مقالة منهجية

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

DOI:

10.3791/52576

⸱

فبراير 26, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Würzburg, 2Translational Center Würzburg, Regenerative Therapies in Oncology and Musculoskelettal Disease, Würzburg Branch of the Fraunhofer-Institute Interfacial Engineering and Biotechnology, IGB

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو بناء مكافئ للبشرة ثلاثية الأبعاد بسماكة كاملة، والتي تشبه البشرة الطبيعية. باستخدام جهاز الجرح الآلي المصمم خصيصا ، يمكن إنشاء جروح دقيقة وقابلة للتكرار تحت الحفاظ على العقم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد النماذج المختبرية بديلا فعالا من حيث التكلفة وأخلاقيا لدراسة عمليات التئام الجروح الجلدية. علاوة على ذلك ، باستخدام الخلايا البشرية ، تعكس هذه النماذج حالة الجرح البشري بشكل أفضل من النماذج الحيوانية. على الرغم من أن النماذج ثنائية الأبعاد تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في عمليات مثل الهجرة الخلوية والانتشار ، إلا أن النماذج الأكثر تعقيدا مطلوبة لاكتساب معرفة أعمق حول التئام الجروح. إلى جانب نظام النموذج المناسب ، يعد إنشاء جروح دقيقة وقابلة للتكرار أمرا بالغ الأهمية لضمان نتائج قابلة للمقارنة بين عمليات الاختبار المختلفة. في هذه الدراسة ، يظهر توليد جلد ثلاثي الأبعاد كامل السماكة يعادل دراسة التئام الجروح. يتكون الجزء الجلدي من النماذج من الخلايا الليفية الجلدية البشرية المضمنة في هيدروجيل الكولاجين من النوع الأول من ذيل الفئران. بعد التلقيح بالخلايا الكيراتينية للبشرة البشرية وما يترتب على ذلك من زراعة في واجهة الهواء السائل ، يتم تشكيل بشرة متعددة الطبقات أعلى النماذج. لدراسة عملية التئام الجروح ، قمنا أيضا بتطوير جهاز جرح آلي ، والذي يولد جروحا موحدة في جو معقم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلد هو أكبر عضو في الجسم. فإنه يخلق حاجزا بين البيئة الخارجية والأعضاء الداخلية. وعلاوة على ذلك، والجلد يحمي الجسم من فقدان السوائل، والتأثيرات البيئية والإصابات والالتهابات ويساعد على تنظيم درجة حرارة الجسم 1. نظرا لموقعها المكشوفة، وغالبا ما يتأثر الجلد عن طريق الصدمات الميكانيكية والحرارية أو الكيميائية. على الرغم من أن الجلد قادر عموما من إصلاح الذات، ويمكن لعوامل محلية متعددة مثل العدوى، والأوكسجين، والاكتفاء الوريدي يؤدي إلى ضعف التئام الجروح. ويمكن أيضا التئام الجروح أن تدخلت عوامل جهازية مثل السمنة، وإدمان الكحول، والتدخين، والأدوية، والتغذية، والأمراض مثل مرض السكري. 2

ويمكن تقسيم عملية التئام الجروح إلى 3 مراحل: (ط) المرحلة التهابات، (ب) والتكاثري و(ج) مرحلة التجديد. على إصابة الجلد، وتبدأ عملية معقدة إشارة الشلال، مما أدى إلى إغلاق الجرح. 3بعد الإصابة، الجرح ينزف ويتم تشكيل لتجلط الدم. الليفية تتحرك في تجلط الدم واستبدالها الأنسجة الجديدة التي تم تشكيلها في وقت لاحق على مدى سنوات.

