مقالة منهجية

بوسلفان باعتباره وكيل كابت النقي لتوليد مستقرة الرفيع المستوى نخاع العظم الخيمرية في الفئران

13.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52553

⸱

أبريل 1, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University, 2The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 3Division of Neurology, Department of Medicine, Neuromuscular Disease Unit, VHHSC

في هذه المقالة

ملخص

نصف بروتوكولا يسمح بموجبه بتكييف بوسولفان باستبدال نخاع عظم الفأر المتلقي بخلايا نخاع العظم من الفئران المانحة التي تعبر في كل مكان عن بروتين الفلورسنت الأخضر ، في حالة عدم وجود إشعاع. هذه التقنية مفيدة لدراسة تراكم خلايا نخاع العظم في الجهاز العصبي المركزي.

الملخص

غالبا ما تستخدم زراعة نخاع العظم < p class = 'jove_content'> لاستبدال حجرة نخاع العظم (BM) للفئران المتلقية بخلايا BM تعبر عن علامة حيوية مميزة معزولة من الفئران المتبرعة. تسمح هذه التقنية بتحديد الخلايا المكونة للدم المشتقة من المتبرع داخل الفئران المتلقية ، ويمكن استخدامها لعزل وتوصيف الخلايا المانحة باستخدام تقنيات كيميائية حيوية مختلفة. يعتمد زراعة النخاع العظمي عادة على التكييف النقوي مع تشعيع الجسم بالكامل لتوليد مساحة متخصصة داخل حجرة BM للفئران المتلقية لنقش الخلايا المانحة. يستخدم البروتوكول الذي نصفه هنا التكييف المثبط للنخاع مع عامل العلاج الكيميائي busulfan. على عكس التشعيع ، الذي يتطلب استخدام مرافق متخصصة ، يتم إجراء تكييف بوسولفان باستخدام الحقن داخل الصفاق بمقدار 20 مجم / كجم بوسولفان حتى يتم إعطاء جرعة إجمالية من 60-100 مجم / كغ. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون للتشعيع النقوي الاستئصالي آثار جانبية سامة ويتطلب تطعيم ناجح للخلايا المانحة لبقاء الفئران المتلقية. في المقابل ، فإن تكييف بوسولفان باستخدام هذه الجرعات جيد التحمل بشكل عام وتعيش الفئران دون دعم الخلايا المانحة. يتم عزل خلايا BM المانحة من عظم الفخذ والساق للفئران التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في كل مكان ، ويتم حقنها في وريد الذيل الجانبي للفئران المتلقية المكيفة. يتم تقدير خيميرية BM عن طريق تحديد عدد خلايا GFP + داخل الدم المحيطي بعد زراعة النخاع العظمي. عادة ما يتم ملاحظة مستويات الخيميرية >80٪ في الدم المحيطي بعد 3-4 أسابيع من الزرع وتظل ثابتة لمدة عام واحد على الأقل. كما هو الحال مع التشعيع ، يسمح التكييف باستخدام بوسولفان ونخاع العظم بتراكم الخلايا المشتقة من BM المتبرع داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، لا سيما في نماذج الفئران من التنكس العصبي. قد يكون تراكم الجهاز العصبي المركزي بوساطة بوسولفان أكثر فسيولوجيا من تشعيع الجسم الكلي ، حيث أن علاج بوسولفان أقل سمية ويبدو أن التهاب الجهاز العصبي المركزي أقل اتساعا. نفترض أن هذه الخلايا يمكن أن تكون معدلة وراثيا لتقديم العلاجات إلى الجهاز العصبي المركزي.

