يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم المنقولة جنون الأنواع دماغي الحواجز مع

7.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52522

⸱

مارس 10, 2015

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

في هذه المقالة

ملخص

يعد قياس الحاجز أمام انتقال أمراض البريون بين الأنواع أمرا صعبا وعادة ما ينطوي على تحديات حيوانية أو فحوصات كيميائية حيوية. هنا ، نقدم اختبار تحويل بروتين البريون في المختبر مع القدرة على التنبؤ بحواجز الأنواع.

الملخص

الدراسات لفهم انتقال الاعتلال الدماغي الإسفنجي المعدي بين الأنواع (TSEs ، أمراض البريون) تمثل تحديا من حيث أنها تعتمد عادة على دراسات تحدي حيوانية مطولة ومكلفة في الجسم الحي. تم تطوير عدد من المقايسات في المختبر للمساعدة في قياس حواجز أنواع البريون ، وبالتالي تقليل استخدام وتوفير نتائج أسرع من المقايسات الحيوية الحيوانية. هنا ، نقدم بروتوكول مقايسة تحويل البريون السريع في المختبر تسمى مقايسة نسبة كفاءة التحويل (CER). في هذا الفحص ، يتم تغيير طبيعة بروتين البريون الخلوي (PrPC) من دماغ مضيف غير مصاب عند كل من الرقم الهيدروجيني 7.4 و 3.5 لإنتاج ركيزتين. عندما يتم تحضين ركيزة الأس الهيدروجيني 7.4 بعامل TSE ، يتم تعديل كمية PrPC التي تتحول إلى حالة مقاومة للبروتيناز K (PK) بواسطة حاجز الأنواع للمضيف الأصلي لعامل TSE. في المقابل ، يتم طي PrPC في ركيزة الأس الهيدروجيني 3.5 بشكل خاطئ بواسطة أي عامل TSE. من خلال مقارنة كمية بروتين البريون المقاوم ل PK في الركيزتين ، يمكن إجراء تقييم لحاجز الأنواع المضيف. نوضح أن مقايسة CER تتنبأ بشكل صحيح بحواجز أنواع البريون المعروفة لفئران المختبر ، وكمثال ، تظهر بعض النتائج الأولية التي تشير إلى أن القطط الصغيرة (Lynx rufus) قد تكون عرضة للإصابة بالغزلان ذات الذيل الأبيض (Odocoileus virginianus) عامل مرض الهزال المزمن.

المقدمة

الاعتلال الإسفنجي للانتقال (TSEs، وأمراض بريون) هي مجموعة من الأمراض العصبية القاتلة مع فترات الحضانة الطويلة التي تؤثر على مجموعة متنوعة من الحيوانات والبشر. وتتألف العامل المسبب للمرض من المفترض TSEs من أيزومر تتجمع من بروتين بريون المضيف (بي ار بي) التي هي قادرة على التكاثر الذاتي التي يحركها قالب تحويل شكل الخلوي الطبيعي للبي ار بي (بي ار بي C) إلى معدية، ويرتبط مرض شكل (بي ار بي TSE) التي تتراكم في أنسجة الجهاز العصبي المركزي للمضيف المصاب 1. البريونات المعدية نقل الثدييات عموما من المضيف إلى المضيف بطريقة أنواع محددة، والتي أدت إلى مفهوم "الحواجز القائمة بين الأنواع بورصة طوكيو" الحد من انتقال الأحداث بين الأنواع 2. ليست مفهومة جيدا المحددات البيولوجية للالحواجز القائمة بين الأنواع بريون. الأحماض الأمينية تشابه تسلسل بين المعدية بي ار بي بورصة طوكيو والمضيف بي ار بي C جوتؤثر بقوة سواء التحويل يأخذ مكان 3-5، ولكن لا يزال غير كاف لتفسير كل الأحداث انتقال بريون لوحظ في الجسم الحي 6،7.