الفهم الحالي للإصلاح الجلدي العمليات البيولوجية الكامنة محدودة. وقد استخدمت النماذج الحيوانية والخنازير الصغيرة لدراسة التئام الجروح. ومع ذلك، فإن هذه النتائج لا يمكن نقلها مباشرة إلى البشر يرجع إلى الاختلافات بين الأنواع محددة. وبالإضافة إلى هذه النماذج في الجسم الحي، وبعض جوانب التئام الجروح يمكن دراستها من خلال محاكاة الوضع الجرح عن طريق الخدش في المختبر الثقافات أحادي الطبقة على أساس خطوط الخلايا خلد أو الخلايا الأولية. 4 وهذه النماذج الخدش موحدة للغاية ولكن لا يعكس بما فيه الكفاية تعقيدا في الجسم الحي علم وظائف الأعضاء. 5 وإلى جانب النماذج ثنائية الأبعاد، وقد وضعت ثلاثية الأبعاد في حكمه الجلد البشري للأبحاث الأمراض الجلدية. الجزء الجلدي من هذه النماذج وجنرال الكتريكnerated باستخدام مختلف السقالات بما في ذلك الأدمة decellularized، 6 الهلاميات المائية الكولاجين، 7،8 الجليكوزامينوجليكان 9 أو المواد الاصطناعية. 10 توظيف هذه حكمه الجلد، ودور طلائي الوسيطة التفاعلات 11، وإعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري، والحديث المتبادل الخلوي بين الخلايا الليفية والخلايا الكيراتينية و تأثير عوامل النمو المختلفة يمكن دراستها. وعلاوة على ذلك، وهذه النماذج هي مفيدة لاكتساب معارف جديدة حول كيفية تهاجر الخلايا الليفية إلى منطقة الجرحى وكيف تؤثر عوامل الانجذاب الكيميائي تجديد الأنسجة. 12

ليس فقط جيل من التئام الجروح النموذج نفسه هو أمر صعب، ولكن أيضا لإنشاء الجرح موحد للغاية في النموذج هو إشكالية. التقنيات الشائعة لخلق الجروح هي اختبارات الصفر، 13 والحروق، 14 الشريط التآكل، و15 إصابة الحرارية، 16 بثور شفط والنيتروجين السائل 17، 18 أشعة الليزر، و19 المشارط، 18 meshers 6 و اللكمات الخزعة. 20 ومعظم هذه الطرق لها نفس المزالق. إصابات تنفيذها يدويا من الصعب توحيد وإعادة إنتاج بين اختبارات متعددة. حجم وشكل وعمق الجرح تختلف بين الدراسات، وبالتالي يؤثر سلبا على نوعية البيانات البحثية. استخدام الليزر لتعريف جرح الجلد يمكن موحدة بسهولة نسبيا ولكن يؤدي إلى حالة محاكاة حروق. الحرارة التي تطبقها ليزر يمكن أن يسبب البروتين تمسخ، الصفائح الدموية أو تجميع السفن انقباض، والتي يمكن أن تؤدي إلى الأنسجة الميتة.

في نهج بديل، قمنا بتطوير جهاز جرح الآلي (AWD)، والذي يسمح لنا لتوليد الجروح الجلدية محددة ودقيقة تحت ظروف معقمة. المعلمات إصابة، مثل عمق وسرعة الاختراق وكذلك الثورات من رأس الحفر يمكن تنظيمها. في هذه الدراسة، ونحن الجمع بين AWD مع في منزل وضعت سمك الكامل في حكمه الجلد (قدمSE) التي هي مماثلة لبروتوكول نشرتها Gangatirkar وآخرون. 8 طبقة الجلد ما يعادل الجلد يتكون من الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (اتش دي اف)، والتي هي جزء لا يتجزأ في الكولاجين I هيدروجيل. على طبقة الجلد، الكيراتينية البشرة الإنسان (كلوة) هي المصنفة. في غضون أسبوعين في واجهة الهواء السائل وكلوة بناء على البشرة يتألف من عدة طبقات الخلايا الحيوية والطبقة القرنية. إلى جانب جيل من هذا النموذج، وتظهر هذه الدراسة استخدام AWD لخلق جروح محددة ودقيقة في مؤشر فاينانشال تايمز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تصميم بروتوكول لإنتاج 24 كامل سماكة الجلد في حكمه. الخلايا الليفية الجلد والخلايا الكيراتينية البشرة الإنسان تم عزل من خزعات الجلد وفقا لبروتوكول نشرت سابقا. تم الحصول على موافقة 21،22 مطلعة مسبقا وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاق المؤسسية على البحوث الإنسان من يوليوس ماكسيميليان جامعة فورتسبورغ (التصويت 182 / 10).