المقدمة

في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام كبير بأدوار الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا المشتقة من نخاع العظام (BMDCs) في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، سواء أثناء المرض أو مع الشيخوخة الطبيعية. من المعروف الآن أن الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي ، تتطور في الجهاز العصبي المركزي بعد دخول أسلاف النخاع البدائية أثناء التطورالجنيني 1. تحتفظ الخلايا الدبقية الصغيرة بجوانب من سلالة الخلايا النخاعية في حياة البالغين. بينما تشير الأدلة إلى أن مساهمة BMDCs في تجمع الخلايا الدبقية الصغيرة ضئيلة في البالغةالسليمة 1 ، فإن الدور الذي تلعبه BMDCs في تطور الأمراض التنكسية العصبية المختلفة لا يزال غير واضح. يتفاقم عدم اليقين هذا بسبب حقيقة أنه من الصعب التمييز بين BMDCs التي تتراكم داخل الجهاز العصبي المركزي من الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة الداخلية ، حيث لم يتم تحديد علامة كيميائية مناعية تمييزية مقبولة عالميا. من أجل مراقبة BMDCs في الجسم الحي ، نستخدم بروتوكول زرع BM (BMT) حيث يتم استبدال خلايا BM الداخلية للفأر المتلقي بخلايا الفأر المتبرع الذي يعبر في كل مكان عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت سيطرة مروج β الأكتين. يسمح هذا البروتوكول بتحديد كل من توطين ومورفولوجيا GFP + BMDCs داخل الفأر المتلقي باستخدام الكيمياء المناعية ، ويسهل المزيد من التوصيف لهذه الخلايا باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) متبوعا بفحوصات كيميائية حيوية لاحقة.

لنجاح زراعة نخاع العظم ، يجب استئصال خلايا BM المتلقية (تسمى الاستئصال النخاعي) من أجل توليد مساحة متخصصة داخل BM المتلقي للسماح بنقش الخلايا المانحة. في كثير من الأحيان ، يتم تحقيق الاستئصال النقوي باستخدام تشعيع جاما الكلي للجسم الذي يؤدي إلى فواصل خيوط مزدوجة في الحمض النووي يؤدي إلى موت الخلايا ، لا سيما في الخلايا المنقسمة بنشاط مثل الخلايا السلفية المكونة للدم2،3. يتم إجراء بروتوكولات التشعيع للحث على موت كاف لخلايا BM بحيث ينتج عن فتاكة إذا لم يحقق المتلقي تطعيم خلية متبرع كافية من زراعة النخاع العظمي (ما يسمى ب "التشعيع المميت"). ومع ذلك ، يتطلب التشعيع منشأة ومعدات متخصصة ، إلى جانب الموارد البيطرية وتربية غير المتاحة للباحثين في جميع المؤسسات. علاوة على ذلك ، يمكن أن يتسبب التشعيع النقوي الاستئصالي في تلف محتمل للأنسجة الأخرى ، وبسبب التفوق المناعي ، تكون المعرضة للإشعاع أكثر عرضة للعدوى الثانوية3. على هذا النحو ، تم تطوير أنظمة تكييف منخفضة الشدة (ما يسمى ببروتوكولات "RIC") تهدف إلى تقليل الآثار الجانبية السامة المحتملة لبروتوكول التكييف لدى المرضى ، خاصة للاستخدام في المجموعات السكانية المعرضة للخطر مثل الأطفال وكبارالسن 4.

تعتمد بعض بروتوكولات RIC على العلاج الكيميائي مثل busulfan من أجل تكييف حجرة BM. بوسولفان هو عامل مؤلكل للحمض النووي ثنائي الوظيفة غالبا ما يستخدم سريريا كبديل للإشعاع5،6. والجدير بالذكر أنه يمكن إعطاء بوسولفان بأمان للفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) ولا يتطلب المرافق والمعدات المتخصصة اللازمة لإشعاع الفئران. تم استخدام تكييف البوسولفان على نطاق واسع في مختبرنا7 ، وكذلك في العديد من المنشورات الحديثةالأخرى 8-11. عند استخدام جرعات من 60-100 مجم / كجم ، يمكن إنشاء درجات عالية من الوهم المستقر (>80٪ خلايا GFP +) في الدم المحيطي و BM7. الأهم من ذلك ، في هذه الجرعات ، لا يكتمل الاستئصال النقوي ، وبالتالي فإن الفئران قادرة على البقاء على قيد الحياة دون تلقي خلايا BM الداعمة (K. Peake و J. Manning و C. Lewis و C. Krieger ، ملاحظات غير منشورة). علاوة على ذلك ، مع تكييف بوسولفان المثبط للنخاع ، هناك إعادة تشكيل سريعة للخلايا النخاعية أحادية الخلايا في الدم المحيطي بواسطة الخلايا المانحة. ومع ذلك ، فإن استبدال الخلايا الليمفاوية للدم المحيطي بالخلايا المانحة يكون أبطأ ، مما يسلط الضوء على نقص تثبيط المناعة الذي يحدث مع جرعات 60-100 مجم / كجم من بوسولفان مقارنة بإشعاع الجسمالكلي 7.