وبالتالي، فقد اعتمد توصيف حواجز الأنواع بورصة طوكيو إلى حد كبير على دراسات التحدي الحيوان: تعريض الحيوانات ساذجة من نوع معين لالبريونات من آخر وقياس الناتجة فترة حضانة ظهور المرض ومعدل الهجوم كمؤشرات للكفاءة الإرسال. وتستخدم أيضا الفئران معربا عن بي ار بي C من الأنواع مغاير لهذا النوع من الدراسة 8. التكاليف المرتبطة بإنتاج المعدلة وراثيا الماوس واختبارات بيولوجية بريون التي طال أمدها، فضلا عن الاعتبارات الأخلاقية للاستخدام الحيواني، هي العقبات التي تحول دون تحقيق التجريبي الحواجز الأنواع بورصة طوكيو. تقييم الحواجز القائمة بين الأنواع البشرية لTSEs يعتمد على الفئران المهندسة للتعبير عن الإنسان بي ار بي C. هذه الفئران تتطلب فترات حضانة طويلة الرضوخ لTSEs الإنسان أو تعديلات على رانه البشري جزيء بي ار بي C لبدء المرض السريع 9. فترات حضانة TSEs غير البشرية في هذه الفئران قد تمتد إلى ما بعد عمر الفأر العادي مما يجعل تفسير النتائج السلبية الصعبة. كما استخدمت الرئيسيات غير البشرية كوكلاء لدراسة حواجز الجنس البشري، ولكن هذه الدراسات لا محفوف نفس التحديات التي تواجهها أنواع أخرى من التجارب على الحيوانات والرئيسيات غير البشرية قد لا ألخص بالضبط المرض لأنها تسير في الإنسان المضيف.

لا تزال اختبارات بيولوجية الحيوان "المعيار الذهبي" طريقة لقياس قابلية الأنواع إلى بورصة طوكيو، ولكن أجبرت العقبات والتكاليف والأخلاق من هذه الدراسات على الحيوانات الحية التحقيق في البدائل. وهناك عدد من فحوصات في المختبر، استنادا إلى تقييم تحويل المضيفة بي ار بي C إلى بروتين K (PK) دولة مقاوم لل(احتياط PRP) عند المصنف من قبل بي ار بي بورصة طوكيو، وقد وضعت واستخدامها لتحقيق TSE SPecies الحواجز 10-12. أمثلة لفحوصات في المختبر وتشمل فحوصات خالية من الخلايا التحويل، البروتين misfolding التضخيم دوري (PMCA)، ونسبة كفاءة التحويل (CER) فحص 10-14. في حين أن أيا من هذه المقايسات تأخذ في الاعتبار العوامل المحيطية المشتركة في حواجز الأنواع بعد العدوى الطبيعية، وكلها يمكن أن تكون مفيدة لتحديد المضيفين يحتمل أن تكون عرضة للTSEs.

هنا نقدم بروتوكول للمقايسة CER، التي تستخدم اثنين من التشويه والتحريف ركائز بي ار بي C المستمدة من الخليط المخ المعتادة في مقاعد البدلاء الأعلى ردود الفعل تحويل بريون (الشكل 1) 13. بي ار بي C في الركيزة التشويه والتحريف في درجة الحموضة 7.4 لا يمكن تحويلها إلى الدقة PRP التي كتبها بي ار بي TSE المصنفة في رد الفعل في حالة عدم وجود الحواجز القائمة بين الأنواع 14. في المقابل، تمسخ من بي ار بي C في الركيزة الأخرى في درجة الحموضة 3.5 يسمح ليتم تحويلها إلى بي ار بي الدقة حضانة التاليةمع بي ار بي TSE من أي نوع من الأنواع وبمثابة الرقابة على التحويل. فإن نسبة التحويل من بي ار بي C إلى الدقة PRP في درجة الحموضة 7.4 الركيزة نسبة إلى أن الركيزة درجة الحموضة 3.5 يوفر قدرا من الحواجز القائمة بين الأنواع. لقد وجدنا أن الفحص CER يتنبأ يعرف الحواجز الأنواع من الفئران المخبرية لمختلف TSEs واستخدمت مقايسة في الجهود الرامية إلى التنبؤ الحواجز القائمة بين الأنواع العديد من أنواع الثدييات، بما في ذلك كبش الجبال الصخرية، إلى مرض الهزال المزمن (CWD) وغيرها من TSEs 14، 15. المحققون ترغب في أداة السماح الفحص السريع للحواجز الأنواع TSE أو تقييم تحويل بي ار بي C -to-بي ار بي احتياط سوف تجد هذه المنهجية مفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ العمل الحيوانات التي أجريت في المركز القومي للحياة البرية الصحة وفقا للمكتب NIH من المبادئ التوجيهية مختبر رعاية الحيوان وتحت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام بروتوكول # EP080716. وكانت الأنسجة من الحيوانات تحصد صياد الهدايا من ولاية ويسكونسن أو ميشيغان أقسام الموارد الطبيعية.