1. إنتاج الجلدية مكون

  1. حل الكولاجين مع حمض الخليك بنسبة 0.1٪ إلى التركيز النهائي من 6 ملغ / مل. من أجل حل تحييد هلام، ومزيج 232.5 مل 2X DMEM، 7.5 مل مصل العجل الجنين، 7.5 مل 3 M HEPES، 2.5 مل كبريتات شوندروتن (5 ملغ / مل). تبقي جل حل تحييد وحل الكولاجين على الجليد. حساب 500 ميكرولتر من هلام في يعادل إدراج / الجلد.
    ملاحظة: كما سوف تكون مختلطة الحل هلام تحييد مع جزأين من حل الكولاجين prepaإعادة مبلغ مزدوج من الكولاجين.
  2. وضع 24 إدراج الى 24 لوحة جيدا.
  3. و resuspend الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (اتش دي اف) في 10 مل DMEM، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 270 x ج وعدد الخلايا. استخراج المبلغ اللازم من HDF (5 × 10 4 خلايا لكل 500 ميكرولتر الكولاجين هلام) وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 270 ز س.
  4. إزالة طاف وبعناية resuspend واتش دي اف في 4 مل تبريد هلام حل تحييد دون إنتاج فقاعات الهواء. من هذه الخطوة تأكد للعمل في أسرع وقت ممكن لتجنب ترسيخ السابق لأوانه المواد الهلامية الكولاجين.
  5. Resuspend وحل مع 8 مل من محلول الكولاجين.
  6. خذ الكولاجين خلية خليط مع ماصة متعددة الخطوات وملء بسرعة 500 ميكرولتر من الخليط في كل إدراج. احتضان المواد الهلامية لمدة 20 دقيقة في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) لالهلام المواد الهلامية.
  7. غمر المواد الهلامية في 2 مل Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) لكل بئرواحتضان لمدة 24 ساعة في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).

2. إضافة رايتس والبشرة الخلايا الكيراتينية (كلوة)

  1. إزالة المتوسطة بعد 24 ساعة. حل البروتين البشري فبرونيكتين مع الماء عالى النقاء لتركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل. تغطية كل الجلد ما يعادل 25 ميكرولتر من محلول فبرونيكتين. احتضان المواد الهلامية لمدة 30 دقيقة في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).
  2. في غضون ذلك، resuspend وكلوة في 10 مل KGM-2 ووضع تركيز خلية إلى 1 × 10 6 خلية / مل مع KGM-2 جاهزة + 5٪ FCS. البذور 1 × 10 5 كلوة على كل هلام. احتضان المواد الهلامية لمدة 45 دقيقة في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) للسماح للخلايا الالتزام.
  3. Submerse المواد الهلامية مع KGM-2 جاهزة + 5٪ FCS والثقافة لهم في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2).

3. ثقافة الكاملة حكمه سماكة الجلد (FTSE)

  1. ثقافة مؤشر فاينانشال تايمز لمدة 6-7 أيامفي تنازلي FCS-التركيز (5٪ و 2٪ و 0٪ FCS). تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام مع انخفاض تركيز FCS المقبل. لهذا، وإزالة تماما على المدى المتوسط ​​وإضافة 1.6 مل من المتوسط ​​الطازجة.
  2. في يوم 7، وإزالة المتوسطة تماما.
    ملاحظة: لا تلمس سطح FTSE مع غيض من ماصة أثناء القيام بذلك.
  3. ضع كل إدراجها في 1 بئر من لوحة 6 جيدا مع ملقط معقم. إضافة 1.5 مل النقل الجوي المتوسطة لكل بئر، وضمان عدم الرطب سطح FTSE. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام لمدة 14 يوما إضافية.
    ملاحظة: مستوى ملء المتوسط ​​هو ما يصل الى الغضروف المفصلي للمؤشر فاينانشال تايمز.