لقد نجحنا في استخدام الوهم الناجم عن بوسولفان للتحقيق في BMDCs في الفئران البرية ، وكذلك في نماذج الفئران للاضطرابات التنكسية العصبية التصلب الجانبي الضموري (ALS) 7 ومرض الزهايمر. وقد لوحظ أنه في ظل ظروف معينة تتراكم أعداد كبيرة من البلدان النامية الإجمالية + الإجمالية داخل الجهاز العصبيالمركزي 7,12. الأهم من ذلك ، مثل التكييف النقوي مع التشعيع ، فإن تكييف بوسولفان متبوعا بزراعة النخاع العظمي كاف للسماح بتراكم GFP + BMDC داخل الجهاز العصبي المركزي في كل من الفئران البرية والفئران المصابة باضطرابات عصبية 7-11. نظرا لأن العقبة الرئيسية في علاج الاضطرابات التنكسية العصبية هي القدرة على الحصول على الجزيئات العلاجية من الدورة الدموية إلى الجهاز العصبي المركزي حيث يمكنها ممارسة تأثيرات مفيدة ، وهذا يثير احتمال أن يتم تصميم BMDCs للتعبير عن الجزيئات العلاجية ، ثم استخدامها لاحقا كوسيلة لتقديم العلاجات إلى الجهاز العصبي المركزي لمتلقي بوسولفان المكيفين ، آلية نحقق فيها بنشاط. على الرغم من أننا وجدنا أن التكييف النقوي الاستئصالي مع التشعيع يؤدي إلى تراكم أكبر ل GFP + BMDCs في الجهاز العصبي المركزي مقارنة بتكييف بوسولفان7 ، إلا أن التشعيع قد يكون له سمية كبيرة في المرضى الذين يعانون من اضطرابات تنكسية عصبية وفي نماذج الفئران لمرض الجهاز العصبي المركزي.

بينما استخدمنا ، والعديد من الآخرين ، نماذج BMDCs في الاضطرابات التنكسية العصبية ، فإن القدرة على استبدال حجرة BM للفأر المتلقي إلى حد كبير بمجموعة يمكن التعرف عليها بوضوح من خلايا BM هي أداة لا تقدر بثمن لدراسة جوانب مختلفة من نظام تكوين الدم. يتضمن ذلك مجموعة واسعة من الموضوعات البحثية مثل تطور النسب المكونة للدم ، وسرطان الدم ، وزرع الأعضاء ، ومرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف ، وعلم الأحياء المناعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: أخلاقيات الإعلان: تم استعراض هذا البروتوكول وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان من جامعة سايمون فريزر (UACC، تسمح أرقام 1037K-12 و 1060K-03) وهو في الامتثال مع المجلس الكندي للرعاية الحيوان، ودليل المعاهد الوطنية للصحة ل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وتوجيه المجلس EEC.

1. اعتبارات خاصة

ملاحظة: بوسلفان غير السامة للخلايا. التعامل والتصرف وفقا لرقة بيانات سلامة المواد والمبادئ التوجيهية المؤسسية.

  1. أداء جميع تقنيات جو معقم و مطهر في غطاء تدفق الصفحي.
  2. تعقيم الأدوات قبل استخدامها عن طريق لف في مواد التغليف المناسبة، مثل حزمة قشر، والتعقيم.
  3. في حين أن خطر للإصابة أقل مع تكييف بوسلفان مقارنة للأشعة، والتعامل مع الحيوانات فقط في غطاء تدفق الصفحي ل 2 أسابيع الأولى بعد الزرع.