1. إعداد الحل

ملاحظة: الحلول المذكورة أدناه مطلوبة لإعداد الركيزة CER الفحص في القسم 2 أدناه. إعداد كل من هذه الحلول من ارتفاع حلول الأسهم تركيز. وستعطى تركيزات المستحسنة للحلول الأسهم في أقواس بعد كل اسم الكيميائية المدرجة ذات الصلة. إعداد جميع حلول جديدة على إعداد الركيزة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.

  1. للتحلل العازلة، وإعداد إيجاد حل لليلي في 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5 (1 M تريس، ودرجة الحموضة 7.5 حل الأسهم مستحسن): 100 ملم الصورةكلوريد الكراهية (كلوريد الصوديوم، 1 M حل الأوراق المالية)، و 10 ملم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA، 500 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0 حل الأسهم)، و 0.5٪ NP-40 (10٪ محلول المخزون)، و 0.5٪ deoxycholate (DOC، 10٪ محلول المخزون ).
  2. لعازلة التحويل، وإعداد محلول كبريتات الصوديوم 0.05٪ دوديسيل (SDS، 10٪ محلول المخزون) و 0.5٪ تريتون X-100 (10٪ محلول المخزون) في 1 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 10، ودرجة الحموضة 7.4 حل الأسهم).
  3. عن حلول chaotropic، وإعداد اثنين 3 M حلول غوانيدين هيدروكلوريد (GdnHCl، 8 M الأسهم) في برنامج تلفزيوني 1X (حل 10X الأسهم). ضبط درجة الحموضة واحد من الحلول إلى 3.5 ± 0.05 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز (حمض الهيدروكلوريك). تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الثاني يبقى في درجة الحموضة 7.4 ± 0.05 وضبط باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز أو هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) إذا لزم الأمر.

