يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

9.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52550

⸱

مارس 4, 2015

 ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, University of Ulm

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا يوفر أداة لفحص الآليات التنظيمية لجينات معينة أثناء تطور الحصين. يسمح استخدام التثقيب الكهربائي خارج الرحم وثقافة الشرائح العضوية بالتنظيم لأعلى ولأسفل للتعبير عن الجينات ذات الأهمية في الخلايا المفردة ومتابعة مصيرها أثناء التطور.

الملخص

يوفر علم الوراثة للفأر أداة قوية لتحديد دور جينات معينة أثناء التطور. يوفر تحليل الأنماط الظاهرية الناتجة عن طريق الطرق الكيميائية المناعية والجزيئية معلومات عن الجينات المستهدفة المحتملة ومسارات الإشارات. يتطلب توضيح آليات تنظيمية محددة نظاما يسمح بالتلاعب بعدد صغير فقط من خلايا نسيج معين إما عن طريق الإفراط في التعبير أو الاستئصال أو إعادة إدخال جينات معينة ومتابعة مصيرها أثناء التطور. لتحقيق هذا التثقيب الكهربائي خارج الرحم لهياكل الحصين ، وخاصة التلفيف المسنن ، متبوعا بثقافة الشرائح العضوية يوفر مثل هذه الأداة. يسمح استخدام هذا النظام لإنشاء عمليات حذف الفسيفساء بتحديد ما إذا كان الجين المعني ينظم العمليات التنموية المستقلة للخلية مثل تكاثر الخلايا السلفية أو التمايز العصبي. علاوة على ذلك ، فإنه يسهل إنقاذ الأنماط الظاهرية عن طريق إعادة إدخال الجين المحذوف أو جيناته المستهدفة. على عكس التثقيب الكهربائي للرحم ، فإن نهج خارج الرحم يحسن معدل استهداف الطبقات العميقة من الدماغ بنجاح مثل التلفيف المسنن. يوفر التثقيب الكهربائي الكلي خارج الرحم وثراثة الشرائح العضوية أداة قوية لدراسة الآليات التنظيمية في بيئة شبه أصلية تعكس الظروف الذاتية.

المقدمة

الحصين يلعب دورا هاما في الذاكرة والتعلم وكذلك السلوك العاطفي. وتتكون واحدة تتمثل المهمة الرئيسية للتوحيد الذاكرة القصيرة الأمد إلى ذاكرة طويلة الأمد، الأمر الذي يتطلب مرونة عالية في الجهاز العصبي. التلفيف المسنن من الحصين بمثابة بوابة رئيسية لإدخال المعلومات وهي أيضا واحدة من مناطق الدماغ مع اثنين من تكوين الخلايا العصبية المستمر طوال فترة البلوغ 1،2. تطوير البنية الحصين يحدث خلال أواخر مرحلة التطور الجنيني وخاصة خلال أول 3 إلى 4 أسابيع بعد الولادة 3. خلال التنمية في وقت مبكر من التلفيف المسنن يتم تأسيس تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لبعد الولادة وكذلك تكوين الخلايا العصبية الكبار 4. الخلايا العصبية تطوير تمر عبر مراحل مختلفة، من الخلايا الجذعية من خلال عدة مراحل من الخلايا الاصلية لغير ناضجة، وأخيرا الخلايا العصبية الناضجة خلال بعد الولادة، فضلا عن تكوين الخلايا العصبية الكبار. في مراحل مختلفة من الخلايا العصبية التعبير عنمطلوب جينات معينة للسماح للنضوج والتكامل من الخلايا العصبية الجديدة في قرن آمون الدوائر 5،6.

باستخدام الماوس علم الوراثة وتحليل النمط الظاهري من قبل المناعية وكذلك الأساليب الجزيئية يسمح تحديد نمط التعبير وظيفة العديد من هذه الجينات. وبالإضافة إلى ذلك تحليل ميكروأري وكذلك مناعي لونين (رقاقة) قدمت معلومات عن الجينات المحتملة المباشرة وغير المباشرة المستهدفة 7،8. ومع ذلك، لا يزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة بشأن الآليات التنظيمية للتنمية قرن آمون، وخاصة تطوير التلفيف المسنن. للحصول على مزيد من التبصر كيف يتم تنظيم الجينات المحددة نظاما مطلوب والسماح للتلاعب من عدد صغير من الخلايا أسفل-أو ما يصل التنظيم من الجين من الفائدة و / أو الجينات المستهدفة ومتابعة مصيرهم خلال التنمية. في الرحم Electroporation لل من shRNAs، كدنا] من الجينات في المصالح أو لجنة المساواة العرقية recombinaتوفر حد ذاتها مثل هذه الأداة. لضمان وجود الحمض النووي المطلوب أو الرنا صغيرة البلازميدات التعبير ينبغي أن تستخدم ل electroporation. ويتم تنفيذ هذا النهج بنجاح كبير في دراسة تطوير القشرية 9،10، ولكن هو نهج أكثر تحديا دراسة تطوير التلفيف المسنن بسبب الموقف من الهياكل قرن آمون في الدماغ طبقات أعمق.

السابقين الرحم بعد Electroporation للثقافة شريحة عضوي النمط هو نهج واحد للتحايل على هذه المشكلة 11،12. وعلى النقيض من في الرحم Electroporation لللا الجنين كله ولكن فقط الرأس ويستخدم يسمح بالتالي لوضع الأقطاب الكهربائية بطريقة أكثر ملاءمة لتوجيه shRNA / DNA نحو الحصين والتلفيف المسنن. مجموعتنا يعمل بنجاح السابق الرحم Electroporation لللدراسة دور عامل النسخ Bcl11b خلال تطوير التلفيف المسنن 8. Bcl11b لها دور مزدوج في التنمية التلفيف المسنن التي كتبها regulating السلف تكاثر الخلايا وكذلك التمايز كما يتضح من المناعية. لزيادة تحديد آلية لمشاركة Bcl11b في هذه العمليات، تم تعديل بروتوكولات للمجموعة Polleux 11،12 لدراسة التلفيف المسنن كما هو موضح أدناه في قسم البروتوكول. في النهج الأول تم تناول مسألة ما إذا كان Bcl11b وتنظيم الخلايا العصبية خلية تمايز الخلايا بشكل مستقل. فحص والنهج الثاني سواء Desmoplakin، جين هدفا مباشرا للBcl11b، كافية لانقاذ النمط الظاهري Bcl11b.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للقانون الألماني وتمت الموافقة من قبل المكاتب الحكومية في توبنغن: ملاحظة.