2. تكييف منالفئران المتلقي

  1. تمييع بوسلفان إلى 3 ملغ / مل بمحلول ملحي معقم الفوسفات مخزنة (PBS).
    ملاحظة: من المهم لجعل التخفيف جديدة من بوسلفان فقط قبل استخدامها كل يوم من الحقن.
  2. إدارة 20 ملغم / كغم من بوسلفان المخفف على الفئران المتلقي عن طريق الحقن IP يوميا.
  3. تكرار الحقن IP اليومية من 20 ملغ / كغ بوسلفان حتى جرعة من مجموع 60-100 ملغ / كغ تم تسليمها (أي ل/ الجرعة الإجمالية كغ 80 ملغ، إدارة 20 ملغم / كغم من بوسلفان لمدة 4 أيام متتالية).

3. عزل المانحة خلايا نخاع العظم

ملاحظة: وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لعزل وإعداد الخلايا BM من ما يصل الى 5 الفئران المانحة. عادة العائد خلية في الماوس ما يقرب من 30 حتي 40000000 BMDCs، وهو ما يكفي لزرع 12-16 الفئران المتلقي. إذا كانت هناك حاجة مزيد من الفئران المانحة قد تحتاج إلى تعديل البروتوكول وفقا لذلك.

  1. التالية في اليوم الأخير من تكييف بوسلفان euthanize ماوس GFP المانحة (واحد إلى ستة أشهر من العمر) باستخدام CO 2 (أو عن طريق إجراء القتل الرحيم أخرى مقبولة في مؤسسة). لتجنب المضاعفات الكسب غير المشروع تستخدم الجهات المانحة مسانج التي هي نفس الجنس كما المتلقين.
  2. رذاذ الفأر مع الايثانول 70٪. الجلد في رفع مقص جراحي البطن واستخدام إجراء شق طريق الجلد من تجويف البطن فوق الساق نحو الكاحل. عقد القدم، وسحب بحزم الجلد من الكاحل نحو الفخذ تعريض أنسجة الساق.
  3. تقليم بعيدا العضلات والأنسجة الدهنية من عظم الفخذ لفضح مفصل الورك.
  4. في حين سحب بلطف على القدم لتمديد الساق، اضغط على مقص ضد مفصل الورك. مجرد قطع فوق رأس عظم الفخذ مع الحرص على عدم قطع عظم الفخذ نفسها.
  5. للمساعدة في الحفاظ العقم، وعقد المحطة التي كتبها القدم وتنظيف أي نوع من الأنسجة المتبقية من العظام عن طريق فرك سطح العظام مع الأنسجة تعقيمها.
  6. فصل عظم الفخذ والساق من خلال قطع مفصل الركبة ووضع عظم الفخذ في طبق ثقافة تحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة. احتضان على الجليد.
  7. إزالة والتخلص من الشظية عن طريق قطع عند نقطة حيث يربط الساق في الساق. وضع الساق في صحن الثقافة مع عظم الفخذ واحتضان على الجليد.
  8. كرر الخطوات من 3،2-3،7 عن الساق الأخرى، وإذا لزم الأمر، والفئران إضافية من المانحين. بعد إزالة العظام، وتعقيم الأدوات الجراحية مع حبة تعقيم الساخن أو استخدام مجموعة جديدة من أدوات معقمة للخطوات اللاحقة.
  9. لعظام الفخذ، وعقد عظم الفخذ مع ملقط وباستخدام مقص جراحي بعناية "حلاقة" القاصي ينتهي قبالة العظام. إزالة اقل من العظام عند الضرورة لفضح تجويف BM.
  10. حقنة ملء مع 3 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وإرفاق G 23 إبرة. حملت بعناية الإبرة في تجويف BM وتدفق BM في صحن الثقافة العقيمة. ومن المؤكد أن تتخلص من تجويف النخاع مع نقطة الإبرة لضمان إزالة جميع الخلايا المطلوبة. وبعد الاستخراج،تأكد من أن BM الأحمر لم يعد مرئيا ويظهر عظم الآن الأبيض.
  11. كرر الخطوات 3،9-3،10 للعظام الفخذ اللاحقة، وتجميع كل من BM في صحن الثقافة نفسه.
  12. للظنبوب، مع الاستمرار على الساق مع ملقط وبعناية "حلاقة" نهاية حيث كان يعلق على الساق إلى الركبة لفضح تجويف BM. اجراء خفض الثاني على طول العظام حيث ينتهي BM الأحمر مرئية.
  13. حقنة ملء مع 3 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وإرفاق G 25 إبرة. إدراج بلطف الإبرة في تجويف BM (من نهاية جرى ضمه الى الركبة) وتدفق BM في طبق ثقافة تحتوي على BM من عظام الفخذ. كشط جدران التجويف BM مع الإبرة لإزالة جميع الخلايا. وبعد استخراج، تأكد من أن BM الأحمر لم يعد مرئيا ويظهر عظم الآن الأبيض.
  14. كرر الخطوات 3،12-3،13 للظنبوب لاحق، وتجميع كل من BM في صحن الثقافة نفسها.
  15. بلطف يسحن وBM مع 1 مل ماصة لفصل جells.
  16. تمرير تعليق الخلية من خلال 40 ميكرومتر سلة مرشح في العقيمة 50 مل أنبوب الطرد المركزي. شطف الطبق مع PBS للحصول على أي الخلايا المتبقية ونقل ذلك من خلال مرشح في أنبوب الطرد المركزي.
  17. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج في 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل طاف.
  18. اعادة تعليق بيليه في 3 مل من كرات الدم الحمراء عازلة الناشر. احتضان على الجليد لمدة 8.5 دقيقة.
  19. إضافة ~ 30 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة لإرواء المخزن المؤقت الناشر.
  20. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج في 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل طاف.
  21. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. الحفاظ على الجليد.
  22. اتخاذ قسامة صغيرة من جناسة الخلية وتمييع مع PBS (1: 100 ل1 الماوس؛ 1: 200 لمدة 2 الفئران، الخ) لتحديد عدد الخلايا باستخدام haemocytometer.
  23. تمييع تعليق خلية إلى 8 × 10 6 خلية / مل واحتضان على الجليد حتى الحقن.