2. إعداد أزواج CER الفحص الركيزة

  1. الحصول صحية أنسجة المخ، غير TSE-المصابة من الأنواع ذات الأهمية وإعداد 10٪ حجم الوزن لكل(ث / ت) جناسة في تحلل العازلة باستخدام أي من الطرق التالية: dounce، وحبة طاحونة، أو التجانس الهاون ومدقة. زيادة تحسين الناتجة الخليط بواسطة تعريضهم للتجانس حقنة وإبرة، وذلك باستخدام الإبر زيادة مقياس حتى يمكن يستنشق الركيزة وطرد بكل سهولة من خلال 27 G حقنة إبرة.
    1. لركائز أعدت من القوارض والثدييات الصغيرة الأخرى، التجانس الدماغ كله (ق)؛ لركائز أعدت من الثدييات الكبيرة، واستخدام OBEX (الدماغ) الأنسجة لتحضير الخليط. عند اختيار كمية جناسة الدماغ، وإعداد ما لا يزيد عن 50٪ من قدرة أجهزة الطرد المركزي المستخدمة لبروتين هطول الأمطار في الخطوة 2.6.
    2. إذا كانت نوعية أنسجة المخ المكتسبة أمر مشكوك فيه، وتقييم مستويات بي ار بي C بواسطة SDS-PAGE 16 و 17 طخة مناعية قبل الركيزة التحضير.
  2. تقسيم جناسة الدماغ إلى قسمين أحجام متساوية في أنابيب بلاستيكية المخروطية وصفت منفصلة. إضافة GdnHCl (3 M الحلول في 1 PBS) في أي درجة الحموضة 3.5 أو 7.4 إلى كل أنبوب في نسبة 1: حجم 1 إلى جناسة الدماغ.
  3. تحقق من قيم الرقم الهيدروجيني للحلول اثنين. ضبط درجة الحموضة من الحموضة 3.5 الركيزة لدرجة الحموضة ± 0.05 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز. ضمان درجة حموضة الركيزة الأخرى تبقى في درجة الحموضة 7.4 ± 0.05 وضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو حسب الحاجة. تجنب المبالغة قيم درجة الحموضة بإضافة حكيمة من حمض أو قاعدة.
  4. تدوير الحلول على نهاية الإفراط في نهاية خلاط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 ساعة.
  5. يعجل البروتين من خلال إضافة أربعة مجلدات من الميثانول إلى حلول الركيزة في كل أنبوب مخروطي الشكل، دوامة لخلط جيدا، واحتضان عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
  6. عينات الرواسب بواسطة الطرد المركزي عند 13،000 × ز لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. صب بعناية وتجاهل supernatants والسماح الميثانول لتتبخر من الكريات. استخدام أدوات تطبيقها القطن ذات الرؤوس للمساعدة في امتصاص الميثانول تشبث إلى داخل الأنبوب. لا تسمح الكريات إلى الإفراط في الدكتورذ ومرة ​​واحدة الميثانول لم تعد مرئية، انتقل إلى الخطوة التالية.
  7. الكريات البروتين resuspend في عازلة التحويل. استخدام كمية من تحويل عازلة يساوي المبلغ من جناسة الدماغ المواد انطلاق الاستغناء في كل أنبوب في الخطوة 2.2.
    ملاحظة: ومن الأهمية بمكان أن المخزن المؤقت التحويل المستخدمة ل resuspend الكريات البروتين من كلا الأس الهيدروجيني 3.5 والاستعدادات الركيزة المعاملة 7.4 هو الحل المعرفة في الخطوة 1.2 أعلاه (والذي يحتوي على مستويات منخفضة من المنظفات ودرجة الحموضة الفسيولوجية).
  8. حلول يصوتن لفترة وجيزة الركيزة في sonicator cuphorn (10 ثانية في ~ 30٪ الطاقة القصوى)، قسامة إلى 0،5-1،0 مل مجلدات في المسمى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إجراء طخة مناعية لمراقبة الجودة (الخطوة 2.9) على قسامة من كل الركيزة. تخزين مأخوذة أخرى في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لإجراء فحص CER (القسم 4).
  9. أداء مراقبة الجودة على أزواج CER الركيزة قبل استخدامها (الشكل 2). هذه الخطوات تضمن ركائز CER سوف يقوم بتقديمالبريد أفضل النتائج في الدراسات التحويل.
    1. ضمان كميات مماثلة من بي ار بي C في ركائز اثنين. مقارنة مستويات بي ار بي في 10-25 ميكرولتر من كل الركيزة التي كتبها SDS-PAGE 16 و 17 immunoblotting. إذا كانت مستويات البروتين في الرقم الهيدروجيني 7.4 و 3.5 ركائز هي داخل ~ 10٪ من بعضها البعض، وأزواج الركيزة مناسبة للاستخدام في الدراسات CER.
      ملاحظة: يجب على immunoblots PRP لا تظهر أدلة على نطاق واسع تدهور بي ار بي C. يجب أن يكون مناعية بي ار بي أساسا> 20 كيلو دالتون. فرق أقل من هذه الكتلة الجزيئية يمكن أن تكون المنتجات التدهور. وينبغي أن تكون أنماط النطاقات يعادل تقريبا بين أزواج الركيزة.
    2. وبما أن بي ار بي C في كل من ركائز يجب أن تكون PK حساسة، علاج 10-25 ميكرولتر من كل الركيزة مع PK في تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل وهضم العينات عند 1،000 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الحرارية شاكر. تقييم أي إشارة PRP المتبقية SDS-PAGE 16 و 17 immunoblotting.ركائز مع الدقة PRP ليست مناسبة للاستخدام في الدراسات CER.

3. إعداد بذور TSE الوكيل

  1. الحصول TSE المصابة أنسجة المخ من الأنواع ذات الأهمية وإعداد 10٪ (ث / ت) جناسة في برنامج تلفزيوني 1X درجة الحموضة 7.4 باستخدام الأساليب المذكورة في الخطوة 2.1 أعلاه.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن تنتج بذور من الأنسجة الأخرى TSE المصابة خارج الجهاز العصبي المركزي، ومع ذلك، كفاءة التحويل من الدماغ المستمدة ركائز عن طريق البذور المستمدة من الأنسجة الطرفية TSE المصابة لم يتم بعد تقييم التجربة في الأدبيات المنشورة.
  2. قسامة الناتجة جناسة (ق) في 100-300 حجم ميكرولتر في 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لأداء الفحص CER.

