نصف بروتوكولا يسمح بموجبه بتكييف بوسولفان باستبدال نخاع عظم الفأر المتلقي بخلايا نخاع العظم من الفئران المانحة التي تعبر في كل مكان عن بروتين الفلورسنت الأخضر ، في حالة عدم وجود إشعاع. هذه التقنية مفيدة لدراسة تراكم خلايا نخاع العظم في الجهاز العصبي المركزي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بوسلفان باعتباره وكيل كابت النقي لتوليد مستقرة الرفيع المستوى نخاع العظم الخيمرية في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
غالبا ما تستخدم زراعة نخاع العظم < p class = 'jove_content'> لاستبدال حجرة نخاع العظم (BM) للفئران المتلقية بخلايا BM تعبر عن علامة حيوية مميزة معزولة من الفئران المتبرعة. تسمح هذه التقنية بتحديد الخلايا المكونة للدم المشتقة من المتبرع داخل الفئران المتلقية ، ويمكن استخدامها لعزل وتوصيف الخلايا المانحة باستخدام تقنيات كيميائية حيوية مختلفة. يعتمد زراعة النخاع العظمي عادة على التكييف النقوي مع تشعيع الجسم بالكامل لتوليد مساحة متخصصة داخل حجرة BM للفئران المتلقية لنقش الخلايا المانحة. يستخدم البروتوكول الذي نصفه هنا التكييف المثبط للنخاع مع عامل العلاج الكيميائي busulfan. على عكس التشعيع ، الذي يتطلب استخدام مرافق متخصصة ، يتم إجراء تكييف بوسولفان باستخدام الحقن داخل الصفاق بمقدار 20 مجم / كجم بوسولفان حتى يتم إعطاء جرعة إجمالية من 60-100 مجم / كغ. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون للتشعيع النقوي الاستئصالي آثار جانبية سامة ويتطلب تطعيم ناجح للخلايا المانحة لبقاء الفئران المتلقية. في المقابل ، فإن تكييف بوسولفان باستخدام هذه الجرعات جيد التحمل بشكل عام وتعيش الفئران دون دعم الخلايا المانحة. يتم عزل خلايا BM المانحة من عظم الفخذ والساق للفئران التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في كل مكان ، ويتم حقنها في وريد الذيل الجانبي للفئران المتلقية المكيفة. يتم تقدير خيميرية BM عن طريق تحديد عدد خلايا GFP + داخل الدم المحيطي بعد زراعة النخاع العظمي. عادة ما يتم ملاحظة مستويات الخيميرية >80٪ في الدم المحيطي بعد 3-4 أسابيع من الزرع وتظل ثابتة لمدة عام واحد على الأقل. كما هو الحال مع التشعيع ، يسمح التكييف باستخدام بوسولفان ونخاع العظم بتراكم الخلايا المشتقة من BM المتبرع داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، لا سيما في نماذج الفئران من التنكس العصبي. قد يكون تراكم الجهاز العصبي المركزي بوساطة بوسولفان أكثر فسيولوجيا من تشعيع الجسم الكلي ، حيث أن علاج بوسولفان أقل سمية ويبدو أن التهاب الجهاز العصبي المركزي أقل اتساعا. نفترض أن هذه الخلايا يمكن أن تكون معدلة وراثيا لتقديم العلاجات إلى الجهاز العصبي المركزي.
المقدمة
في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام كبير بأدوار الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا المشتقة من نخاع العظام (BMDCs) في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، سواء أثناء المرض أو مع الشيخوخة الطبيعية. من المعروف الآن أن الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي ، تتطور في الجهاز العصبي المركزي بعد دخول أسلاف النخاع البدائية أثناء التطورالجنيني 1. تحتفظ الخلايا الدبقية الصغيرة بجوانب من سلالة الخلايا النخاعية في حياة البالغين. بينما تشير الأدلة إلى أن مساهمة BMDCs في تجمع الخلايا الدبقية الصغيرة ضئيلة في البالغةالسليمة 1 ، فإن الدور الذي تلعبه BMDCs في تطور الأمراض التنكسية العصبية المختلفة لا يزال غير واضح. يتفاقم عدم اليقي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: أخلاقيات الإعلان: تم استعراض هذا البروتوكول وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان من جامعة سايمون فريزر (UACC، تسمح أرقام 1037K-12 و 1060K-03) وهو في الامتثال مع المجلس الكندي للرعاية الحيوان، ودليل المعاهد الوطنية للصحة ل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وتوجيه المجلس EEC.
1. اعتبارات خاصة
ملاحظة: بوسلفان غير السامة للخلايا. التعامل والتصرف وفقا لرقة بيانات سلامة المواد والمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إدارة 60-100 ملغم / كغم من بوسلفان عموما جيد التحمل من قبل الفئران. ومع ذلك، الحيوانات وعادة ما يفقد الوزن خلال مرحلة تكييف (~ 5-10٪)، وبالتالي النظام الغذائي قد تحتاج إلى أن تستكمل مع يعامل مثل بذور عباد الشمس المشع لتشجيع تناول الطعام. يجب أن مستويات الخيمرية من> 80٪ GFP + الخلايا في الدم المحيطي وBM يكون تحقيقه باستمرار باستخدام 60-100 ملغ / كغ بوسلفان 7. مختبرنا وقد استخدمت بنجاح هذا البروتوكول لتوليد أكثر من 100 الفئران خيالية مع> 80٪ GFP + الخلايا في الدم ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تكييف بوسلفان يسمح لتوليد الخيمرية BM رفيع المستوى في الفئران مع الخلايا المكونة للدم ويمكن كشفها بسهولة. هذا تكييف يمكن القيام بها دون الحاجة إلى مرافق التشعيع. وعلاوة على ذلك، كبت نقي العظم مع جرعة من بوسلفان الواردة في هذا البروتوكول هو جيد التحمل، والتقليل من الآثار الجانبية السامة الناجمة عن الجرعات myeloablative التشعيع، وبالتالي قد تكون تقنية أكثر ملاءمة لتوليد BM الخيمرية في الشباب، القديم، أو المريضة الفئران التي هي أكثر عرضة للmyeloablative التشعيع. بعض البروتوكولات RIC .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل زمالة رونالد بيتر جريجز التذكارية في أبحاث التصلب الجانبي الضموري (إلى KP) ومنحة برنامج شراكة البحوث العصبية العضلية من CIHR ، وجمعية ALS الكندية ، وضمور العضلات الكندي (JNM-69682) إلى CK و FMR. كما تم تقديم دعم إضافي من قبل جمعية ALS الأمريكية (57969). نود أن نشكر الدكتور ر. كيث همفريز من مختبر تيري فوكس / قسم علم الأمراض ، وكالة السرطان في كولومبيا البريطانية ، فانكوفر ، كندا والموظفين في وحدة رعاية بجامعة سيمون فريزر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شركة Busulfex | Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. | DIN 02240602 | خفف بوسولفان إلى 3 مجم / مل باستخدام PBS معقم قبل الاستخدام مباشرة. بوسولفان سام للخلايا. التعامل والتخلص وفقا ل MSDS والإرشادات المؤسسية. |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | يمكن استبدال عازلة التحلل الأخرى ولكن قد يلزم تعديل أوقات الحضانة وفقا لذلك |
| تقنيات مصل الجنين | 12483-020 |
المراجع
- Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