4. زرع النخاع

  1. فايليرة لبنانية حقنة 0.5 مل (مع وجود الأنسولين إبرة 28 G) مع 300 ميكرولتر من تعليق خلية المخفف لكل الماوس ليتم حقنه. تأكد من إزالة أي فقاعات الهواء الموجودة في الحقنة.
  2. ضع الماوس قفص يحتوي على الفئران المتلقي مكيفة على وسادة التدفئة والسماح للأوردة الذيل لتمدد.
  3. خذ الماوس المتلقي ومكان في الجهاز الزجرية. مسح الذيل مع الشاش الجراحي غارقة مع الايثانول 70٪.
  4. اعتقادا راسخا الذيل ومع شطبة تصل، إدراج بلطف الإبرة في واحدة من أوردة الذيل الأفقي وحقن تعليق خلية.
  5. عقد الشاش الجراحي على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف قبل إدخال الماوس في قفص نظيفة الجديد.

5. تقدير مدى BM الخيمرية

ملاحظة: مستويات الخيمرية متغيرة عادة في الدم المحيطي في 1 أسبوع بعد BMT، وكما وقدرت هذه المستويات الخيمرية عادة 2 أسابيع على الأقل بعد BMT. مستويات شيمerism ينبغي أن تصل> 80٪ GFP + الخلايا في الدم المحيطي في غضون 3-4 أسابيع بعد BMT.