4. CER الفحص

ملاحظة: فحص CER ينطوي إضافة كمية صغيرة نسبيا من بي ار بي بورصة طوكيو (المنصوص عليها في "البذور") من نوع واحدإلى وجود فائض النسبي للبي ار بي C (المنصوص عليها في الدماغ غير مصاب "الركيزة") من الأنواع الأخرى التي تم التشويه والتحريف جزئيا في أي درجة الحموضة 3.5 أو 7.4. وبعد فترة حضانة تمتد الهز، ويتم تقييم يحركها قالب تحويل بي ار بي C التي كتبها بي ار بي بورصة طوكيو في كل رد فعل من جانب إشارة الكثافات من بي ار بي الدقة المتبقية بعد PK الهضم وكشف طخة مناعية. مقارنة مستويات الدقة PRP في ركائز التشويه والتحريف سابقا في درجة الحموضة 3.5 مقابل 7.4 يوفر قدرا من الحواجز القائمة بين الأنواع. وتقدم لمحة عامة التجريبية من هذا الإجراء فحص في الشكل 1.

  1. ذوبان الجليد ببطء غير المصابة أزواج CER الركيزة (الفحص يتطلب كميات متساوية من ركائز التشويه والتحريف سابقا في كل من درجة الحموضة 3.5 و 7.4) وحلول البذور TSE-المصابة عن طريق وضعها على رأس سرير من الجليد (حوالي 1 ساعة الوقت ذوبان الجليد).
  2. إذابة مرة واحدة بشكل كامل، نضح ثم طرد كل حل الركيزة من خلال27 G حقنة إبرة عدة مرات لإعادة التجانس عليه. يصوتن لفترة وجيزة كل حل البذور TSE المصابة لمدة 10 ثانية في ~ 30٪ الطاقة القصوى. إبقاء جميع الحلول على الجليد في حين تستعد ردود الفعل التحويل.
  3. التسمية 5 الفردية منخفضة ملزمة، وأنابيب PCR رقيقة الجدران في كيل بورصة طوكيو التي يجري اختبارها.
  4. إعداد ردود الفعل التحويل في هذه الأنابيب عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 10٪ محلول البذور TSE-المصابين إلى 95 ميكرولتر من (أ) الركيزة CER أعدت في درجة الحموضة 7.4 و (ب) الركيزة CER أعدت في درجة الحموضة 3.5.
    1. لكل عينة تجريبية، وإعداد ردود فعل موازية في أزواج الركيزة CER التشويه والتحريف سابقا في كل من درجة الحموضة 3.5 و 7.4.
    2. تحسين نسب TSE البذور وكيل لغير المصابة الركيزة الدماغ من خلال تقرير التجريبية. البذور مشترك: نسب الركيزة المستخدمة الحفاظ على حجم رد الفعل الكلي 100 ميكرولتر وتشمل 1:99 ميكرولتر، 2:98 5:95 ميكرولتر وميكرولتر. بالنسبة لمعظم التطبيقات، و5:95 ميكرولتر البذور: نسبة حجم الركيزة المناسبة وما قدمت في عشرهو بروتوكول.
  5. إعداد ثلاث عينات السيطرة في كيل بورصة طوكيو التي يجري اختبارها على النحو التالي: (أ) إضافة 5 ميكرولتر من 10٪ محلول البذور TSE-المصابين إلى 95 ميكرولتر عازلة تحويل كعنصر تحكم لمدخلات الدقة الحزب الثورى. إضافة 5 ميكرولتر عازلة التحويل إلى 95 ميكرولتر الركيزة أعد في (ب) الرقم الهيدروجيني 3.5 و (ج) ودرجة الحموضة 7.4 كما ضوابط لغير محددة التحويل، غير قالب.
  6. لفترة وجيزة دوامة كل عينة في أنبوب للPCR مغلقة لخلط البذور والركيزة جيدا. اتبع مع نبض لحظة في السرعة المنخفضة مقاعد البدلاء أعلى مصغرة الطرد المركزي لإزالة أي كمية من خليط التفاعل المحاصرين في أنبوب غطاء PCR.
  7. عينات الحمل في المسمى بشكل فردي أنابيب PCR إلى مقاعد البدلاء أعلى الحرارية شاكر مجهزة لقبول أنابيب PCR. يهز العينات عند 1،000 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  8. وبعد الهز، إضافة sarkosyl إلى تركيز النهائي من 2٪ (ث / ت) وPK إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل. عينات دايجست في 1،000 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الحرارية شاكر.