1. إعداد بال micropipettes، حلول والأغشية

  1. إعداد بال micropipettes
    1. سحب بال micropipettes الزجاج باستخدام مجتذب ممص مكروى مع البرنامج التالي: الحرارة: 540، سحب: 125، السرعة: 20 والتأخير: 140. المبالغ طول الإبرة إلى 5.5 سم.
    2. الإبر شطبة باستخدام microgrinder للحصول على حجم غيض مناسب من 4 مم. تخزين الإبر في مربع أو 15 سم طبق بتري لمنع ضررا من النصائح.
  2. إعداد حلول
    1. البلازميد DNA الحل
      1. إعداد DNA البلازميد التي تحتوي على بناء كدنا] المطلوب باستخدام عدة المجانية-ماكسي الإعدادية الذيفان الداخلي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
      2. ضبط حل DNA البلازميد إلى تركيز النهائي من 3 ميكروغرام / ميكرولتر (بدون ناقلات GFP ارتفاع) أو 4 ميكروغرام /ميكرولتر (مع 1 ميكروغرام من GFP ارتفاع ناقلات) في الذيفان الداخلي سراح تريس، EDTA العازلة التي تحتوي على الأخضر السريع (تركيز النهائي 0.05٪).
    2. Laminin سهم الحل
      1. حل 1 ملغ من laminin في الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 1 مل. إعداد 100 مكل وتخزينها في -80 ° C.
    3. بولي-L-ليسين محلول المخزون
      1. حل 50 ملغ من بولي-L-يسين في 50 مل من الماء المعقم إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. إعداد 1 مل مأخوذة وتخزينها في -20 ° C.
    4. استكمال محلول الملح هانك المتوازن (كامل HBSS)
      1. إعداد كاملة HBSS من خلال الجمع بين 100 مل من 10X HBSS 2.5 مل من 1 M HEPES عازلة (7.4 درجة الحموضة)، 30 مل من 1 M D-الجلوكوز، 10 مل من 100 ملي CaCl 2، 10 مل من 100 ملي MgSO 4، و 4 مل من 1 M NaHCO 3. إضافة الماء المعقم تصل إلى 1 L وتخزينها في 4 ° C.
        ملاحظة: الأوتوكلاف جميع الحلول يتوقعون 1 M HEPES العازلة و 1 M D-الجلوكوز، والتي هي سن الفيلثالثا تعقيمها.
    5. الثقافة شريحة متوسطة
      1. إعداد شريحة مستنبت بإضافة 35 مل من بصل متوسطة النسر، 12.9 مل من HBSS كاملة (1.2.4)، 1.35 مل من 1 M D-الجلوكوز، 250 ميكرولتر من 200 ملي L-الجلوتامين، و 500 ميكرولتر من البنسلين، الستربتومايسين ل الحصول على الحجم النهائي من 50 مل. إضافة مصل الحصان إلى تركيز النهائي من 5٪ وتخزينها في 4 ° C.
    6. نقطة المنخفض الانصهار (LMP) الاغاروز
      1. إعداد 4٪ LMP الاغاروز حل عن طريق إضافة 2 غرام من LMP الاغاروز إلى 50 مل من HBSS كاملة (1.2.4)، يليه التدفئة في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة في عالية الطاقة. الحفاظ على هذا الحل في حمام مائي عند 37-39 درجة مئوية. تخزين الحل في 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها.
    7. امتصاص العرق الحل
      1. في غطاء الدخان إعداد محلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) وذلك بإضافة 4 غرام من بارافورمالدهيد إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الحرارة الحل إلى 60 درجة مئوية وإضافة بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم حتى يصبح الحل جلير.
    8. Permeabilization الحل
      1. حل 9 غرام من BSA في 300 مل من 1X PBS تحتوي على 0.3٪ Trition X-100 وتخزينها في 4 ° C. إضافة 10٪ أزيد الصوديوم للتخزين على المدى الطويل.
  3. طلاء من غشاء إدراجات
    1. تمييع قسامة واحدة من محلول المخزون laminin (1.2.2) وقسامة واحدة من بولي-L-يسين حل سهم (1.2.3) في الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 12 مل.
    2. ضع إدراج الغشاء إلى 6 لوحات جيدا مع بعضها يحتوي كذلك 2 مل من الماء المعقم. إضافة 1 مل من محلول طلاء على رأس الغشاء واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. بعد مرور فترة الحضانة غسل غشاء إدراج ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المعقم وجافة. استخدام إدراج غشاء المغلفة في نفس اليوم أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع في الجافة 6 لوحة جيدا.