  1. إعداد FACS العازلة (2 ملي EDTA + 2٪ مصل بقري جنيني في PBS).
    ويمكن تخزين عازلة FACS في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع: ملاحظة.
  2. ضع الماوس في أنبوب الزجرية ويحلق الفراء على الساق الخلفي لفضح الوريد الصافن الجانبي.
  3. معطف رقيقة الساق مع الفازلين ويخترق الوريد الصافن مع إبرة 25 G.
  4. جمع ما يقرب من 50 ميكرولتر من الدم مع الهيبارين المغلفة الأنابيب الشعرية. إضافة الدم إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة التي تحتوي على 1 مل من العازلة FACS. خلط أنبوب عن طريق انقلاب وتخزينها على الجليد.
  5. عقد الشاش الجراحي على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف قبل أن تعود الماوس إلى القفص.
  6. أجهزة الطرد المركزي لعينات الدم لمدة 5 دقائق في 900 ز س. إزالة وتجاهل طاف.
  7. اعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء عازلة الناشر. احتضان على الجليد لمدة 8.5 دقيقة.
  8. إضافة 1 مل من العازلة FACS لإرواء المخزن المؤقت الناشر.
  9. الطرد المركزي عينات لمدة 5 دقائق في 900 ز س. إزالة وتجاهل طاف.
  10. أداء خطوة تحلل الثانية في 500 ميكرولتر من العازلة كرات الدم الحمراء الناشر. احتضان على الجليد لمدة 8.5 دقيقة.
  11. إضافة 1 مل من العازلة FACS لإرواء المخزن المؤقت الناشر.
  12. الطرد المركزي عينات لمدة 5 دقائق في 900 ز س. إزالة وتجاهل طاف. تأكد من أن بيليه هو الآن الأبيض.
    ملاحظة: إذا كان بيليه لا يزال يظهر أحمر، قد تكون هناك حاجة إلى خطوة إضافية تحلل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  13. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من العازلة FACS. الطرد المركزي عينات لمدة 5 دقائق في 900 ز س. إزالة وتجاهل طاف.
  14. اعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولتر من العازلة FACS وقياس GFP + الخلايا باستخدام التدفق الخلوي (ملاحظة: عند هذه النقطة أي المناعية المطلوب من الخلايا لا يمكن أن يؤديها، وذلك باستخدام التقنيات القياسية، وذلك قبل أن تتدفق تحليل cytometric).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إدارة 60-100 ملغم / كغم من بوسلفان عموما جيد التحمل من قبل الفئران. ومع ذلك، الحيوانات وعادة ما يفقد الوزن خلال مرحلة تكييف (~ 5-10٪)، وبالتالي النظام الغذائي قد تحتاج إلى أن تستكمل مع يعامل مثل بذور عباد الشمس المشع لتشجيع تناول الطعام. يجب أن مستويات الخيمرية من> 80٪ GFP + الخلايا في الدم المحيطي وBM يكون تحقيقه باستمرار باستخدام 60-100 ملغ / كغ بوسلفان 7. مختبرنا وقد استخدمت بنجاح هذا البروتوكول لتوليد أكثر من 100 الفئران خيالية مع> 80٪ GFP + الخلايا في الدم ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تكييف بوسلفان يسمح لتوليد الخيمرية BM رفيع المستوى في الفئران مع الخلايا المكونة للدم ويمكن كشفها بسهولة. هذا تكييف يمكن القيام بها دون الحاجة إلى مرافق التشعيع. وعلاوة على ذلك، كبت نقي العظم مع جرعة من بوسلفان الواردة في هذا البروتوكول هو جيد التحمل، والتقليل من الآثار الجانبية السامة الناجمة عن الجرعات myeloablative التشعيع، وبالتالي قد تكون تقنية أكثر ملاءمة لتوليد BM الخيمرية في الشباب، القديم، أو المريضة الفئران التي هي أكثر عرضة للmyeloablative التشعيع. بعض البروتوكولات RIC ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل زمالة رونالد بيتر جريجز التذكارية في أبحاث التصلب الجانبي الضموري (إلى KP) ومنحة برنامج شراكة البحوث العصبية العضلية من CIHR ، وجمعية ALS الكندية ، وضمور العضلات الكندي (JNM-69682) إلى CK و FMR. كما تم تقديم دعم إضافي من قبل جمعية ALS الأمريكية (57969). نود أن نشكر الدكتور ر. كيث همفريز من مختبر تيري فوكس / قسم علم الأمراض ، وكالة السرطان في كولومبيا البريطانية ، فانكوفر ، كندا والموظفين في وحدة رعاية بجامعة سيمون فريزر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شركة BusulfexOtsuka Canada Pharmaceutical Inc.DIN 02240602خفف بوسولفان إلى 3 مجم / مل باستخدام PBS معقم قبل الاستخدام مباشرة. بوسولفان سام للخلايا. التعامل والتخلص وفقا ل MSDS والإرشادات المؤسسية.
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01يمكن استبدال عازلة التحلل الأخرى ولكن قد يلزم تعديل أوقات الحضانة وفقا لذلك
تقنيات مصل الجنين12483-020
البقري

المراجع

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239 (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48 (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21 (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2 (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9 (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8 (4), e60661(2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21 (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. , 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8 (3), e58544(2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77 (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32 (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8 (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4 (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30 (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55 (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة