوم
التصوير المحلية الكالسيوم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.