    NOTE: إضافة sarkosyl لعينات المساعدات بعد التحويل في PK هضم بي ار بي C. يتم استبعاد اشارات ايجابية كاذبة في عينات غير المصنف (الخطوة 4.5) تقريبا بإضافة sarkosyl.
  9. إضافة SDS-PAGE عينة عازلة، وعينات الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وحل بي ار بي المتبقية الدقة في كل عينة بواسطة SDS-PAGE 16 تليها immunoblotting 17.
    ملاحظة: بعد إضافة عينة العازلة والتدفئة، وعينات قد تتم معالجة فورا أو يمكن تخزين العينات في -20 ° C أو -80 ° C قبل immunoblotting. تم إنشاء جميع البيانات المقدمة هنا باستخدام أنظمة جل ونقل NOVEX NuPAGE. وعولج عينات فردية من الفحص CER مع العازلة عينة والحد من وكيل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تسخين العينات لاحقا عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتم تحميل 30 ميكرولتر من كل عينة إلى 12٪ مكرر تريس المواد الهلامية الجاهزة.
  10. حساب نسبة كفاءة التحويل (CER) كإجراءمن الحواجز القائمة بين الأنواع. مستويات قدر من الدقة PRP بواسطة قياس كثافة 17 و تقسيم الكثافة الإجمالية للعينة الرقم الهيدروجيني 7.4 قبل أن من درجة الحموضة 3.5 العينة. ضرب من قبل 100 لإنتاج مئوية.
  11. تجميع البيانات من مكررات التجريبية مستقلة لتوليد وسيلة CER ± الانحراف المعياري لالأنواع مع وكيل TSE معين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الاستخدام الناجح للمقايسة CER يعتمد إلى حد كبير على نوعية من أزواج الركيزة المستخدمة في تفاعلات التحويل. لهذا السبب، والإجراءات لإعداد أزواج الركيزة CER التالية، ينبغي إجراء طخة مناعية لمراقبة الجودة (الشكل 2). لكل من ركائز، فحص 10-25 ميكرولتر من immunoblotting. بي ار بي C يجب أن يكون كشفها بسهولة في كل الركيزة ويجب أن تكون مستويات بي ار بي C تقريبا نفس بين البلدين. سوف مناعية تكون مرئية بشكل رئيسي فوق 20 كيلو دالتون، ولكن قد تكون عصابات أصغر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لالانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول، ينبغي إيلاء الاهتمام لمستويات بي ار بي C في غير المصابة أنسجة المخ تستخدم لإعداد الركيزة (الخطوة 2.1.2) والبذور إلى الركيزة نسبة للتفاعلات التحويل (الخطوة 4.4.2). في تجربتنا، والعقول يمكن استخراجها لاستخدامها بوصفها الركيزة CER بعد فترة كبيرة بعد الوفاة، ما دام بي ار بي C موجود من قبل immunoblotting (الشكل 4). في الواقع، وقد لوحظ بعض انحلال ذاتي في أدمغة بوبكاتس المستخدمة للدراسات CER. ومع ذلك، حضانة ركائز ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر جون أولسن (إدارة الموارد الطبيعية في ولاية ويسكونسن) وتوم كولي ودانيال أوبراين وستيف شميت (إدارة الموارد الطبيعية في ميشيغان) والدكتور دانيال والش (المركز الوطني لصحة الحياة البرية في هيئة المسح الجيولوجي الأمريكية) للمساعدة في الحصول على الأنسجة. نشكر أيضا مختبر ولاية ويسكونسن للصحة على خدمات الاختبارات التشخيصية ، والدكتورة توني روك وموظفيها (المركز الوطني لصحة الحياة البرية في هيئة المسح الجيولوجي الأمريكية) لاستخدام المعدات. أي استخدام للأسماء التجارية أو المنتجات أو الشركات هو لأغراض وصفية فقط ولا يعني تأييد حكومة الولايات المتحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12٪ Bis-Tris SDS-PAGE المواد الهلاميةLife TechnologiesNP0342
0.5 مم حبات أكسيد الزركونيومNext AdvanceZROB05أنواع أخرى من الخرز هي أيضا أجسام مضادة فعالة