2. حقن الحمض النووي و Electroporation من E15.5 وE18.5 الأجنة

  1. تخدير وقت تزاوج الماوس الإناث عن طريق وضعها الى غرفة التخدير مشبعة 5٪ الأيزوفلورين ومتصلا المرذاذ. تعميم الأيزوفلورين والأكسجين بمعدل 1 لتر / دقيقة. حفاظ على الحيوانات في مربع لمدة 2-4 دقائق أو حتى فاقدا للوعي الذي يتم اختباره من قبل معسر بين الكفوف من الفأرة.
  2. الموت ببطء الماوس فاقد الوعي من قبل خلع عنق الرحم في يوم الجنينية (E) 15.5 18.5 أو. تشريح الرحم التي تحتوي على أجنة 13 ووضعه في طبق بتري تحتوي على 15-20 مل من البرد الكامل HBSS.
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، والحفاظ على الأجنة والأنسجة على الجليد.
  3. استخدام زوج من مقص للفصل بين كل الجنين من قرن الرحم ومكان في طبق بيتري الثاني تحتوي على البارد الكامل HBSS.
  4. تحت المجهر تشريح، قطع الجدار عضلة الرحم والمشيمة باستخدام زوج من ملقط غرامة (رقم 55) ومقص. الإفراج بعناية الجنين من الكيس المحي.
  5. استخدام زوج من مقص بون إلى decapitatالبريد الأجنة فقط فوق الأمامية في زاوية 60 درجة. إذا كانت التجربة يتطلب التنميط الجيني للأجنة، وجمع عينة الأنسجة لعزل الحمض النووي الجيني (قطعة صغيرة من الذيل).
  6. نقل الرأس إلى طبق بتري نظيف وجاف. لأن رئيس قد مقطوعة الرأس في زاوية 60 درجة، ينبغي للإمالة الرأس إلى جانب واحد عند وضعها حتى الجانب الظهري.
  7. وضع إبرة بعناية في منتصف ختام نصف الكرة إلى bregma (الشكل 1A، B). حقن حوالي 2-3 ميكرولتر (في 3 أو 4 ميكروغرام / ميكرولتر) من محلول الحمض النووي من قبل داس على دواسة من picospritzer III باستخدام 30 رطلا من الضغط لمدة 10-15 ميللي ثانية لكل نبضة، وتطبيق 5-8 البقول. مدة وعدد من النبضات تعتمد على قطر افتتاح إبرة مع فتحات صغيرة تتطلب المزيد من الوقت. الفاصل الزمني بين كل نبضة يصل إلى 1 ثانية.
  8. قبل وضع الأقطاب، وتطبيق بضع قطرات من كامل HBSS على رأس EMBRيو. وضع أقطاب كهربائية في مثل هذه الطريقة أن 'السلبية' المحطة هو على الجانب نفس البطين حقن والقطب "إيجابي" على الجانب الآخر من البطين حقن أسفل الأذن رأس الجنين (الشكل 1C، D). تطبيق 5 نبضات من 50 V.
    1. استخدام 3 مم أقطاب لE 15.5 و 5 مم أقطاب لE 18.5.

3. تشريح الدماغ

  1. بعد Electroporation لل، تقشر الجلد من الرأس مع مساعدة من زوج من ملقط غرامة. باستخدام زوج من مقص الربيع إجراء شق صغير في منتصف المخيخ في خط الوسط من الجمجمة.
  2. إدراج مقص الربيع في شق وقطع طولي على طول الدرز السهمي. تقشر الجمجمة وفصل الدماغ من الجمجمة باستخدام ملقط غرامة. نقل الدماغ كله الى 15-20 البارد مل حل HBSS كاملة.
  3. وفي الوقت نفسه، صب 4٪ LMP الاغاروز،أبقى في 37-39 درجة مئوية في حمام مائي، في قالب قشر بعيدا.
  4. خذ الدماغ من HBSS الكامل من جانب ملعقة مغرفة صغيرة واستنزاف فائض من HBSS باستخدام المناديل الورقية أو الغرامة، أو Kimwipes.
  5. وضع الدماغ كله برفق في الاغاروز وضبط موقفها مع إبرة رفيعة. الحفاظ على العفن على الجليد حتى الاغاروز هو طدت ومقطوع كتلة (لأقسام الاكليلية بصيلات الشم وتشير متابعة).

4. Vibratome باجتزاء والثقافة شريحة

  1. تقليم الكتل الاغاروز LMP ويوحدهم إلى مرحلة العينة باستخدام 'الغراء عظمى ". بعد الغراء هو نقل الجاف المرحلة العينة إلى علبة عازلة للvibratome وملء مع الثلج الباردة استكمال HBSS حتى يتم مغمورة كتلة في الحل.
    ملاحظة: تعقيم جميع الأسطح أداة والمعدات مع الايثانول 70٪ قبل باجتزاء.
  2. إعداد 250 ميكرون أقسام سميكة vibratome باستخدام شفرة جديدة النحو التالي.
    1. تقليم واي كتلةعشر الإعدادات التالية. تردد - 60 هرتز، سعة - 0.7 ميكرون، والسرعة 16-18 ملم / ثانية. قطع المقاطع التي تحتوي على الأنسجة المطلوب مع الإعدادات أعلاه بسرعة بطيئة (9 ملم / ثانية). بدء باجتزاء من الدماغ المؤخر، وجمع 5-7 المقاطع من المخ.
    2. نقل المقاطع لطبق ثقافة 6 جيدا نظيفة تحتوي على 5 مل من الجليد الباردة استكمال HBSS بمساعدة ملعقة عازمة والحفاظ على الجليد حتى يتم جمع جميع الأقسام (الشكل 1E).
  3. ترطيب الغشاء بطريقة الصليب مع 100 ميكرولتر من HBSS كاملة قبل وضع المقاطع على الغشاء، لتسهيل التوجه للأقسام.
  4. نقل أقسام باستخدام ملعقة عازمة على الغشاء (التقاط زاوية من القسم مع ملقط وسحب على ملعقة وثم استخدام ملقط لدفع القسم على الغشاء). وضع ما يصل إلى خمسة أقسام على غشاء واحد وترتيب باستخدام ملقط (الشكل 1F). لا تتداخل الأقسام مع بعضها البعض.
    1. تأخذ الفائض من HBSS قبالة غشاء باستخدام ماصة. وترد الأغشية المحددة المستخدمة هنا إلى إطار وإدراجها في لوحة زراعة الأنسجة، والتي تسمح الأنسجة لتكون على اتصال ولكن لا تغطيها المتوسط.
  5. ضع إدراج الغشاء إلى لوحة 6 جيدا تحتوي على 1.8 مل من ثقافة شريحة المتوسطة (1.2.5) (الشكل 1G، H). احتضان الطبق الثقافة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 11 أو 14 DIV DIV. تغيير نصف المتوسط ​​(0.9 مل) كل يوم الثاني.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، إضافة الكواشف مثل Bromodeoxyuridine (BrdU، و 10 ميكرومتر تركيز النهائي) لوصفها تكاثر الخلايا إلى وسائل الإعلام للساعة 20 الأولى من الوقت الثقافة.

5. التثبيت من أقسام تلاه سهم المناعي تلطيخ

  1. استخدام شفرة مشرط نظيفة وحادة لقطع وتقليم الأغشية اعتمادا على التوجه للالأقسام.
  2. نقل أقسام جنبا إلى جنب مع غشاء لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل من 4٪ PFA (1.2.7). احتضان أقسام لمدة 1 ساعة على RT تليها 3 يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لكل منهما. احتضان أقسام O / N مع حل permeabilization في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
  3. في اليوم التالي، واحتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة، مخففة في حل permeabilization، O / N أو لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف.
  4. غسل أقسام 3 مرات لمدة 15 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة مخففة في حل permeabilization.
  5. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية، وغسل أقسام مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة تليها دابي تلطيخ لمدة 10 دقيقة.
  6. غسل أقسام 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لكل منهما ونقل إلى شرائح المجهر. إضافة ImmunoMount ووضع بلطف ساترة على أعلى من أقسام. تجفيف الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية وحد ذاتهاآل بطلاء الأظافر.
    ملاحظة: الحفاظ على الشرائح دائما في 4 درجات مئوية.
    1. تحليل الثقافات شريحة بواسطة المجهر متحد البؤر (الشكل 1I).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الاجتثاث من عامل النسخ Bcl11b يتسبب في انخفاض قيمة تكاثر الخلايا الاصلية وتمايز الخلايا العصبية مما أدى إلى انخفاض حجم التلفيف المسنن وعدد الخلايا. وعلاوة على ذلك تفشل الخلايا العصبية متحولة إلى الاندماج في الدوائر قرن آمون مما تسبب في التعلم والذاكرة ضعف 8. للإجابة على الأسئلة بشأن الآلية التنظيمية (ق) من Bcl11b في هذه العمليات كان يعمل Electroporation للالرحم السابقين.

معالجة مسألة ما إذا كا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الحصين له وظيفة هامة في التعلم والذاكرة. التلفيف المسنن هي أيضا واحدة من منطقتين في الدماغ حيث يحدث تكوين الخلايا العصبية، ليس فقط خلال تطوير ولكن أيضا في جميع أنحاء مرحلة البلوغ. بعد الولادة والكبار عائدات تكوين الخلايا العصبية قرن آمون بطريقة مماثلة تنطوي على العديد من العوامل المشتركة. وتحديد الآليات التنظيمية لهذه العوامل أن تكون مفيدة جدا في فهم الأمراض الاعصاب والتي بدورها سوف تؤدي إلى علاجات جديدة واتخاذ تدابير وقائية. الحصول على هذه المعلومات احدة يتطلب نظاما لمعالجة الخلا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح من Deutsche Forschungsgemeinschaft إلى SB (BR-2215; SFB 497 / A9).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

شركة أدوات العلوم الدقيقة بون
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أدوات اللحام / البني Micropipette PullerSutter Instruments (الولايات المتحدة الأمريكية)P-97
ماصات الزجاج الناعمWarner InstrumentsG100F-4
MicrogrinderNarishige ، اليابانEG-44
وحدة قوس التخديرHarvard ApparatusPY2 34-0412
Halovet VaporizerHarvard ApparatusPY2 34-0398
نظام فلوفاكجهاز هارفاردPY2 34-0387
IMS Fluosorberهارفارد جهازPY2 34-0415
غرفة التخديرجهاز هارفاردPY2 34-0460
المثقف الكهربائيBEX CompanyCUY21 EDIT
ملاقط مع أقطاب قرصيةشركةBEX LF650P3أقطاب كهربائية 3 مم ل E15.5
ملاقط مع أقطاب قرصيةشركة BEXLF650P5أقطاب كهربائية 5 مم ل E18.5
Picospritzer IIIParker Hannifin CorporationP / N 052-0500-900
HM 650 V هزي بليد ميكروتوم ، 230 فولتحراري علمي920120
مجهرتشريح كارل زايس مجهر GmbhStemi SV8
مجهر مقلوبLeicaLeica DM IL LED
مجهر متحد البؤرLeicaSp5II
6 طبق جيدBD Falcon# 353502
6 أطباق جيداCELLTAR# 657160
إدراج ثقافة الأنسجةBD Falcon# 353090
Fast GreenSigmaF7252
LamininSigma#L2020
Poly-L-lysineSigma#P5899
مقص الربيعأدوات العلومالدقيقة 15003-08
مقص14084-08
ملقطدومون # 5511255-20 Inox
HBSS 10xLife Technology14180-046
BMELife Technology41010-26

المراجع

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
  2. Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
  3. Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
  4. Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
  5. Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
  6. Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
  7. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  8. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
  9. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  10. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
  11. Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19(2002).
  13. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
  14. Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
  15. Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
  16. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

استهداف التلفيف المسننالمجهر البؤريالتلوين المناعي الفلوريالتقطيع باستخدام المقطاع الاهتزازيالتضمين في الآغاروزوسط استزراع الشرائحالأجسام المضادة الأولية
السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.