4. تحليل النسيجي

  1. تحديد والبارافين التضمين من مؤشر فاينانشال تايمز
    1. إزالة مستنبت، ونقل إدراج في طازجة 24 لوحات جيدة وإصلاح الأنسجة بإضافة 1.6 مل من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر واحتضان الأنسجة لمدة 2 ساعة على RT. الحذر! Paraformaldehyd غير سامة، والتعامل معها تحت غطاء الدخان. نقلمؤشر FTSE إلى كاسيت تضمين الأنسجة. إزالة ما تبقى تثبيتي عن طريق الغسيل بالماء ويذوى الأنسجة باستخدام تركيزات الإيثانول تصاعدي.
    2. تقسيم ما يعادل الجلد عن طريق خفض العمودي في الوسط. ضع قطعتين في قاعدة معدنية العفن مليئة البارافين مع قطع السطوح أسفل. إضافة كاسيت الأنسجة على رأس القالب بمثابة الدعم.
    3. قطع 3-5 ميكرون شرائح وتطفو منهم على 40 ° C حمام الماء لstraitening، جبل الشرائح على الشرائح المجهر مناسبة. شرائح جافة تماما.
  2. الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) والمناعى (IHC) تلطيخ
    1. مكان الشرائح في رف واحتضان لمدة 1 ساعة على 60 درجة مئوية. تأكد من أن البارافين وذاب. وصمة عار ممهى شرائح مع H & E كما لمحة تلطيخ موحد.
    2. لH & E تلطيخ إعداد 4x وcuvettes الزجاج تلطيخ مع زايلول، 3X مع الايثانول 96٪، 2X مع الايثانول 70٪، 1X مع الايثانول 50٪، 4X الماء منزوع الأيونات، 1X الهيماتوكسيلين، 1X حمض الهيدروكلوريك الإلكترونيthanol (13.7 مل 1 M حمض الهيدروكلوريك الإعلان 200 مل 50٪ من الإيثانول)، 1X التبويب المياه، 1X يوزين (1 غرام يوزين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات) و2X 2-بروبانول.
    3. مكان الشرائح 10 دقيقة في زايلول I و 10 دقيقة في زايلول الثاني لdeparaffinize وترطيب الشرائح. تراجع الشرائح 3X في الإيثانول 96٪ I، 3X في الإيثانول 96٪ II، 3X في الإيثانول 70٪ و3X في الايثانول 50٪. تدوير الشرائح في الماء منزوع الأيونات. التفريق صبغ الهيماتوكسيلين، 2X تراجع في حمض الهيدروكلوريك الإيثانول. شطف في الماء منزوع الأيونات. لblueing، ومكان الشرائح 5 دقائق في الماء التبويب. ليوزين تلطيخ مكان الشرائح 1 دقيقة في يوزين ويغسل بعد ذلك في الماء منزوع الأيونات. للجفاف، والشرائح تراجع 2X في الإيثانول 70٪، 2X في الإيثانول 96٪ ووضعها لمدة 5 دقائق في 2-بروبانول الأول، لمدة 5 دقائق في 2-بروبانول II، 5 دقائق في زايلول I و 5 دقائق في زايلول II. بعد H & E تلطيخ، هي ملطخة نوى الخلايا في الزرقاء، والسيتوبلازم والمصفوفة خارج الخلية هي ملطخة باللون الأحمر.
    4. لاسترجاع مستضد، وإزالة البارافين مع الزيلين وترطيب شرائح للتلطيخ. شرائح مكانفي طنجرة البخار وطهي شرائح deparaffinized وممهى لمدة 20 دقيقة في مرحلة ما قبل ساخنة 10 ملي العازلة سيترات (الرقم الهيدروجيني 6).
    5. مكان الشرائح في غسل العازلة (PBS عازلة + 0.5٪ Polysorbat 20) وشرائح دائرة مع السائل الشريحة طارد علامة من ركلة جزاء أو الماس القلم.
    6. وضع الشرائح في غرفة الرطوبة. منع البيروكسيداز الذاتية، وذلك بإضافة 100 ميكرولتر 3٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين على كل شريحة. الحذر! خطرة جدا في حالة الجلد والعين للإتصال به. التعامل مع معدات الحماية الشخصية. غسل الشرائح في غسل العازلة.
    7. تطبيق الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. غسل الشرائح ثلاث مرات مع غسل العازلة. من هنا، يجب أن تبقى العينات في الظلام.
    8. استخدام نظام كشف البيوتين streptavidin للكشف عن معين ملزم مستضد الضد.
    9. مباين نوى مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة. يذوى وجبل الشرائح.
    10. عينات الصورة باستخدام مجهر معكوس.
<ص الطبقة = "jove_title"> 5. إصابة قبل استخدام الجهاز الآلي إصابة (AWD)