من الموردينالمختلفين حدد الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة للكشف عن اللطخة المناعية ل PrP res< / sup> من الأنواع ذات الأهمية
الخرزالخالطالتالى AdvanceBBY24M
أجهزة الطرد المركزيBeckman Coulter369434عالية السرعة مع التحكم في درجة الحرارة
أنابيب مخروطيةأي علامة تجارية
قضيب قطني ذو رأسUlineS-18991
Cuphorn Sonicatorأنظمة الحرارة - الموجات فوق الصوتيةW-380Heat Systems-Ultrasonics، Inc. هي الآن Qsonica، LLC
قياس الكثافة برنامج البرمجياتUVPVision Works LS Image Acquisition and Analysis Softwareستعمل أيضا برامج أخرى ، مثل NIH ImageJ ،
الخالط DounceKimble Chase885300
خلاط نهاية إلى طرفLabnet InternationalH5600
Ethylenediaminetetra حمض الأسيتيكBoston BioproductsP-770مادة كيميائية خطرة: تهيج العين
غوانيدين هيدروكلوريد ، 8 مثيرمو فيشر Scientific24115مادة كيميائية خطرة: سمية حادة ، تهيج الجلد ، تهيج العين
كتلة تسخينفيشر ساينتفيك11-718
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش435570مادة كيميائية خطرة: حمض قوي
عازلة عينة كبريتات الليثيوم دوديسيل ، 4xLife TechnologiesNP0008المواد الكيميائية الخطرة: الجلد & تهيج الجهاز التنفسي ، تلف خطير في العين ، مادة صلبة قابلة للاشتعال
ميثانولفيشر ScientificA454-4مادة كيميائية خطرة: سمية حادة ، أنابيب أجهزة طرد مركزي سائلة قابلة للاشتعال
أيعلامة تجارية
أجهزة طردLabnet InternationalC1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)Sigma-Aldrich   ؛L-5125مادة كيميائية خطرة: سمية حادة ، تهيج الجلد ، تلف العين
Nonidet P-40AmrescoM158مادة كيميائية خطرة: تهيج الجلد ، تلف العين
نظام جل SDS-PAGEنظامالرحلان الكهربائي Life Technologies NuPAGEستعمل أيضا
PCR (منخفضة الارتباط)AxygenPCR-02-L-C
الخالطالمدقةفيشر ساينتفيك03-392-106
مقياس الأس الهيدروجينيSentronSI600
غشاء بولي فينيل ديفلوريدميليبورIPVH00010
Proteinase KPromegaV3021مادة كيميائية خطرة: تهيج الجلد والعين ، حساسية الجهاز التنفسي ، سمية الأعضاء
عامل تقليل عينات SDS-PAGE ، 10xLife TechnologiesNP0009
كلوريد الصوديومفيشر Scientific7647-14-5
ديوكسي كولات الصوديومسيجما-ألدريتش  D6750المواد الكيميائية الخطرة: السمية الحادة
كبريتات دوديسيل الصوديومثيرمو فيشر العلمي28364المواد الكيميائية الخطرة: السمية الحادة ، تهيج الجلد ، تلف العين ، هيدروكسيد الصوديوم الصلب القابل للاشتعال
سيجما ألدريتشS5881مادة كيميائية خطرة ؛ حقنة قاعدة
قوية BD Biosciencesمختلفاستخدام حجم المحقنة المناسب لأحجام الركيزة المراد تجانسها
إبر الحقنةBD Biosciencesالمختلفة
Thermoshaker (شاكر أنبوب PCR)هانغتشو جميع أدوات شنغMS-100
تريس قاعدةBio Basic77-86-1مادة كيميائية خطرة: الجلد والعين وتهيج الجهاز التنفسي
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30مادة كيميائية خطرة: سمية حادة ، تهيج العين
دوامةفيشر العلمية12-812
مركزي صغيرة أنابيب

المراجع

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722(2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32(2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157(2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753(2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623(2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SDS Page PrP C
تقييم المنقولة جنون الأنواع دماغي الحواجز مع
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.