  1. إعداد AWD من قبل تطهير منطقة العمل مع 70٪ من الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية. تأكد من أن رؤساء الحفر من الحجم المطلوب (على سبيل المثال، 1 مم) والمرفقة.
  2. ضع حكمه الجلد في مناطق معينة من لوحة الناقل عينة تعقيمها باستخدام ملقط معقم. وضع لوحة الناقل عينة في المقبس تحت الرأس الحفر.
  3. استخدام برنامج حاسوبي لمراقبة لتعيين المعلمات اصابة النحو التالي: تدور سرعة: 15،000 دورة في الدقيقة. الاختراق: 1.5 مم؛ الدفع: 100 هرتز. وتحتاج هذه المعلمات إلى تعريف لكل نوع عينة على حدة. نقل جرح المعلمات إلى AWD.
  4. بدء اصابة الإجراء. إزالة عينة لوحة الناقل من المقبس. جرح نقل FTSE مرة أخرى إلى إدراج تستخدم للثقافة باستخدام ملقط معقم.
  5. المضي قدما ثقافة FTSE الجرحى في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) للتحقيق في التجدد. آلternatively، استخدام نماذج للتحليل النسيجي في أي وقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وHDF معزولة وكلوة تختلف سواء في التشكل والتعبير عن علامات نموذجية. أظهرت HDF نموذجي المغزل شكل التشكل، في حين مورفولوجية كلوة يمكن وصفها من قبل التشكل المرصوفة بالحصى. واتسمت الخلايا عن طريق تلطيخ المناعى (الشكل 1) قبل استخدامها لFTSE. وHDF إيجابية لفيمنتين (الشكل 1A)، وهي علامة للحصول على الخلايا الليفية. كلوة الابتدائية تعبير عن درجة عالية من أوائل البروتين التمايز cytokeratin-14 (الشكل 1B) ولكن ما يقرب من أي أواخر القرنية البرو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الخلايا في المختبر عادة ما يتم توسيع في مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد، في الخلايا التي تلتزم الأسطح البلاستيكية. ومع ذلك، هذه الشروط الثقافة لا تعكس الظروف ثلاثية الأبعاد الفسيولوجية التي تنمو الخلايا في الجسم الحي. في ظل ظروف ثلاثية الأبعاد، يمكن للخلايا تشكل خلية خلية وخلية مصفوفة إرفاق ملفات الطبيعية والهجرة في ثلاثة أبعاد. خصوصا في الجرح الجلدي شفاء تشابه الوضع في الجسم الحي هو محوري لتوليد بيانات ذات مغزى، وهجرة الخلايا وتوليد مصفوفة عناص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون مركز الدراسات الدولي فراونهوفر على التعاون فيما يتعلق ببناء جهاز الجرح الآلي. تم تأسيس المشروع من قبل مشروع Fraunhofer الداخلي "Märkte von Übermorgen" (SkinHeal).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

H& تلطيخ E: < / قوي >

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
التربسين EDTA (1:250) 0.5٪ في DPBSPAAL11-0030.05٪
Dulbecco' s الفوسفات المخزن الملحيسيجماD8537
الكولاجين (6 مجم / مل في 0.1٪ حمض الخليك)يتم إنتاجه في المنزل
بروتين فيبرونيكتين البشري ، البلازما (50 & nbsp ؛ ومايكرو. جم / مل)Life Technologies33016-015
يدرجNunc140627
6 لوحة بئر   ؛Nunc140685
24 لوحة بئرNunc142485
شرائح مجهرR. Langenbrinck03-0070
<قوي>زراعة الخلايا الليفية (500 مل): < / قوي >
DMEM ، تقنيات حياة الجلوكوزالعالي 11965-09289٪ (445 مل) مصل
الأبقار الجنينيBio & amp بيعFCS. ADD.050010٪ (50 مل)
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)لايف تكنولوجيز15140-1221٪ (5 مل)
الكيراتينية نمو متوسط 2Promocell C-2011189٪ (445 مل)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPackPromocell C-39011
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)Life Technologies15140-1221٪ (5 مل)
<قوي>محلول تحييد الجل (250 مل): < / قوي>
Dulbecco' s النسر المعدل المتوسط ، مسحوق عالي الجلوكوز مع L-GlutaminePAAG0001،301093٪ (232.5 مل)
ملح الصوديوم كبريتات شوندروتن من غضروف سمك القرشSigmaC4384-1g1٪ (2.5 مل)
مصل الأبقار الجنينيBio & amp بيعFCS. ADD.05003٪ (7.5 مل)
HEPESSigma H3375-1 كجم3٪ (7.5 مل)
كيراتينوسايت نمو متوسط 2Promocell C-20111
الكيراتينية النمو المتوسطة 2 SupplementPackPromocell C-39011
مصل عجل الجنينBio & بيعFCS. ADD.05005٪ -2٪ (25 مل - 10 مل)   ؛
البنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)لايف تكنولوجيز15140-1221٪ (5 مل)
الكيراتينية نمو متوسط 2
متوسط 2 حزمة مكملPromocell C-39011إضافة المكملات الغذائية فقط: الأنسولين ، الهيدروكورتيزون ، الأدرينالين ، الترانسفيرين ، CaCl 2< / sub>
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) LifeTechnologies15140-1221٪ (5 مل)
CaCl 2< / sub> (300 mM)Sigma & nbsp ؛C7902-500g0.62٪ (3.1 مل)
histology: < / strong>
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRPDCSPD000KIT
Vimentin الأجسام المضادةAbcamab92547
CK14 الأجسام المضادةSigma   ؛HPA023040-100 وميكرو ؛ ل
الأجسام المضادة CK10DakoM7002
Filaggrin الأجسام المضادةAbcamab81468<
ماير حاد ؛ s HaemalaunAppliChemA0884،2500
XylolSigma Aldrich296325-4X2L
الإيثانولسيجما ألدريتش32205-4X2.5L
HClSigma AldrichH1758-500ML
EosinSigma AldrichE4009-5G
2-PropanololSigma AldrichI9516-500ML
تركيب متوسطسيجما ألدريتشM1289-10ML
< td colspan = "4" ><قوي>وسط ثقافة كيراتينوزيتن (500 مل): < / قوي> خلايا < td colspan = "4" ><قوي> نموذج الجلد غاطس متوسط (500 & nbsp ؛ مل): الخلايا < td colspan = "4" ><قوي> نموذج الجلد واجهة هواء سائل متوسطة (500 مل): < / قوي> خلايا كيراتينوسايت نمو td colspan = "4" >

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
  2. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
  3. Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
  4. Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
  5. Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
  6. Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
  7. Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
  8. Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
  9. Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
  10. El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
  11. Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
  12. Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
  13. Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
  14. Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
  15. Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
  16. Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
  17. Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
  18. El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
  19. Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
  20. Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
  21. Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).
  22. Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
  23. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة